豚鼠延髓c-fos基因表达在钩端螺旋体OmpL39免疫应答期的变化
作者：张燕华 沙朝晖 李 峻 吴俊梅
单位：张燕华 华西医科大学基础医学院病理生理学教研室、钩体病研究室(成都610041)；沙朝晖 第一附属医院内科；李 峻 公共卫生学院卫生检验专业；吴俊梅 成都中医药大学
关键词：钩端螺旋体属；免疫法；基因；FOS
摘 要 目的和方法 摘 要 目的和方法：观察钩体外膜疏水蛋白OmpL39的免疫保护作用和对豚鼠中枢c-fos基因表达的影响，分别用OmpL39与钩体死菌苗(WLCV)、生理盐水(NS)对照免疫豚鼠，用强毒017株钩体活菌攻击，处死动物后用新鲜延髓切片观察对比。结果：OmpL39在豚鼠体内能产生高效价的阳性抗体，免疫保护率为100%。OmpL39免疫组豚鼠中枢c-fos基因表达面积比为0.0086%±0.0003%，颗粒计数为463.00±1.34个，较WLCV和NS组显著减少(P<0.05)。结论：OmpL39有较强的免疫保护作用，对豚鼠中枢c-fos基因的表达有抑制作用。
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Changes of the expression of the c-fos of the bulb of quinea pigs
in the immune response of OmpL39 from leptospira
ZHANG Yan-Hua, SHA Zhao-Hui, LI Jun, WU Jun-Mei
Department of Pathophysiology of West China University of Medical Sciences, Chengdu(610041)
Abstract AIM and METHODS To study the immunoprotection and the related mechanism of OmpL39 and the effect of idiosyncrasy antigen on the c-fos expression in the bulb of the guinea pigs. We immunized the guinea pigs separately with OmpL39, whole Leptospira cell vaccine(WLCV) and normal saline (NS) and then attacked them with virulent strain 017.RESULTS:OmpL39 could produce high-valence positive antibody (MAT 1:>3200). The immunoprotective rate was 100%. The c-fos gene expression granule area rate was 0.0086%±0.0003%, and the granule count was 4.63±1.34. The c-fos gene expression of the guinea pigs of OmpL39 group was remarkably less than that of the control group (WLCV and NS) (P<0.05).CONCLUSION:OmpL39 could specifically inhibit the expressions the c-fos in the bulb of the guinea pigs. It was more effective in immunoprotection than WLCV.
, 百拇医药
MeSH Leptospira; Immunization; Genes,FOS
我们曾报道，赖型钩体强毒017株外膜疏水蛋白OmpL39是稳定的免疫原[1,2]。参照《中国生物制品规程》钩体疫苗制造及检定规程[3]，用纯化的OmpL39与钩体死菌苗、生理盐水对照免疫豚鼠，研究OmpL39的免疫保护作用，并对OmpL39抗原特异性刺激影响豚鼠延髓c-fos基因的表达进行了观察，以期为OmpL39基因疫苗的研制及免疫保护机制提供实验和理论依据。
材料与方法
一、钩体菌液：
问号状黄疸出血群赖型017株钩体，由卫生部成都生物制品研究所钩体菌苗室提供。
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二、钩体OmpL39的抽提、分离和纯化：
参照Haake等[4]的方法用TritonX-114(TX-114)抽提分离017株钩体疏水OMP，经制备性SDS-PAGE电泳分离纯化相对分子量为39×103疏水外膜蛋白(OmpL39)，-20℃贮存备用。
三、OmpL39免疫保护力检定试验：
(一)实验动物：健康荷兰种一级豚鼠18只，体重120～200g，在实验条件下先驯养1周备用。
(二)免疫力试验：1.动物分组：将18只健康豚鼠，按随机化原则分为3组，分别为OmpL39组(实验组)，钩端螺旋体菌苗(whole leptospira cell vaccine,WLCV)组(阳性对照组)，NS组(阴性对照组)。2.免疫方法：腹股沟内侧及腹壁皮下多点注射，以氢氧化铝为佐剂，聚丙烯酰胺为辅助佐剂。3.免疫时间：分两次免疫。第一次于实验当天开始，第二次于实验开始后第7 d。于第二次免疫后10 d，抽心血做MAT检查。4.攻击：于第二次免疫后15d用强毒017株钩体1×1012条/L×2 mL皮下攻击免疫豚鼠。
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四、免疫力判定标准：
参照卫生部颁发的《中国生物制品规程》第一部检定钩体疫苗规程要求[3]，测定抗体效价，统计豚鼠生存率，内脏出血程度等情况判定免疫力合格与否。
合格：如攻击后10 d实验组3只豚鼠健存，阴性对照组豚鼠至少有2/3的豚鼠患钩体病死亡(患病率>66%)，判为合格，否则为不合格。
五、豚鼠延髓c-fos表达的检测：
参照Bullitt E等的方法[5，6]，经改进进行。活菌攻击后第8 d抽心血处死动物，取新鲜延髓冰冻切片用免疫组织化学ABC法显色。用珞明胶将切片贴于载玻片上，晾干，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
各组随机选一切片于荧光高倍显微镜下照象(1×400)。每片取四角及中心，共5个视场，计算每个视场中c-fos表达颗粒所占面积与此整个视场面积的比，此5个面积比的平均数，即作为该组豚鼠延髓切片的c-fos表达颗粒面积比。c-fos表达颗粒(FLI)(个)计数方法同上。
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六、统计学处理方法：
用单因素方差分析q检验法检验所得数据，数据以均数加减标准差(
±s)表示。
结 果
一、TX-114抽提钩体各分离层的SDS-PAGE电泳图比较：
问号状钩体017株经TX-114处理，分为3个相层，原生质相层、水相层、TX-114纯化相层。原生质蛋白带最多(20余条)，水相层条带也多(10余条)，带区复杂。TX-114层疏水外膜蛋白在66×103～16×103间仅有5条主要蛋白区带，其分子量分别为66×103,39×103,35×103,27×103和16×103。各区带间隔宽，主次带清晰、锐利，便于区别辨认和分离、纯化(见图1)。
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二、纯化赖型017株钩体OmpL39的SDS-PAGE电泳图谱：
用制备电泳分离017钩体疏水外膜蛋白，切下39×103区带，经洗脱回收并SDS-PAGE电泳，可见39×103蛋白清晰带(见图2)。
三、OmpL39免疫力试验结果：
用OmpL39免疫，结果OmpL39可使豚鼠产生高效价阳性抗体(MAT 1：>3200)，OmpL39组6只豚鼠均健存，无黄疸，解剖无肺及皮下出血，判定免疫力合格；死菌苗组6只豚鼠均健存，MAT 1∶>1600，免疫力合格；生理盐水组6只豚鼠均死亡，死亡率为100%，无免疫力。
四、c-fos基因表达颗粒图象：
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在高倍镜下，可见OmpL39免疫组c-fos颗粒极少，颜色浅，多呈浅棕色，在细胞核中较多；死菌苗组颗粒稍多，呈浅棕褐色；细胞质中较多；而阴性对照组c-fos颗粒多、颜色深，呈棕褐色，在细胞中较均匀分布，可清楚分辨细胞形态和轮廓(见图3A～C)。
五、c-fos表达颗粒面积比及神经元计数统计结果：
经测定，OmpL39组c-fos基因表达颗粒面积比为0.0086%±0.0003%，神经元计数为4.63±1.34(个)，与WLCV和NS对照组有明显差异，两者均显著低于WLCV组和NS组(P<0.05)。WLCV组也显著低于NS组(P<0.05)(见表1)。
表1 不同抗原对豚鼠中枢c-fos表达的影响
Tab 1 Effect on the granule area rate and FLI of the c-fos
, 百拇医药
gene expression of the guinea pigs with OmpL39，WLCV，N S(±s，n=6)
Group
c-fos area rate(%)
FL1 count
OmpL39
0.0086±0.0003*
4.63±1.34*
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WLCV
0.0659±0.0022
30.12±5.88
N S
0.1657±0.0145
78.17±8.83
*P<0.05，vs WLCV or NS
Fig 1 SDS-PAGE analysis of hydrophobic、hydrophilic OMP and protoplasmic cylinders from L. interrogans servar lai strain 017
, 百拇医药
1.Protoplasmic cylinders； 4.Aqueos phase；
2.Molecular size standards； 5.No samples；
3.Detergent phase；
图1 017株钩体疏水与亲水外膜蛋白及原生质体的SDS-PAGE电泳图谱
Fig 2 SDS-PAGE analysis of OmpL39
1. Molecular size standards ； 2.OmpL39
图2 纯化OmpL39的SDS-PAGE电泳图谱
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Fig 3A-C Photomicrograph of the c-fos expression of the brain from the guinea pigs for the OmpL39,WLCV and NS groups
A：OmpL39；B：WLCV；C：NS
图3A-C OmpL39组和对照组豚鼠中枢c-fos基因表达颗粒的显微照相×400
讨 论
我们采用TX-114抽提分离强毒017株钩体OMP，获得了具有稳定的免疫源性的39×103疏水OMP(OmpL39)，证实OmpL39是致病性问号状钩体稳定的免疫原，有种特异性[1，2]。本实验结果表明，OmpL39对豚鼠有极明显的免疫保护作用，其免疫保护力与死菌苗免疫力相当。提示，OmpL39是钩体十分重要的免疫保护性抗原，在研制OmpL39单一蛋白基因疫苗中有重要的运用前景。
, 百拇医药
c-fos基因是广泛存在于细胞基因组中的细胞初级反应基因(primary response gene)之一，参与细胞生长，分化，信息传递和能量代谢过程。大量的研究表明，损伤性的刺激，如炎症造成的外周或内脏损伤，可以诱发c-fos基因在中枢的过量表达，使FLI阳性神经元数增多，染色加深，分布区域扩大。神经免疫学研究认为，特异性免疫物可激活c-fos免疫活性，影响其表达数量[7]。本研究用提纯的钩体OmpL39单一蛋白与全钩体死菌苗等对照免疫豚鼠，观察c-fos表达颗粒图像、c-fos表达颗粒计数和颗粒面积。结果，OmpL39免疫的豚鼠，在受到强毒017株钩体攻击时，c-fos基因表达的有关伤害性指标均明显少于死菌苗组和空白对照组。这种保护作用是否与OmpL39单一蛋白基因疫苗保留了免疫的有效成分，而去除了全钩体菌苗中抑制免疫或激发有害刺激的成分有关，值得进一步探讨。
(致谢：承蒙日本福山大学福长将仁教授的指导和成都中医学院骆永珍，黄迪君教授大力支持，特此致于衷心的感谢!)
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助(No.39670304)
参考文献
1 张燕华，舒有君，戴保民.赖型钩端螺旋体外膜疏水外膜蛋白及免疫特性的研究.华西医科大学学报，1997，28：128.
2 张燕华，方鲁延，许玉堂.OmpL39在致病性钩端螺旋体中的表达和免疫特征的研究.华西医学，1997，12：44.
3 中华人民共和国.中国生物制品规程.第1部.北京：卫生部生物制品标准化委员会编辑出版，1990.61.
4 Haake DA, Walker ED, Blanco DR, et al. Change in the surface of Leptospira interrogans servar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun, 1991, 59:1131.
, 百拇医药
5 Menetrey D, Gannon A, Levine J D, et al. Expression of c-fos protein in interneurons and projection neurons of the rat spinal cord on response to noxious somatic, articular and visceral stimulation. J Comp Neurol, 1989, 285:177.
6 Bullitt E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol, 1990, 296:517.
7 Bullitt E，Lee CL, Light AR, et al. The effect of stimulus duration on noxious-stimulus induced c-fos expression in the rodent spinal cord. Brain Res, 1992, 580:172.
收稿日期：1997年9月17日
修稿日期：1998年8月28日, 百拇医药
单位：张燕华 华西医科大学基础医学院病理生理学教研室、钩体病研究室(成都610041)；沙朝晖 第一附属医院内科；李 峻 公共卫生学院卫生检验专业；吴俊梅 成都中医药大学
关键词：钩端螺旋体属；免疫法；基因；FOS
摘 要 目的和方法 摘 要 目的和方法：观察钩体外膜疏水蛋白OmpL39的免疫保护作用和对豚鼠中枢c-fos基因表达的影响，分别用OmpL39与钩体死菌苗(WLCV)、生理盐水(NS)对照免疫豚鼠，用强毒017株钩体活菌攻击，处死动物后用新鲜延髓切片观察对比。结果：OmpL39在豚鼠体内能产生高效价的阳性抗体，免疫保护率为100%。OmpL39免疫组豚鼠中枢c-fos基因表达面积比为0.0086%±0.0003%，颗粒计数为463.00±1.34个，较WLCV和NS组显著减少(P<0.05)。结论：OmpL39有较强的免疫保护作用，对豚鼠中枢c-fos基因的表达有抑制作用。
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Changes of the expression of the c-fos of the bulb of quinea pigs
in the immune response of OmpL39 from leptospira
ZHANG Yan-Hua, SHA Zhao-Hui, LI Jun, WU Jun-Mei
Department of Pathophysiology of West China University of Medical Sciences, Chengdu(610041)
Abstract AIM and METHODS To study the immunoprotection and the related mechanism of OmpL39 and the effect of idiosyncrasy antigen on the c-fos expression in the bulb of the guinea pigs. We immunized the guinea pigs separately with OmpL39, whole Leptospira cell vaccine(WLCV) and normal saline (NS) and then attacked them with virulent strain 017.RESULTS:OmpL39 could produce high-valence positive antibody (MAT 1:>3200). The immunoprotective rate was 100%. The c-fos gene expression granule area rate was 0.0086%±0.0003%, and the granule count was 4.63±1.34. The c-fos gene expression of the guinea pigs of OmpL39 group was remarkably less than that of the control group (WLCV and NS) (P<0.05).CONCLUSION:OmpL39 could specifically inhibit the expressions the c-fos in the bulb of the guinea pigs. It was more effective in immunoprotection than WLCV.
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MeSH Leptospira; Immunization; Genes,FOS
我们曾报道，赖型钩体强毒017株外膜疏水蛋白OmpL39是稳定的免疫原[1,2]。参照《中国生物制品规程》钩体疫苗制造及检定规程[3]，用纯化的OmpL39与钩体死菌苗、生理盐水对照免疫豚鼠，研究OmpL39的免疫保护作用，并对OmpL39抗原特异性刺激影响豚鼠延髓c-fos基因的表达进行了观察，以期为OmpL39基因疫苗的研制及免疫保护机制提供实验和理论依据。
材料与方法
一、钩体菌液：
问号状黄疸出血群赖型017株钩体，由卫生部成都生物制品研究所钩体菌苗室提供。
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二、钩体OmpL39的抽提、分离和纯化：
参照Haake等[4]的方法用TritonX-114(TX-114)抽提分离017株钩体疏水OMP，经制备性SDS-PAGE电泳分离纯化相对分子量为39×103疏水外膜蛋白(OmpL39)，-20℃贮存备用。
三、OmpL39免疫保护力检定试验：
(一)实验动物：健康荷兰种一级豚鼠18只，体重120～200g，在实验条件下先驯养1周备用。
(二)免疫力试验：1.动物分组：将18只健康豚鼠，按随机化原则分为3组，分别为OmpL39组(实验组)，钩端螺旋体菌苗(whole leptospira cell vaccine,WLCV)组(阳性对照组)，NS组(阴性对照组)。2.免疫方法：腹股沟内侧及腹壁皮下多点注射，以氢氧化铝为佐剂，聚丙烯酰胺为辅助佐剂。3.免疫时间：分两次免疫。第一次于实验当天开始，第二次于实验开始后第7 d。于第二次免疫后10 d，抽心血做MAT检查。4.攻击：于第二次免疫后15d用强毒017株钩体1×1012条/L×2 mL皮下攻击免疫豚鼠。
, 百拇医药
四、免疫力判定标准：
参照卫生部颁发的《中国生物制品规程》第一部检定钩体疫苗规程要求[3]，测定抗体效价，统计豚鼠生存率，内脏出血程度等情况判定免疫力合格与否。
合格：如攻击后10 d实验组3只豚鼠健存，阴性对照组豚鼠至少有2/3的豚鼠患钩体病死亡(患病率>66%)，判为合格，否则为不合格。
五、豚鼠延髓c-fos表达的检测：
参照Bullitt E等的方法[5，6]，经改进进行。活菌攻击后第8 d抽心血处死动物，取新鲜延髓冰冻切片用免疫组织化学ABC法显色。用珞明胶将切片贴于载玻片上，晾干，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
各组随机选一切片于荧光高倍显微镜下照象(1×400)。每片取四角及中心，共5个视场，计算每个视场中c-fos表达颗粒所占面积与此整个视场面积的比，此5个面积比的平均数，即作为该组豚鼠延髓切片的c-fos表达颗粒面积比。c-fos表达颗粒(FLI)(个)计数方法同上。
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六、统计学处理方法：
用单因素方差分析q检验法检验所得数据，数据以均数加减标准差(
±s)表示。结 果
一、TX-114抽提钩体各分离层的SDS-PAGE电泳图比较：
问号状钩体017株经TX-114处理，分为3个相层，原生质相层、水相层、TX-114纯化相层。原生质蛋白带最多(20余条)，水相层条带也多(10余条)，带区复杂。TX-114层疏水外膜蛋白在66×103～16×103间仅有5条主要蛋白区带，其分子量分别为66×103,39×103,35×103,27×103和16×103。各区带间隔宽，主次带清晰、锐利，便于区别辨认和分离、纯化(见图1)。
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二、纯化赖型017株钩体OmpL39的SDS-PAGE电泳图谱：
用制备电泳分离017钩体疏水外膜蛋白，切下39×103区带，经洗脱回收并SDS-PAGE电泳，可见39×103蛋白清晰带(见图2)。
三、OmpL39免疫力试验结果：
用OmpL39免疫，结果OmpL39可使豚鼠产生高效价阳性抗体(MAT 1：>3200)，OmpL39组6只豚鼠均健存，无黄疸，解剖无肺及皮下出血，判定免疫力合格；死菌苗组6只豚鼠均健存，MAT 1∶>1600，免疫力合格；生理盐水组6只豚鼠均死亡，死亡率为100%，无免疫力。
四、c-fos基因表达颗粒图象：
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在高倍镜下，可见OmpL39免疫组c-fos颗粒极少，颜色浅，多呈浅棕色，在细胞核中较多；死菌苗组颗粒稍多，呈浅棕褐色；细胞质中较多；而阴性对照组c-fos颗粒多、颜色深，呈棕褐色，在细胞中较均匀分布，可清楚分辨细胞形态和轮廓(见图3A～C)。
五、c-fos表达颗粒面积比及神经元计数统计结果：
经测定，OmpL39组c-fos基因表达颗粒面积比为0.0086%±0.0003%，神经元计数为4.63±1.34(个)，与WLCV和NS对照组有明显差异，两者均显著低于WLCV组和NS组(P<0.05)。WLCV组也显著低于NS组(P<0.05)(见表1)。
表1 不同抗原对豚鼠中枢c-fos表达的影响
Tab 1 Effect on the granule area rate and FLI of the c-fos
, 百拇医药
gene expression of the guinea pigs with OmpL39，WLCV，N S(
±s，n=6)Group
c-fos area rate(%)
FL1 count
OmpL39
0.0086±0.0003*
4.63±1.34*
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WLCV
0.0659±0.0022
30.12±5.88
N S
0.1657±0.0145
78.17±8.83
*P<0.05，vs WLCV or NS
Fig 1 SDS-PAGE analysis of hydrophobic、hydrophilic OMP and protoplasmic cylinders from L. interrogans servar lai strain 017
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1.Protoplasmic cylinders； 4.Aqueos phase；
2.Molecular size standards； 5.No samples；
3.Detergent phase；
图1 017株钩体疏水与亲水外膜蛋白及原生质体的SDS-PAGE电泳图谱
Fig 2 SDS-PAGE analysis of OmpL39
1. Molecular size standards ； 2.OmpL39
图2 纯化OmpL39的SDS-PAGE电泳图谱
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Fig 3A-C Photomicrograph of the c-fos expression of the brain from the guinea pigs for the OmpL39,WLCV and NS groups
A：OmpL39；B：WLCV；C：NS
图3A-C OmpL39组和对照组豚鼠中枢c-fos基因表达颗粒的显微照相×400
讨 论
我们采用TX-114抽提分离强毒017株钩体OMP，获得了具有稳定的免疫源性的39×103疏水OMP(OmpL39)，证实OmpL39是致病性问号状钩体稳定的免疫原，有种特异性[1，2]。本实验结果表明，OmpL39对豚鼠有极明显的免疫保护作用，其免疫保护力与死菌苗免疫力相当。提示，OmpL39是钩体十分重要的免疫保护性抗原，在研制OmpL39单一蛋白基因疫苗中有重要的运用前景。
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c-fos基因是广泛存在于细胞基因组中的细胞初级反应基因(primary response gene)之一，参与细胞生长，分化，信息传递和能量代谢过程。大量的研究表明，损伤性的刺激，如炎症造成的外周或内脏损伤，可以诱发c-fos基因在中枢的过量表达，使FLI阳性神经元数增多，染色加深，分布区域扩大。神经免疫学研究认为，特异性免疫物可激活c-fos免疫活性，影响其表达数量[7]。本研究用提纯的钩体OmpL39单一蛋白与全钩体死菌苗等对照免疫豚鼠，观察c-fos表达颗粒图像、c-fos表达颗粒计数和颗粒面积。结果，OmpL39免疫的豚鼠，在受到强毒017株钩体攻击时，c-fos基因表达的有关伤害性指标均明显少于死菌苗组和空白对照组。这种保护作用是否与OmpL39单一蛋白基因疫苗保留了免疫的有效成分，而去除了全钩体菌苗中抑制免疫或激发有害刺激的成分有关，值得进一步探讨。
(致谢：承蒙日本福山大学福长将仁教授的指导和成都中医学院骆永珍，黄迪君教授大力支持，特此致于衷心的感谢!)
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参考文献
1 张燕华，舒有君，戴保民.赖型钩端螺旋体外膜疏水外膜蛋白及免疫特性的研究.华西医科大学学报，1997，28：128.
2 张燕华，方鲁延，许玉堂.OmpL39在致病性钩端螺旋体中的表达和免疫特征的研究.华西医学，1997，12：44.
3 中华人民共和国.中国生物制品规程.第1部.北京：卫生部生物制品标准化委员会编辑出版，1990.61.
4 Haake DA, Walker ED, Blanco DR, et al. Change in the surface of Leptospira interrogans servar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun, 1991, 59:1131.
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5 Menetrey D, Gannon A, Levine J D, et al. Expression of c-fos protein in interneurons and projection neurons of the rat spinal cord on response to noxious somatic, articular and visceral stimulation. J Comp Neurol, 1989, 285:177.
6 Bullitt E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol, 1990, 296:517.
7 Bullitt E，Lee CL, Light AR, et al. The effect of stimulus duration on noxious-stimulus induced c-fos expression in the rodent spinal cord. Brain Res, 1992, 580:172.
收稿日期：1997年9月17日
修稿日期：1998年8月28日, 百拇医药