人野生型p53 cDNA的克隆、表达和意义*
作者：钟叔平 曹 亮 吴文翰
单位：钟叔平 汕头大学医学院生物化学教研室(汕头 515031)；曹 亮 吴文翰(香港大学微生物学系)
关键词：；基因；p53；基因表达；抗体；印迹法；蛋白质
人野生型p53 cDNA的克隆
摘 要 目的：为探讨肿瘤细胞wt p53蛋白功能失活机制的研究，检测肿瘤患者血清抗p53抗体辅助临床诊断提供人wt p53蛋白。方法：将人wt p53基因cDNA片段插入到大肠杆菌表达载体pQE-30中，得到重组表达质粒pQE30-p53；用pQE30-p53重组质粒转化大肠杆菌M15细胞，转化菌落经PCR扩增和BamHⅠ、Xba Ⅰ酶切证实p53基因插入。IPTG诱导大肠杆菌表达wt p53蛋白，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化，SDS-PAGE分离。结果：IPTG诱导后的大肠杆菌出现明显的53 kD蛋白带，免疫印迹进一步证实：大肠杆菌可表达高水平的人wt p53蛋白。结论：这种原核细胞表达的人wt p53蛋白具有天然的p53蛋白的抗原性，可用于p53蛋白的体外分析。
, 百拇医药
Cloning, expression and signification of human
wild type p53 cDNA
ZHONG Shu-Ping1,CAO Liang2,WU Weng-Han2
1 Department of Biochemistry, Medical College of Shantou University, Shantou (515031)
2 Department of Microbiology, University of Hong Kong
Abstract AIM:The fragment of human wild type p53 cDNA is amplified by PCR.METHODS：The expression plasmid of pQE30-p53 is constructed, E coli M15 are trans formed by the plasmid of pQE30-p53. The wt p53 expression is induced by IPTG in M15. The protein is purified by the column of Ni-NAT and SDS-PAGE.The protein is detected by Western blotting with pAb1801. That the colones contain the wt p53 gene is confirmed by PCR. High concentrative wt p53 protein is purified by the column of Ni-NAT. Western blot result shows the strong band of wt p53. RESULT：It is possible to obtain the high concentrative protein of human wt p53 through above approaches.CONCLUSIONS：The expressed wt p53 proteins will be used to investigate the machenism of wt p53 protein inactivation, to detect the autoantibodies against p53 protein in patients sera with carcinoma.
, 百拇医药
MeSH Genes, p53; Gene expression; Antibodies; Blotting, Western
Lane等[1]在研究SV-40T抗原与细胞蛋白相互作用时发现p53蛋白。此后，Baker等[2]证明野生型(wild type,wt)p53蛋白具有抑制转化细胞生长的能力。大量的研究表明：wt p53蛋白具有负调细胞生长和诱导DNA损伤细胞走向细胞凋亡(apoptosis)的功能[3]。业已证明，wt p53蛋白半衰期较短，在正常细胞中不被检出。突变型(mutant type, mt)p53蛋白半衰期延长，功能失活并在肿瘤细胞中大量累积。在已检测的人类肿瘤中，50%以上含有p53基因突变。因此，人们推论p53基因突变可能是肿瘤产生的主要因素。但是在鼻咽癌、宫颈癌中结果却不同，所检测的p53主要为野生型。近年，已发现一些DNA肿瘤病毒蛋白或细胞蛋白与wt p53蛋白不同部位结合使后者功能失活。探讨p53功能失活的机制已成为肿瘤研究领域中的一个新的热点。可是，国内至今尚无此类报道。我们构建全长的人wt p53 cDNA表达质粒，表达wt p53蛋白，这为今后检测肿瘤患者血清抗p53蛋白的自身抗体，研究p53蛋白与肿瘤病毒蛋白或细胞蛋白的相互作用提供材料，对推动我国深入研究广谱的抑瘤基因—wt p53的失活特性具有重要的意义。
, 百拇医药
材料与方法
1.人p53基因的扩增：设计一对引物(5’CGC TCT AGA ATG GGG GTG GGA GGC TGT CAG3’；5’ CGC GGA TCC ATG GAG GAG CCG CAG TCA GAT3’)，以wt p53基因的cDNA为模板，用PE4800扩增仪按常规条件完成扩增，PCR产物为1.23 kb片段。
2.p53蛋白表达质粒的构建：选用含6×His片段的大肠杆菌表达载体QIA express type IV-pQE30(U.S.A)。pQE30载体和纯化后的p53基因的所需片段，T4连接酶在16℃反应2 h，得重组表达质粒。
3.大肠杆菌的转化：制备感受态的大肠杆菌M15细胞，加重组质粒和对照质粒置冰浴10 min，37℃ 3 min，冰浴2 min，这种转化细胞加入LB培养液中，37℃ 30 min，菌液铺于LB/Amp培养板上，37℃过夜，次日观察菌落。挑选部分菌落，PCR检测p53基因，鉴定转化态细胞是否插入p53基因。
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4.p53蛋白的表达和纯化：转化后的大肠杆菌M15接种在50 mL LB/Amp培养液中，37℃摇孵3 h，测其0.D600≤0.6，加100 mmol/L IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃继续摇孵2.5～3 h，离心(10 000 g/15 min 4℃)菌液，PBS洗液2次，加10 mL A液(6 mol/L盐酸胍，50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH8.0)悬浮沉淀细胞，4℃过夜。用1 mL 1∶1 NAT树脂(QIA express Co.U.S.A)装柱，加5 mL ddH2O洗柱，5 mL 0.1 mmol/L NiSO4过柱，5 mL ddH2O洗柱两次，10 mL A液过柱，离心(10 000×g/min，10 min,4℃)过夜的细胞裂解液，加上清液在层析柱上。以下分部收集样品，5 mL A液洗柱，12.5 mL B液(6 mmol/L盐酸胍50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH6.0)洗柱，2.5 mL液(6 mmol/L盐酸胍，50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH5.0)洗脱螯合蛋白，5 mL D液(6 mmol/L盐酸胍，50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH2.0)洗柱。取分 部收集样品各10 μL，加ddH2O至500 μL，混匀，加50 μL 0.15%(w/v)脱氧胆酸钠，混匀后置室温5 min，离心(10 000 ×g,8 min)，弃上清，加8 μL 2% SDS/0.1 mol/L NaOH悬浮沉淀，加12 μL 2×SDS样品缓冲液混匀，沸水浴加热5 min，电泳分离。
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5.SDS-PAGE电泳分离和免疫印迹分析：参照文献[4]。
结果
1.PCR扩增p53基因产物：设计的一对引物分别含有BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，模板为1.76 kb的人p53基因cDNA，扩增后的p53基因产物含有393AA(amino acid)的1.23 kb片段(Fig 1A)。
Fig 1 Recombination of pQE30-p53 expression plasmid
A: PCR products of the human wild type p53 gene, Lane 1: DNA markers (X74 Has Ⅲ); Lane 2,3: 1.23 kb PCR products of human wt 53 gene
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B:Fragments of pQE30 expression plasmid digested by BamH Ⅰ and Xba Ⅰ
C:Fragemets of recombined pQE30-p53expression plasmid digested by BamH Ⅰ and Xba Ⅰ; lane1: DNA markers(Lambda DNA-Bst EII); Lane 2: 2.44 kb fragments of pQE30 digested by BamH Ⅰ and Xba Ⅰ; Lane 3: 2.44 kb fragments of recombined pQE30-p53 plasmid digested by BamH Ⅰ and XbaⅠ; lane 4: 1.23 kb fragments of PCR products of p53 gene
图1 PQE-p53表达质粒的重组
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2.pQE30-p53表达载体的构建：将BamH Ⅰ和XbaⅠ两种限制性内切酶切除QIAexpress TypeⅣ-pQE约1.1 kb片段，回收约2.44 kb大片段(Fig 1B)。PCR扩增的p53基因产物经BamHⅠ和XbaⅠ酶切后，回收1.23 kb片段。两个片段经T4连接酶连接，形成pQE30-p53重组质粒，重组质粒经BamHⅠ和XbaⅠ酶切，分离成两个片段，一个为2.44 kb的pQE30质粒片段(Fig1C 3),一个为1.23 kb p53基因片段(Fig1C 3)。
3.大肠杆菌的转化和鉴定：将pQE30质粒和pQE30-p53重组质粒(Fig 2)分别进行大肠杆菌感受态M15转化，转化后的大肠杆菌M15铺于LB/Amp培养板，37℃孵育过液。pQE30质粒转化菌落密布于整个平板；pQE30-p53重组质粒转化菌落较稀疏地分布在LB/Amp平板上，取pQE30和pQE30-p53菌落进行p53基因插入片段的检测，可见pQE30转化菌落无p53基因扩增片段，而在pQE30-p53转化菌落中50%含有p53基因扩增片段。
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Fig 2 Construction of recombined pQE30-p53 expression plasmid
图2 PCR扩增转化后M15的人wt p53基因产物
4.SDS-PAGE电泳分离：挑选证实已插入p53基因的菌落于LB/AMP培养液中培养，IPTG诱导p53蛋白表达，取少许经IPTG诱导和未诱导的菌体裂解液做SDS-PAGE分离，结果显示(Fig 3A 2):53 kD处含有一条浓染的蛋白条带，而未经IPTG诱导的扩增菌体53 kD位点则无此蛋白带(Fig 3A 3)，表明IPTG诱导pQE30-p53重组质粒表达蛋白效果明显。经Ni-NAT亲和层析纯化蛋白在SDS-PAGE胶中出现富集的wt p53蛋白带。
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Fig 3A Pattern of p53 protein expressed in E coli by SDS-PAGE separation
Lane 1: protein markers; Lane 2: lysate of E coli M15 cells induced by IPTG;Lane 3: lysate of E coli M15 cells
图3A SDS-PAGE蛋白电泳图谱
5.免疫印迹检测p53蛋白的表达：挑选6个转化菌落，PCR扩增证实3、4、5号菌落含有p53基因的插入，1、2号菌落为pQE30质粒，5个菌落在LB/Amp培养液中扩增后分别加IPTE诱导，诱导后的菌体裂解液经SDS-PAGE分离，转膜，pAb1801为一抗做免疫印迹检测p53蛋白的表达。结果显示：不含p53基因片段的菌落无p53蛋白阳性带(Fig3B1,2)，IPTG诱导的M15则表达高浓度的人wt p53蛋白(Fig3B 3,4)，但也有含p53基因片段的菌落，无p53蛋白阳性带(Fig3B 5)，它们可能是大肠杆菌无效表达。
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Fig 3B Western blot analysis of p53 proteins in E coli detected by pAb1801
Lane1 2: Colonies of E coli transformed by pQE30 expression plasmid without p53 gene; Lane 3,4,5: Colonies of E coli transformed by recombined pQE30-p53 expression plasmid
图3B 免疫印迹分析图
讨论
人类肿瘤抑制基因p53位于17 P113.1,p53基因产物是含393AA的磷酸核蛋白。它对含有p53蛋白应答元件的基因具有转录激活作用。p53蛋白的N-末端片段在体外可以和一些转录因子(TF11D、TBP、TF11H)，细胞蛋白(mdm2,HSP70)及病毒蛋白(EIB55 kb)结合；p53蛋白的中央核心区(100～300 AA)含有序列特异性的DNA结合部位，肿瘤细胞的大部分错义突变位于高度保守的中央核心区，SV40T抗原与核心区结合；p53蛋白的C-末端区(300～393AA)具有非特异性DNA结合能力、p53蛋白寡聚区和核定位信号区。一些病毒蛋白也与C-末端结合。以往对p53的研究多局限在基因突变方面，而忽视了wt p53蛋白功能失活致瘤的研究。肿瘤病毒蛋白：SV40 T抗原[1]，腺病毒EIB55 kd[5]，E4orf6[6]，HPVE6[7]，HBx[8]，HCMV IE84[9]，BZLF1[10]和EBNA5可与p53蛋白发生相互作用，影响p53蛋白的功能。任力强曾报道：p53羧基端多肽的原核细胞表达，表达的并非完整的人p53蛋白，所缺乏的N-末端多肽恰为p53的重要功能区。本文报道大肠杆菌表达人全长wt p53蛋白，它是393个氨基酸的完整多肽。表达载体含6×His结构，便于表达后的蛋白纯化。这种原核细胞表达的人wt p53蛋白不仅可用作肿瘤患者血清抗p53自身抗体的检测，也将用于研究肿瘤病毒与p53蛋白之间的相互作用。
, http://www.100md.com
(致谢：感谢湖南医科大学姚开泰对本文的指导!)
* 国家自然科学基金资助，广东省高教厅自然科学重点项目
参考文献
1 Lane DP, Crowford L. T antigen is bound to a host protein in SV 40-transformed cells. Nature, 1979, 278:261.
2 Baker S J,Markowitz S, Fearon E R, et al. Suppression of human colorectal carcinoma cell growth by wild-type p53. Science, 1990, 249:912.
3 Bowman T, Symonds H, Gu LY,et al. Tissue-specific inactivation of p53 tumor suppression in the mouse. Genes Dev, 1996, 10:826.
, 百拇医药
4 钟叔平，何开玲.SRS-淋巴瘤小鼠淋巴细胞活性染色质抗原特性的研究.中国病理生理杂志，1994，10(5)：498.
5 Sarnow P,Ho YS, Williams J, et al. Adenovirus E1B-58kd tumor antigen and SV 40 large tumor antigenare physical associated with the same 54kd cellilar proteins in transformed cells. Cell, 1982, 28:387.
6 Dobner T, Horikoshi N, Rubenwolf S, et al. Blackage by adenovirus E4orf6 of transcriptional activation by the p53 tumor suppressor. Science, 1996, 272:1470.
, 百拇医药
7 Werness BA, Levine AJ, ahd Howley PM. Associated of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53.Science,1990,248:76.
8 Ueda H, Ullrich SJ, Gangemi D, et al. Functional inactivation but not structural mutation of p53 causes liver cancer. Nature Genetics 1995, 9:41.
9 Speir E, Modali R, Huang ES, et al. Potential role of human cytomegalovirus and p53 interaction in coronamy restenosis. Science, 1994, 265:391.
10 Zhang J, Gutsch D, Kemey S. Functional and physical interaction between p53 and BZLF1:implications for Epstein-Barr virus latency. Mol Cell Biol, 1994, 14(5):1929.
(1997年10月16日收稿，1998年3月3日修回), http://www.100md.com
单位：钟叔平 汕头大学医学院生物化学教研室(汕头 515031)；曹 亮 吴文翰(香港大学微生物学系)
关键词：；基因；p53；基因表达；抗体；印迹法；蛋白质
人野生型p53 cDNA的克隆
摘 要 目的：为探讨肿瘤细胞wt p53蛋白功能失活机制的研究，检测肿瘤患者血清抗p53抗体辅助临床诊断提供人wt p53蛋白。方法：将人wt p53基因cDNA片段插入到大肠杆菌表达载体pQE-30中，得到重组表达质粒pQE30-p53；用pQE30-p53重组质粒转化大肠杆菌M15细胞，转化菌落经PCR扩增和BamHⅠ、Xba Ⅰ酶切证实p53基因插入。IPTG诱导大肠杆菌表达wt p53蛋白，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化，SDS-PAGE分离。结果：IPTG诱导后的大肠杆菌出现明显的53 kD蛋白带，免疫印迹进一步证实：大肠杆菌可表达高水平的人wt p53蛋白。结论：这种原核细胞表达的人wt p53蛋白具有天然的p53蛋白的抗原性，可用于p53蛋白的体外分析。
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Cloning, expression and signification of human
wild type p53 cDNA
ZHONG Shu-Ping1,CAO Liang2,WU Weng-Han2
1 Department of Biochemistry, Medical College of Shantou University, Shantou (515031)
2 Department of Microbiology, University of Hong Kong
Abstract AIM:The fragment of human wild type p53 cDNA is amplified by PCR.METHODS：The expression plasmid of pQE30-p53 is constructed, E coli M15 are trans formed by the plasmid of pQE30-p53. The wt p53 expression is induced by IPTG in M15. The protein is purified by the column of Ni-NAT and SDS-PAGE.The protein is detected by Western blotting with pAb1801. That the colones contain the wt p53 gene is confirmed by PCR. High concentrative wt p53 protein is purified by the column of Ni-NAT. Western blot result shows the strong band of wt p53. RESULT：It is possible to obtain the high concentrative protein of human wt p53 through above approaches.CONCLUSIONS：The expressed wt p53 proteins will be used to investigate the machenism of wt p53 protein inactivation, to detect the autoantibodies against p53 protein in patients sera with carcinoma.
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MeSH Genes, p53; Gene expression; Antibodies; Blotting, Western
Lane等[1]在研究SV-40T抗原与细胞蛋白相互作用时发现p53蛋白。此后，Baker等[2]证明野生型(wild type,wt)p53蛋白具有抑制转化细胞生长的能力。大量的研究表明：wt p53蛋白具有负调细胞生长和诱导DNA损伤细胞走向细胞凋亡(apoptosis)的功能[3]。业已证明，wt p53蛋白半衰期较短，在正常细胞中不被检出。突变型(mutant type, mt)p53蛋白半衰期延长，功能失活并在肿瘤细胞中大量累积。在已检测的人类肿瘤中，50%以上含有p53基因突变。因此，人们推论p53基因突变可能是肿瘤产生的主要因素。但是在鼻咽癌、宫颈癌中结果却不同，所检测的p53主要为野生型。近年，已发现一些DNA肿瘤病毒蛋白或细胞蛋白与wt p53蛋白不同部位结合使后者功能失活。探讨p53功能失活的机制已成为肿瘤研究领域中的一个新的热点。可是，国内至今尚无此类报道。我们构建全长的人wt p53 cDNA表达质粒，表达wt p53蛋白，这为今后检测肿瘤患者血清抗p53蛋白的自身抗体，研究p53蛋白与肿瘤病毒蛋白或细胞蛋白的相互作用提供材料，对推动我国深入研究广谱的抑瘤基因—wt p53的失活特性具有重要的意义。
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材料与方法
1.人p53基因的扩增：设计一对引物(5’CGC TCT AGA ATG GGG GTG GGA GGC TGT CAG3’；5’ CGC GGA TCC ATG GAG GAG CCG CAG TCA GAT3’)，以wt p53基因的cDNA为模板，用PE4800扩增仪按常规条件完成扩增，PCR产物为1.23 kb片段。
2.p53蛋白表达质粒的构建：选用含6×His片段的大肠杆菌表达载体QIA express type IV-pQE30(U.S.A)。pQE30载体和纯化后的p53基因的所需片段，T4连接酶在16℃反应2 h，得重组表达质粒。
3.大肠杆菌的转化：制备感受态的大肠杆菌M15细胞，加重组质粒和对照质粒置冰浴10 min，37℃ 3 min，冰浴2 min，这种转化细胞加入LB培养液中，37℃ 30 min，菌液铺于LB/Amp培养板上，37℃过夜，次日观察菌落。挑选部分菌落，PCR检测p53基因，鉴定转化态细胞是否插入p53基因。
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4.p53蛋白的表达和纯化：转化后的大肠杆菌M15接种在50 mL LB/Amp培养液中，37℃摇孵3 h，测其0.D600≤0.6，加100 mmol/L IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃继续摇孵2.5～3 h，离心(10 000 g/15 min 4℃)菌液，PBS洗液2次，加10 mL A液(6 mol/L盐酸胍，50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH8.0)悬浮沉淀细胞，4℃过夜。用1 mL 1∶1 NAT树脂(QIA express Co.U.S.A)装柱，加5 mL ddH2O洗柱，5 mL 0.1 mmol/L NiSO4过柱，5 mL ddH2O洗柱两次，10 mL A液过柱，离心(10 000×g/min，10 min,4℃)过夜的细胞裂解液，加上清液在层析柱上。以下分部收集样品，5 mL A液洗柱，12.5 mL B液(6 mmol/L盐酸胍50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH6.0)洗柱，2.5 mL液(6 mmol/L盐酸胍，50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH5.0)洗脱螯合蛋白，5 mL D液(6 mmol/L盐酸胍，50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH2.0)洗柱。取分 部收集样品各10 μL，加ddH2O至500 μL，混匀，加50 μL 0.15%(w/v)脱氧胆酸钠，混匀后置室温5 min，离心(10 000 ×g,8 min)，弃上清，加8 μL 2% SDS/0.1 mol/L NaOH悬浮沉淀，加12 μL 2×SDS样品缓冲液混匀，沸水浴加热5 min，电泳分离。
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5.SDS-PAGE电泳分离和免疫印迹分析：参照文献[4]。
结果
1.PCR扩增p53基因产物：设计的一对引物分别含有BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，模板为1.76 kb的人p53基因cDNA，扩增后的p53基因产物含有393AA(amino acid)的1.23 kb片段(Fig 1A)。
Fig 1 Recombination of pQE30-p53 expression plasmid
A: PCR products of the human wild type p53 gene, Lane 1: DNA markers (X74 Has Ⅲ); Lane 2,3: 1.23 kb PCR products of human wt 53 gene
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B:Fragments of pQE30 expression plasmid digested by BamH Ⅰ and Xba Ⅰ
C:Fragemets of recombined pQE30-p53expression plasmid digested by BamH Ⅰ and Xba Ⅰ; lane1: DNA markers(Lambda DNA-Bst EII); Lane 2: 2.44 kb fragments of pQE30 digested by BamH Ⅰ and Xba Ⅰ; Lane 3: 2.44 kb fragments of recombined pQE30-p53 plasmid digested by BamH Ⅰ and XbaⅠ; lane 4: 1.23 kb fragments of PCR products of p53 gene
图1 PQE-p53表达质粒的重组
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2.pQE30-p53表达载体的构建：将BamH Ⅰ和XbaⅠ两种限制性内切酶切除QIAexpress TypeⅣ-pQE约1.1 kb片段，回收约2.44 kb大片段(Fig 1B)。PCR扩增的p53基因产物经BamHⅠ和XbaⅠ酶切后，回收1.23 kb片段。两个片段经T4连接酶连接，形成pQE30-p53重组质粒，重组质粒经BamHⅠ和XbaⅠ酶切，分离成两个片段，一个为2.44 kb的pQE30质粒片段(Fig1C 3),一个为1.23 kb p53基因片段(Fig1C 3)。
3.大肠杆菌的转化和鉴定：将pQE30质粒和pQE30-p53重组质粒(Fig 2)分别进行大肠杆菌感受态M15转化，转化后的大肠杆菌M15铺于LB/Amp培养板，37℃孵育过液。pQE30质粒转化菌落密布于整个平板；pQE30-p53重组质粒转化菌落较稀疏地分布在LB/Amp平板上，取pQE30和pQE30-p53菌落进行p53基因插入片段的检测，可见pQE30转化菌落无p53基因扩增片段，而在pQE30-p53转化菌落中50%含有p53基因扩增片段。
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Fig 2 Construction of recombined pQE30-p53 expression plasmid
图2 PCR扩增转化后M15的人wt p53基因产物
4.SDS-PAGE电泳分离：挑选证实已插入p53基因的菌落于LB/AMP培养液中培养，IPTG诱导p53蛋白表达，取少许经IPTG诱导和未诱导的菌体裂解液做SDS-PAGE分离，结果显示(Fig 3A 2):53 kD处含有一条浓染的蛋白条带，而未经IPTG诱导的扩增菌体53 kD位点则无此蛋白带(Fig 3A 3)，表明IPTG诱导pQE30-p53重组质粒表达蛋白效果明显。经Ni-NAT亲和层析纯化蛋白在SDS-PAGE胶中出现富集的wt p53蛋白带。
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Fig 3A Pattern of p53 protein expressed in E coli by SDS-PAGE separation
Lane 1: protein markers; Lane 2: lysate of E coli M15 cells induced by IPTG;Lane 3: lysate of E coli M15 cells
图3A SDS-PAGE蛋白电泳图谱
5.免疫印迹检测p53蛋白的表达：挑选6个转化菌落，PCR扩增证实3、4、5号菌落含有p53基因的插入，1、2号菌落为pQE30质粒，5个菌落在LB/Amp培养液中扩增后分别加IPTE诱导，诱导后的菌体裂解液经SDS-PAGE分离，转膜，pAb1801为一抗做免疫印迹检测p53蛋白的表达。结果显示：不含p53基因片段的菌落无p53蛋白阳性带(Fig3B1,2)，IPTG诱导的M15则表达高浓度的人wt p53蛋白(Fig3B 3,4)，但也有含p53基因片段的菌落，无p53蛋白阳性带(Fig3B 5)，它们可能是大肠杆菌无效表达。
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Fig 3B Western blot analysis of p53 proteins in E coli detected by pAb1801
Lane1 2: Colonies of E coli transformed by pQE30 expression plasmid without p53 gene; Lane 3,4,5: Colonies of E coli transformed by recombined pQE30-p53 expression plasmid
图3B 免疫印迹分析图
讨论
人类肿瘤抑制基因p53位于17 P113.1,p53基因产物是含393AA的磷酸核蛋白。它对含有p53蛋白应答元件的基因具有转录激活作用。p53蛋白的N-末端片段在体外可以和一些转录因子(TF11D、TBP、TF11H)，细胞蛋白(mdm2,HSP70)及病毒蛋白(EIB55 kb)结合；p53蛋白的中央核心区(100～300 AA)含有序列特异性的DNA结合部位，肿瘤细胞的大部分错义突变位于高度保守的中央核心区，SV40T抗原与核心区结合；p53蛋白的C-末端区(300～393AA)具有非特异性DNA结合能力、p53蛋白寡聚区和核定位信号区。一些病毒蛋白也与C-末端结合。以往对p53的研究多局限在基因突变方面，而忽视了wt p53蛋白功能失活致瘤的研究。肿瘤病毒蛋白：SV40 T抗原[1]，腺病毒EIB55 kd[5]，E4orf6[6]，HPVE6[7]，HBx[8]，HCMV IE84[9]，BZLF1[10]和EBNA5可与p53蛋白发生相互作用，影响p53蛋白的功能。任力强曾报道：p53羧基端多肽的原核细胞表达，表达的并非完整的人p53蛋白，所缺乏的N-末端多肽恰为p53的重要功能区。本文报道大肠杆菌表达人全长wt p53蛋白，它是393个氨基酸的完整多肽。表达载体含6×His结构，便于表达后的蛋白纯化。这种原核细胞表达的人wt p53蛋白不仅可用作肿瘤患者血清抗p53自身抗体的检测，也将用于研究肿瘤病毒与p53蛋白之间的相互作用。
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(致谢：感谢湖南医科大学姚开泰对本文的指导!)
* 国家自然科学基金资助，广东省高教厅自然科学重点项目
参考文献
1 Lane DP, Crowford L. T antigen is bound to a host protein in SV 40-transformed cells. Nature, 1979, 278:261.
2 Baker S J,Markowitz S, Fearon E R, et al. Suppression of human colorectal carcinoma cell growth by wild-type p53. Science, 1990, 249:912.
3 Bowman T, Symonds H, Gu LY,et al. Tissue-specific inactivation of p53 tumor suppression in the mouse. Genes Dev, 1996, 10:826.
, 百拇医药
4 钟叔平，何开玲.SRS-淋巴瘤小鼠淋巴细胞活性染色质抗原特性的研究.中国病理生理杂志，1994，10(5)：498.
5 Sarnow P,Ho YS, Williams J, et al. Adenovirus E1B-58kd tumor antigen and SV 40 large tumor antigenare physical associated with the same 54kd cellilar proteins in transformed cells. Cell, 1982, 28:387.
6 Dobner T, Horikoshi N, Rubenwolf S, et al. Blackage by adenovirus E4orf6 of transcriptional activation by the p53 tumor suppressor. Science, 1996, 272:1470.
, 百拇医药
7 Werness BA, Levine AJ, ahd Howley PM. Associated of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53.Science,1990,248:76.
8 Ueda H, Ullrich SJ, Gangemi D, et al. Functional inactivation but not structural mutation of p53 causes liver cancer. Nature Genetics 1995, 9:41.
9 Speir E, Modali R, Huang ES, et al. Potential role of human cytomegalovirus and p53 interaction in coronamy restenosis. Science, 1994, 265:391.
10 Zhang J, Gutsch D, Kemey S. Functional and physical interaction between p53 and BZLF1:implications for Epstein-Barr virus latency. Mol Cell Biol, 1994, 14(5):1929.
(1997年10月16日收稿，1998年3月3日修回), http://www.100md.com