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编号:10271391
异丙嗪对家兔EGTA性发热的解热作用及其机制研究
http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 1999年第3期
     作者:王彦平 王华东 陈小琳 陆大祥 李楚杰 颜亮

    单位:暨南大学医学院病理生理教研室(广州510632)

    关键词:依他酸;发热;钙;异丙嗪

    异丙嗪对家兔EGTA性发热的解热作用及其机制研究 摘 要 目的:观察异丙嗪(promethazine,PMZ)对家兔EGTA性发热的影响并探讨其作用机制。方法:侧脑室和静脉给药。用Fura-2荧光分光光度法测定细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)。结果:(1)侧脑室灌注0.6 μmol EGTA引起家兔明显的发热反应,侧脑室灌注0.6 μmol EGTA 20 min 后,静脉注射PMZ(5 mg/kg)明显抑制EGTA引起的结肠温度上升,其3 h发热反应指数明显低于侧脑室灌注0.6 μmol EGTA 20 min后静脉注射生理盐水(NS)组。而侧脑室灌注人工脑脊液(ACSF)20 min后静脉注射PMZ(5 mg/kg)组家兔结肠温度明显低于ACSF+NS对照组。(2)体外实验发现,向下丘脑细胞悬液中加入终浓度为0.74 mmol/L的PMZ,下丘脑细胞[Ca2+]i从(159.2±18.8)nmol/L升高到(533.7±90.1)nmol/L(P<0.05)。 结论:PMZ诱导体温调节中枢神经细胞[Ca2+]i升高可能是PMZ抑制家兔EGTA性发热的中枢机制之一。
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    The antipyretic effect of promethazine on egtazic acid-induced fever in rabbits

    WANG Yan-Ping,WANG Hua-Dong,LU Da-Xiang,CHEN Xiao-Lin,LI Chu-Jie,YAN Liang

    Dept.of Pathophysiology,Jinan University Medical College,Guangzhou(510632)

    Abstract AIM:To investigate the effect of promethazine(PMZ)on egtazic acid-induced fever in rabbits and its mechanism.METHODS:Egtazic acid was administrated intracerebroventricularly,PMZ was given intravenously.Free Ca2+ intracellular concentrations([Ca2+]i)was measured by Fura-2 fluorometry.RESULTS:(1)0.06 μmol egtazic acid intracerebroventricularly infused induced a rise in colonic temperature,when PMZ(5 mg/kg) was administrated intravenously 20 min after the infusion of egtazic acid,it reduced the febrile responses of rabbits to egtazic acid significantly (0.06 μmol) but without complete suppression.PMZ administrated alone caused a marked decrease in colonic temperature.(2)PMZ (0.74 mmol/L) increased [Ca2+]i in hypothalamus cells from(159.2±18.8)nmol/L to(533.7±90.1)nmol/L (P<0.05).CONCLUSION:PMZ possesses antipyretic effect on egtazic acid-induced fever in the rabbit and raises the possibility that the antipyretic actions of PMZ are mediated through the increase of [Ca2+]i incuced by PMZ.
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    MeSH Egtazic acid;Fever;Calcium;Promethazine

    组胺H1受体阻断剂异丙嗪(promethazine,PMZ)是一种常用的抗过敏药物,它具有降低正常体温和抑制家兔内毒素性发热的作用[1,2],但其降温机制尚不清楚。一些学者强调Ca2+浓度是体温调定点的生理学基础,并认为其敏感区位于后下丘脑[3]。我们的研究发现[4],向家兔侧脑室灌注EGTA,降低中枢Ca2+浓度,可引起家兔明显的发热反应。然而,异丙嗪对家兔EGTA性发热有何影响?其降温机制是否与中枢钙代谢有关?迄今未见文献报道。因此,本研究旨在观察PMZ对家兔EGTA性发热反应及家兔下丘脑细胞[Ca2+]i的影响。

    材料与方法
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    一、试验试剂和主要仪器:

    人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)按文献方法配制[4]。EGTA(ethylene glycol bis(2-aminothyl-ether)tetraacetic acid),分析纯,美国Feinbiochemica Heidelberg公司产品,实验时用ACSF配制成4 mmol/L(pH 7.4)。胰蛋白酶、Fura-2/AM(用DMSO溶成1 mmol/L后,置-20 ℃避光保存备用)、Triton X-100、trypan blue、盐酸异丙嗪均为美国Sigma公司产品;DMEM培养基购于美国Gibco公司。其它试剂均为国产分析纯。主要仪器有RF-5000型荧光分光光度计(日本 Shimadzu)、3000型二氧化碳培养箱(美国Sheldon)、HL-2型电子微量恒流泵(上海沪西仪器厂)和WRY-B型微机热原测温仪(上海黄海仪器厂)。

    二、实验动物:
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    健康封闭群新西兰兔20只由本院动物所提供,体重2.0~2.7 kg,雌雄不拘,单笼饲养,自由饮水进食。实验室温度保持在21~23 ℃。实验前,家兔置于特制的兔架上,用模拟测温探头的导管经肛门插入10 cm并固定在尾根部,每天4 h,适应3 d,第4 d开始实验。

    三、体温测定:

    实验时,将测温探头经肛门插入10 cm并固定在尾根部,待体温稳定后,用与测温探头相连的WRY-B型微机热原测温仪测定家兔结肠温度3次(每10 min 1次),取均数作为基础体温,侧脑室灌注后每10 min测定家兔结肠温度1次,连续观察3 h。

    四、侧脑室插管:

    参照文献所描述的方法[4,5],在兔头颅骨APO L4~5,APO R4~5处钻孔,将外径为1 mm的塑料导管插入H5水平,用牙科粘固粉将塑料导管固定在颅骨上,并加热封闭塑料导管的上端,缝合切口,术后肌注青霉素(2万U/kg)3 d。第6 d挑选健康的家兔在清醒的情况下进行侧脑室灌注实验。
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    五、下丘脑细胞[Ca2+]i测定:

    (一)下丘脑细胞悬液制备及Frua-2/AM负载:参照文献所述的方法[4,6],迅速断头处死家兔,取下丘脑组织置冰冷的Hepes缓冲的Hanks液((mmol/L:Hepes 20,NaCl 137,KCl 5.0,KH2PO4 0.4,Na2HPO4 0.6,NaHCO3 3.0,CaCl2 1.3,MgSO4 0.4,MgCl2 0.5 ,glucose 5.6;pH7.4)中除去血管和残留血液,转入含0.5 mL冰冷Hepes缓冲的Hanks液的烧杯中剪碎后再移入试管,加适量0.125%的胰酶,置37℃培养箱中20 min。用0.5 mL冰冷的DMEM培养基(含10%小牛血清)终止消化,经200目过筛后1500 r/min 离心5 min,去上清液,沉淀用DMEM培养基悬浮。取少量的细胞悬液用台盼蓝(trypan blue)拒染实验检测细胞存活率在95%以上,调整细胞密度为1×109个/L。在上述细胞悬液中加入Fura-2/AM(终浓度为5 μmol/L)后,将细胞悬液置于5%CO2培养箱中,在37 ℃恒温下孵育50 min。负载后的细胞用Hepes缓冲的Hanks液洗3次。用2.5 mL Hepes缓冲的Hanks 液悬浮细胞备用。
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    (二)荧光测定[6]:采用RF-5000型荧光分光光度计,其激发光栅为5 nm,发射光栅为10 nm。首先扫描测定Fura-2/AM标准液、负载液及Fura-2/AM与细胞悬液温育后的细胞悬液的荧光光谱。Fura-2/AM进入细胞水解成Fura-2后与Ca2+结合,其激发波长从380 nm移至340 nm左右,发射波长仍为500 nm。达到上述要求后,观察不同实验条件下荧光强度的变化,用计算机按下式计算[Ca2+]i:[Ca2+]i=k(d)×[(F-Fmin)/(Fmax-F)]。其中,k(d)为Fura-2与Ca2+反应的解离常数(224 nmol/L);F为不同实验条件下的荧光值,Fmin为最小荧光值;Fmax为最大荧光值。实验时,先测定静息状态下和加入各种影响因素后的F值,然后加入浓度为0.1% Triton X-100 测定Fmax,加入终浓度为4 mmol/L EGTA测定Fmin。并在计算前对细胞自发荧光的影响进行校正。
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    六、实验步骤和分组:

    (一)用18只家兔进行在体实验,观察PMZ对家兔EGTA性发热的影响。家兔随机分4组:ACSF+NS组、ACSF+PMZ组、EGTA+NS组和EGTA+PMZ组,实验时,用HL-2型电子微量恒流泵向侧脑室灌注ACSF150 μL或EGTA(4 mmol/L)150 μL,20 min后,经兔耳缘静脉注射PMZ 1 mL/kg(5 g/L)或生理盐水(normal Saline,NS)1 mL/kg。

    (二)用2只家兔制备下丘脑细胞悬液,观察PMZ对下丘脑细胞[Ca2+]i的影响

    七、体温反应指标及数据处理:

    体温反应指标用平均体温反应曲线,3 h发热反应指数(3 h thermal response index,TRI3)表示。所有数据均采用均数±标准差(x-11.gif (98 bytes)±s)表示,用Studen's t检验判断均数差异的显著性。
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    结果

    一、PMZ对家兔EGTA性发热的影响:

    如图1和表1所示,侧脑室灌注ACSF,20 min后静脉注射生理盐水组,家兔体温没有明显的改变。而ACSF+PMZ组家兔体温明显下降。EGTA+NS组TRI3明显高于ACSF+NS组(P<0.05)。侧脑室灌注0.6 μmol EGTA20 min后静脉注射PMZ(5 mg/kg)组TRI3明显低于EGTA+NS组(P<0.05)。

    表1 各组家兔3 h发热反应指数

    Tab 1 Three-hours thermal response index(TRI3)of rabbits in groups(x-12.gif (98 bytes)±s)
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    Group

    n

    TRI3

    ACSF+NS

    3

    0.88±1.27

    ACSF+PMZ

    4

    -7.33±5.48*

    EGTA+NS

    6

    20.58±6.43*
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    EGTA+PMZ

    5

    6.72±1.45*△

    *P<0.05,vs ACSF+NS group;△P<0.05,vs EGTA+NS group23.gif (7514 bytes)

    Fig 1 Effect of promethazine(iv) on the EGTA-induced fever in rabbits

    图1 静脉注射PMZ对家兔EGTA性发热反应的影响

    二、PMZ对家兔下丘脑细胞[Ca2+]i的影响:
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    实验发现,向下丘脑细胞悬液中加入50 mmol/L KCl,细胞[Ca2+]i从(107.7±4.6)nmol/L 升高到(194.1±10.3)nmol/L(P<0.05)。如图2所示,向下丘脑细胞悬液中加入2 μmol的PMZ(终浓度为0.74 mmol/L),引起Fura-2负载的下丘脑细胞荧光比率(340 nm/380 nm)明显上升,显示PMZ引起下丘脑细胞[Ca2+]i明显增高,下丘脑细胞[Ca2+]i从(159.2±18.8)nmol/L升高到(533.7±90.1)nmol/L(P<0.05)。

    讨论

    Palmi等观察到侧脑室注射钙通道阻断剂异搏定和nifedipine引起家兔体温明显升高,事先给予乙酰水杨酸明显抑制异搏定诱导的这种升温反应,与此相反,侧脑室注射钙通道激动剂BAY-K-8644却引起家兔体温明显降低。提示钙通道阻断剂的作用部位是体温调节中枢的神经元,这些神经元的体温调节功能与钙代谢密切相关[7]。我们先前的研究表明[4],侧脑室灌注EGTA络合中枢Ca2+进而降低下丘脑神经细胞[Ca2+]i导致下丘脑cAMP增高是家兔EGTA性发热的中枢机制。本研究发现,静脉注射PMZ能明显抑制家兔EGTA性发热,而且体外实验进一步观察到,PMZ可引起下丘脑细胞[Ca2+]i明显增高,结合先前的研究[4,7],这些结果提示PMZ诱导体温调节中枢神经细胞[Ca2+]i增高可能是PMZ抑制家兔EGTA性发热的中枢机制之一。Palmi等曾报道[7],侧脑室注射钙通道激动剂BAY-K-8644不仅可降低家兔正常体温,而且抑制家兔ET性发热。如前所述,PMZ可引起家兔下丘脑细胞[Ca2+]i明显增高,而且具有降低正常体温和抑制ET性发热的作用,因此我们推测,PMZ抑制ET性发热的机制也可能与PMZ诱导体温调节中枢神经细胞[Ca2+]i增高有关。新近,Tanaka等发现[8]。PMZ可阻断心肌细胞Na+内流,PMZ对体温调节中枢神经细胞是否有这种作用,有待进一步验证。24.gif (3823 bytes)
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    Fig 2 Effect of promethazine on fluorescence ratios (340 nm/380 nm) in Fura-2-filled hypothalamus cells.(x-13.gif (86 bytes))shows addition of 2 μmol promethazine

    图2 PMZ对负载Fura-2的下丘脑细胞荧光比率(340 nm/380 nm)的影响 参考文献

    1 王德成.解热镇痛抗炎药.王焕斗.主编.应用药理学.贵阳:贵州人民出版社,1984.179.

    2 付咏梅,陈小琳,陆大祥,等.异丙嗪对家兔内毒素性发热及血清SOD和MDA含量的影响.中国病理生理杂志,1998,14:290.
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    3 李楚杰.发热.见:冯新为.主编.病理生理学.第3版.北京:人民卫生出版社,1993.114.

    4 王华东,李楚杰,屈洋,等.下丘脑[Ca2+]i、cAMP在家兔EGTA性发热机制中的作用.中国病理生理杂志,1996,12:402.

    5 Sawyer CH,Everett JW,Green JD.The rabbit diancenphalon in stereotaxic coordinates.J Comp Neuron,1954,101:801.

    6 Dildy JE,Leslie SW.Ethanol inhibits NMDA-induced increases in free intracellular Ca2+ in dissociated cells.Brain Res,1989,499:383.
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    7 Palmi M,Sgaragli G.Hyperthermia induced in rabbits by organic calcium antagonists.Pharmacol Biochem Behav,1989,34:325.

    8 Tanaka H,Habuchi Y,Nishimura M,et al.Blockade of Na+ current by promethazine in guinea-pig ventricular myocytes.Br J Pharmacol,1992,106:900.

    1998年9月9日收稿,1998年11月5日修回, 百拇医药