局部缺血“预处理”诱导家兔相邻非缺血心肌热休克蛋白70基因表达
作者：温朝阳 张志寿 郝好赤 李儒汉
单位：温朝阳(解放军总医院)；张志寿(超声科)；郝好赤(心内科)；李儒汉 分子生物学实验室(北京 100853)
关键词：局部缺血；热休克蛋白质类；基因；免疫印迹法
局部缺血 摘 要 目的：研究兔心局部缺血“预处理”后，局部缺血和相邻非缺血心肌热休克蛋白70(HSP70) mRNA的水平变化。方法：提取心肌组织总RNA，用HSP70探针进行斑点杂交。结果：缺血预处理组的缺血区和非缺血区HSP70 mRNA表达水平均显著高于对照组相应部位(P<0.05)，而每组内的缺血区及非缺血区间无显著差异(P>0.05)。结论：局部缺血“预处理”后，缺血和非缺血区两处心肌的内反应呈“一致性”；缺血预处理对心肌的保护作用可能与HSP70的合成增多有关。
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Transcription of HSP70 gene induced by regional ischemic preconditioning in remote virgin myocardium of rabbits
WEN Chao-Yang, ZHANG Zhi-Shou, HAO Hao-Jie, LI Ru-Han
PLA General Hospital, Beijing (100853)
Abstract AIM: To define whether regional ischemic preconditioning also increases HSP70 mRNA level in remote virgin myocardium. METHODS：13 rabbits were randomly assigned to either a 'preconditioned' group (n=6) which underwent 4 episodes of 5-min occlusion and reperfusion followed by 60-min reperfusion or a sham -operated control group (n=6). Then 24 tissue samples from the myocardium perfused by LAD, immediately below the snares, and the remote virgin myocardium were frozon rapidly. HSP70 mRNA was measured by Dot blotting.RESULTS：Four cycles of 5-min ischemia and reperfusion resulted in significant increase(P<0.05) of HSP70 mRNA in both ischemic and nonischemic myocytes compared with the controls, but HSP70 mRNA levels from both positions of the hearts were similar in every group. CONCLUSION：The heart might be activated as a whole' in some way after regional ischemic preconditioning(PC), and the protection effect of PC might be related to the increased synthesis of HSP70.
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MeSH Ischemia; Heat-shock proteins; Gene; Immunoblotting
缺血预处理(ischemic preconditioning, PC)现象的发现[1]，展示了心肌保护的新途径。其机制尚未完全阐明。已知局部缺血后缺血心肌HSP70 mRNA表达增加[2，3]，但另一支血管灌注区的非缺血心肌HSP70 mRNA表达是否增加尚不十分清楚。本实验旨在研究兔心局部缺血“预处理”后，局部缺血区和另一支血管灌注的非缺血区HSP70 mRNA表达水平的变化，从一个侧面探讨缺血预处理保护心肌的机制。
材料与方法
一、主要试剂与仪器设备：
1.HSP70基因片段：北京华美生物工程公司产品，来源：Wistar大鼠cDNA，基因片段长度2.3 kb。2.β-actin基因片段：北京天象人生物工程公司产品，来源：大鼠cDNA，定位：7 pter-922,基因片段长度1.0 kb。3.[α-32P]dCTP:北京市亚辉生物医学工程公司产品，比活度11 100×1010Bq/nmol，[放射性]活度37×104 Bq/μL，放射化学纯度95%。
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二、实验步骤：
(一)心肌标本采取：12只健康新西兰白免，体重1.75～2.3 kg，雌雄兼用。随机分为缺血预处理组(6只)：3%戊巴比妥钠(30 mg/kg,iv)麻醉，监护Ⅱ导心电图，气管插管。开胸，勿损伤胸膜。用眼科园针于冠脉前降支(LAD)近起始部8～10 mm、回旋支第一大边缘支——左室支(MA)的左心耳下缘至心尖部的中点处各穿一根阻闭、松开用的丝线。前降支阻闭5 min、再灌注5 min，如此阻闭/再灌注共4次，随后再灌注1 h；假手术对照组(6只)：即同样开胸、冠脉穿线，但不作阻闭冠脉操作，手术完成后旷置100 min。杀兔取心，从前降支、左室支结扎线远端青紫处各取心肌200～300 mg，共24个标本，迅速液氮保存。
(二)杂交[4]：采用(异硫氰酸胍-酚-氯仿)一步法提取心肌总RNA。甲醛变性胶电脉法电泳RNA(各孔分别加心肌总RNA30 μg，在加有EB的变性电泳胶中3 V/cm电泳40 min)，用于进行Northern印迹。同时每份标本分别等量点样于两张尼龙膜，行斑点印迹，分别与HSP70、β-actin探针杂交。用随机引物法标记DNA探针。用QTM970自动图像分析仪，探测斑点杂交放射性自显影胶片上杂交斑点的积分光密度(IOD)，以HSP70探针杂交斑点的积分光密度(IODh)与β-actin探针杂交斑点的积分密度(IODβ)的比值(IODh/IODβ)，表示标本HSP70mRNA量。
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三、统计分析：
数据以
表示，全部数据输入计算机数据库，用SAS软件进行分析，采用秩和检验(Wilcoxon 2-sample test)。
结果
1.心肌总RNA的变性电泳和Northern杂交分析鉴定：心肌总RNA的变性电泳，呈28 s和18 s两条带(5 s rRNA显示不清楚)，各种分子量的mRNA分布于各带之间。用HSP70探针Northern杂交，呈现杂交带。
2.局部缺血“预处理”后，不同部位HSP70mRNA的表达水平：斑点杂交时，RNA点样量为10 μg。局部缺血“预处理”后，局部缺血区和另一支血管灌注的非缺血区HSP70 mRNA表达水平均明显高于对照组相应部位(2.248±2.279, vs 0.780±0.686及1.588±2.967 vs 0.539±0.415)(P<0.05)，每组的前降支与左室支血管分布区心肌HSP70mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)，见图1、2。
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Pig 1 Dot blot analysis of HSP70,β-actin mRNA from myocardium perfused by LAD
图1 前降支分布区心肌HSP70,β-actin mRNA斑点杂交
Pig 2 Dot blot analysis of HSP70,β-actin mRNA from myocardium perfused by MA
图2 左室支分布区心肌HSP70,β-actin mRNA斑点杂交
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讨论
自Murry等[1]报道缺血预处理现象以来，大量研究证实这种现象存在于多种动物和人。80年代人们又发现HSP70能保护缺血心肌[5，6]。当生物细胞处于不同的应激状态(包括温度升高、缺血、缺氧等)时，可导致一组相关蛋白合成的增加，被称为HSPs，其中HSP70在大多数生物中含量最多、最具重要性。
1988年Currie等[5]首次报道了热处理能保护缺血心肌的现象，同时有HSP70的增多。热处理亦能缩小心梗范围[7]。Mestril等[6]以培养的胚胎鼠心肌细胞进行实验：热处理后对持续低氧的耐受性增加，而且用人的HSP70基因片段转染的细胞与对照组相比，对持续低氧的耐受性亦明显增加。这些结果表明HSP70可增加心肌细胞对缺血的耐受性，保护缺血心肌、缩小心梗范围。
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我们既往研究显示兔心前降支局部缺血“预处理”能缩小远处左室支持续缺血所致心梗范围，如果缺血预处理保护缺血心肌的作用系HSP70合成所至，那么局部缺血“预处理”后，局部和远处心肌HSP70mRNA均应增加。Knowlton等[2]和Das等[3]也曾报道，局部多次短暂缺血发作后1 h局部缺血心肌HSP70mRNA水平增加，并持续24 h以上；远处非缺血心肌HSP70mRNA表达亦增加，但其样本数少(4个)，且缺少内参照校正加样误差，需待进一步验证。
本实验以β-actin为内标校正加样误差，并增大样本数。前降支多次短暂缺血发作后1 h，前降支和左室支分布区心肌的HSP70mRNA的表达均明显高于对照组相应部位(P<0.05)；而每组内两血管分布区心肌HSP70mRNA表达无显著差异(P>0.05)。这说明前降支局部多次短暂缺血发作后，兔心前降支和左室支血管分布区心肌内存在反应的“一致性”，提示HSP70合成与缺血预处理现象有关。
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参考文献
1 Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation, 1986, 74:1124.
2 Knowlton AA, Brecher P, Apstein CS. Rapid expression of heat shock pretein in the rabbit after brief cardiac ischemia. J Clin Invest,1991, 87:139.
3 Das DK, Engelman RM, Kimura Y. Molecular adaptation of cellar defences following preconditioning of the heart by repeated ischaemia. Cardiovasc Res,1993, 27:578.
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4 J.萨姆布鲁克等著.金冬雁，等译.分子克隆实验指南.第2版.科学出版社，1992.
5 Currie RW, Karmazyn M, Kloc M,et al. Heat-shock response is associated with enhanced postischemic ventricular recovery. Circ Res, 1988, 63:543.
6 Mestril R, Chi SH, Sayen MR, et al. Express of inducible strees protein 70 in rat heart myogenic cells confers protection against simulated ischemia-induced injury. J Clin Invest, 1994,93:759.
7 Currie RW, Tanguay RM, Kingma JG.Heart-shock response and limitation of tissure necrosis during occlusion/reperfusion in rabbit hearts. Circulation, 1993, 87:963.
(1997年10月6日收稿，1998年6月4日修回), http://www.100md.com
单位：温朝阳(解放军总医院)；张志寿(超声科)；郝好赤(心内科)；李儒汉 分子生物学实验室(北京 100853)
关键词：局部缺血；热休克蛋白质类；基因；免疫印迹法
局部缺血 摘 要 目的：研究兔心局部缺血“预处理”后，局部缺血和相邻非缺血心肌热休克蛋白70(HSP70) mRNA的水平变化。方法：提取心肌组织总RNA，用HSP70探针进行斑点杂交。结果：缺血预处理组的缺血区和非缺血区HSP70 mRNA表达水平均显著高于对照组相应部位(P<0.05)，而每组内的缺血区及非缺血区间无显著差异(P>0.05)。结论：局部缺血“预处理”后，缺血和非缺血区两处心肌的内反应呈“一致性”；缺血预处理对心肌的保护作用可能与HSP70的合成增多有关。
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Transcription of HSP70 gene induced by regional ischemic preconditioning in remote virgin myocardium of rabbits
WEN Chao-Yang, ZHANG Zhi-Shou, HAO Hao-Jie, LI Ru-Han
PLA General Hospital, Beijing (100853)
Abstract AIM: To define whether regional ischemic preconditioning also increases HSP70 mRNA level in remote virgin myocardium. METHODS：13 rabbits were randomly assigned to either a 'preconditioned' group (n=6) which underwent 4 episodes of 5-min occlusion and reperfusion followed by 60-min reperfusion or a sham -operated control group (n=6). Then 24 tissue samples from the myocardium perfused by LAD, immediately below the snares, and the remote virgin myocardium were frozon rapidly. HSP70 mRNA was measured by Dot blotting.RESULTS：Four cycles of 5-min ischemia and reperfusion resulted in significant increase(P<0.05) of HSP70 mRNA in both ischemic and nonischemic myocytes compared with the controls, but HSP70 mRNA levels from both positions of the hearts were similar in every group. CONCLUSION：The heart might be activated as a whole' in some way after regional ischemic preconditioning(PC), and the protection effect of PC might be related to the increased synthesis of HSP70.
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MeSH Ischemia; Heat-shock proteins; Gene; Immunoblotting
缺血预处理(ischemic preconditioning, PC)现象的发现[1]，展示了心肌保护的新途径。其机制尚未完全阐明。已知局部缺血后缺血心肌HSP70 mRNA表达增加[2，3]，但另一支血管灌注区的非缺血心肌HSP70 mRNA表达是否增加尚不十分清楚。本实验旨在研究兔心局部缺血“预处理”后，局部缺血区和另一支血管灌注的非缺血区HSP70 mRNA表达水平的变化，从一个侧面探讨缺血预处理保护心肌的机制。
材料与方法
一、主要试剂与仪器设备：
1.HSP70基因片段：北京华美生物工程公司产品，来源：Wistar大鼠cDNA，基因片段长度2.3 kb。2.β-actin基因片段：北京天象人生物工程公司产品，来源：大鼠cDNA，定位：7 pter-922,基因片段长度1.0 kb。3.[α-32P]dCTP:北京市亚辉生物医学工程公司产品，比活度11 100×1010Bq/nmol，[放射性]活度37×104 Bq/μL，放射化学纯度95%。
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二、实验步骤：
(一)心肌标本采取：12只健康新西兰白免，体重1.75～2.3 kg，雌雄兼用。随机分为缺血预处理组(6只)：3%戊巴比妥钠(30 mg/kg,iv)麻醉，监护Ⅱ导心电图，气管插管。开胸，勿损伤胸膜。用眼科园针于冠脉前降支(LAD)近起始部8～10 mm、回旋支第一大边缘支——左室支(MA)的左心耳下缘至心尖部的中点处各穿一根阻闭、松开用的丝线。前降支阻闭5 min、再灌注5 min，如此阻闭/再灌注共4次，随后再灌注1 h；假手术对照组(6只)：即同样开胸、冠脉穿线，但不作阻闭冠脉操作，手术完成后旷置100 min。杀兔取心，从前降支、左室支结扎线远端青紫处各取心肌200～300 mg，共24个标本，迅速液氮保存。
(二)杂交[4]：采用(异硫氰酸胍-酚-氯仿)一步法提取心肌总RNA。甲醛变性胶电脉法电泳RNA(各孔分别加心肌总RNA30 μg，在加有EB的变性电泳胶中3 V/cm电泳40 min)，用于进行Northern印迹。同时每份标本分别等量点样于两张尼龙膜，行斑点印迹，分别与HSP70、β-actin探针杂交。用随机引物法标记DNA探针。用QTM970自动图像分析仪，探测斑点杂交放射性自显影胶片上杂交斑点的积分光密度(IOD)，以HSP70探针杂交斑点的积分光密度(IODh)与β-actin探针杂交斑点的积分密度(IODβ)的比值(IODh/IODβ)，表示标本HSP70mRNA量。
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三、统计分析：
数据以
表示，全部数据输入计算机数据库，用SAS软件进行分析，采用秩和检验(Wilcoxon 2-sample test)。结果
1.心肌总RNA的变性电泳和Northern杂交分析鉴定：心肌总RNA的变性电泳，呈28 s和18 s两条带(5 s rRNA显示不清楚)，各种分子量的mRNA分布于各带之间。用HSP70探针Northern杂交，呈现杂交带。
2.局部缺血“预处理”后，不同部位HSP70mRNA的表达水平：斑点杂交时，RNA点样量为10 μg。局部缺血“预处理”后，局部缺血区和另一支血管灌注的非缺血区HSP70 mRNA表达水平均明显高于对照组相应部位(2.248±2.279, vs 0.780±0.686及1.588±2.967 vs 0.539±0.415)(P<0.05)，每组的前降支与左室支血管分布区心肌HSP70mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)，见图1、2。
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Pig 1 Dot blot analysis of HSP70,β-actin mRNA from myocardium perfused by LAD
图1 前降支分布区心肌HSP70,β-actin mRNA斑点杂交
Pig 2 Dot blot analysis of HSP70,β-actin mRNA from myocardium perfused by MA
图2 左室支分布区心肌HSP70,β-actin mRNA斑点杂交
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讨论
自Murry等[1]报道缺血预处理现象以来，大量研究证实这种现象存在于多种动物和人。80年代人们又发现HSP70能保护缺血心肌[5，6]。当生物细胞处于不同的应激状态(包括温度升高、缺血、缺氧等)时，可导致一组相关蛋白合成的增加，被称为HSPs，其中HSP70在大多数生物中含量最多、最具重要性。
1988年Currie等[5]首次报道了热处理能保护缺血心肌的现象，同时有HSP70的增多。热处理亦能缩小心梗范围[7]。Mestril等[6]以培养的胚胎鼠心肌细胞进行实验：热处理后对持续低氧的耐受性增加，而且用人的HSP70基因片段转染的细胞与对照组相比，对持续低氧的耐受性亦明显增加。这些结果表明HSP70可增加心肌细胞对缺血的耐受性，保护缺血心肌、缩小心梗范围。
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我们既往研究显示兔心前降支局部缺血“预处理”能缩小远处左室支持续缺血所致心梗范围，如果缺血预处理保护缺血心肌的作用系HSP70合成所至，那么局部缺血“预处理”后，局部和远处心肌HSP70mRNA均应增加。Knowlton等[2]和Das等[3]也曾报道，局部多次短暂缺血发作后1 h局部缺血心肌HSP70mRNA水平增加，并持续24 h以上；远处非缺血心肌HSP70mRNA表达亦增加，但其样本数少(4个)，且缺少内参照校正加样误差，需待进一步验证。
本实验以β-actin为内标校正加样误差，并增大样本数。前降支多次短暂缺血发作后1 h，前降支和左室支分布区心肌的HSP70mRNA的表达均明显高于对照组相应部位(P<0.05)；而每组内两血管分布区心肌HSP70mRNA表达无显著差异(P>0.05)。这说明前降支局部多次短暂缺血发作后，兔心前降支和左室支血管分布区心肌内存在反应的“一致性”，提示HSP70合成与缺血预处理现象有关。
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参考文献
1 Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation, 1986, 74:1124.
2 Knowlton AA, Brecher P, Apstein CS. Rapid expression of heat shock pretein in the rabbit after brief cardiac ischemia. J Clin Invest,1991, 87:139.
3 Das DK, Engelman RM, Kimura Y. Molecular adaptation of cellar defences following preconditioning of the heart by repeated ischaemia. Cardiovasc Res,1993, 27:578.
, 百拇医药
4 J.萨姆布鲁克等著.金冬雁，等译.分子克隆实验指南.第2版.科学出版社，1992.
5 Currie RW, Karmazyn M, Kloc M,et al. Heat-shock response is associated with enhanced postischemic ventricular recovery. Circ Res, 1988, 63:543.
6 Mestril R, Chi SH, Sayen MR, et al. Express of inducible strees protein 70 in rat heart myogenic cells confers protection against simulated ischemia-induced injury. J Clin Invest, 1994,93:759.
7 Currie RW, Tanguay RM, Kingma JG.Heart-shock response and limitation of tissure necrosis during occlusion/reperfusion in rabbit hearts. Circulation, 1993, 87:963.
(1997年10月6日收稿，1998年6月4日修回), http://www.100md.com