异丙肾上腺素致大鼠心肌坏死时心肌细胞核钙转运功能的变化
作者：王培勇 姚兴海 苏静怡 汤健 唐朝枢
单位：北京医科大学心血管基础研究所病生室(北京 100083)
关键词：心肌；坏死；钙；细胞核；Ca2+转运ATP酶
异丙肾上腺素致大鼠心肌坏死时心肌 细胞核钙转运功能的变化 摘 要 目的：观察ISO心肌坏死时大鼠心肌细胞核钙转运系统的改变。方法：大鼠心肌坏死模型采用皮下注射ISO制备，心肌细胞核采用差速离心和密度梯度离心分离纯化，用酶学方法鉴定核的纯度及测定ATPase活性，用45Ca2+同位素法测定核钙摄取。结果：与对照组相比，ISO坏死心脏组织呈显著的损伤和坏死，心系数增加35%(P<0.01)，心肌组织MDA和钙含量分别增加57%和80%(P<0.01)。与对照组相比，ISO心肌坏死细胞核Ca-ATPase的[Ca2+]反应Vmax降低27.5%(P<0.01)，Ka无显著变化；对[ATP]反应的Vmax无显著变化，而Km增加61.7%(P<0.05)；ISO组45Ca2+摄取显著降低(P<0.01)，Vmax与对照组相比降低46.1%(P<0.01)，Km无显著变化。结论：坏死心肌细胞核钙转运系统功能显著降低，可能与心肌坏死时细胞核功能紊乱有关。
, http://www.100md.com
Dysfunction of myocardial nuclear calcium transport in isoproterenol induced myocardial necrosis in rats
WANG Pei-Yong， YAO Xing-Hai,SU Jing-Yi,TANG Jian, TANG Chao-shu
Laboratory of Pathophysiology,Cardiovascular Basic Research Institute,Beijing Medical University, Beijing(100083)
Abstract AIM:Myocardial nuclear calcium transport was investigated on the model of isoproterenol(ISO)induced cardiac hypertrophy.METHODS:Rats were given injections of ISO subcutaneously(69 μmol.kg-1.d-1. for 3 days).Myocardial nuclei were purified with sucrose density centrifugation and identified zymologically,the activity of Ca2+-ATPase was measured zymologically and calcium uptake was assayed with [45 Ca2+]isotope.RESULTS:ISO-injured heart presented obvious myocardial injury and necrosis. The ratio of heart weight to body weight in ISO group increased by 35%(P<0.01).MDA and calcium content in myocardial tissue increased by 57% and 80% respectively(P<0.01 compared with control).Vmax to [Ca2+]and Km to [ATP]of ATPase activity decreased by about 27.5%和61.7% respectively(P<0.05).Significant decrease of nuclear[45Ca2+]uptake was observed and Vmax value was lowered by 46.1% compared with that of control(P<0.01),but Km value remained unchanged.CONCLUSION：Dysfunction of nuclear calcium transport in isoproterenol induced myocardial injury.
, 百拇医药
MeSH Myocardium; Necrosis; Calcium;Cell nucleus;Ca2+-transporting ATPase
Ca2+是细胞内重要的第二信使，不仅调节细胞的功能代谢，而且在细胞核内还对细胞分化、发育、增殖、坏死和凋亡等核功能也起重要作用。近年发现，胞浆的Ca2+进入胞核，主要是通过核膜上的钙泵和核IP3受体等核钙主动转运系统调节，而不是通过核孔被动摄取[1]。心血管疾病时，核钙转运系统的变化及其意义，目前均不清楚。本工作在异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)心肌坏死大鼠模型上，观察心肌细胞核被膜钙泵(Ca-ATPase)活性和核[45Ca2+]摄取的变化，以探讨心肌损伤时心肌细胞核功能紊乱的可能机制。
材料和方法
, 百拇医药
(一)材料与试剂：Wistar 大鼠由本校实验动物中心提供，isoproterenol、ATP-Na2、dithiothreiol(DTT)、phenylmethylsulfonyl fluride(PMSF)、phosphoenolpyrovate(PEP)、pyrovate kinase(PK)以及标志酶测定试剂购自Sigma Co., [45CaCl2]为Amersham产品。其余试剂均为国产GR或AR级，所用各溶液均以超纯水配制。
(二)大鼠异丙肾上腺素心肌坏死模型制备：雄性Wistar大鼠，体重100～150 g，按Rona等方法略作改良复制ISO心肌坏死模型[2]。ISO组(n=20)动物每日上午皮下注射ISO(69 μmol/kg)1次，连续注射3 d。对照组(n=20)动物生理盐水代替ISO皮下注射。全部动物于末次注射后24 h，以20%乌拉坦 (l g/kg,ip)麻醉，动脉放血处死动物，收集血液，4℃分离血浆。采用生化自动分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，用硫代巴比妥酸比色法测定脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量。开胸取心脏，称重，取心尖部位用10%福尔马林固定用于病理学检查，其余心肌用于以下实验。
, 百拇医药
(三)心肌细胞核分离：参照文献[3]方法改进：大鼠心脏用冷TKM液冲洗(mmol/L:Tris/HCl 50.0,KCI 25.0,MgCl2 5.0,EGTA 1.0, DTT 1.0， PMSF 1.0,leupeptin 0.001,pH 7.4),剪碎后按1∶5(W/V)加入等渗匀浆介质(TKM含0.25 mol/L蔗糖和1.0 mmol/L EGTA)，内切式匀浆器低速(8 000 r/min)匀浆2.5 min,再经玻璃匀浆器匀浆，纱布过滤后离心(1 200×g, 10 min)，弃上清，将沉淀再匀浆和离心1次，加入1倍体积的含1.0 mol/L蔗糖-TKM液混匀，再加入3倍体积2.5 mol/L的蔗糖-TKM液，混匀离心，(120 000×g,60 min)后，收集沉淀即为心肌细胞核，于-70℃储存备用。采用Lowry法行蛋白质定量，二苯胺法行DNA定量。用原子吸收分光光度法测定钙含量。按文献方法测定下述亚细胞成分标识酶的活性：5’-核苷酸酶(肌质膜)、葡萄糖-6-磷酸酶(肌浆网)和琥珀酸脱氢酶(线粒体)[4～6]。用分离纯化的心肌细胞核进行下述实验。
, 百拇医药
(四)核Ca2+-ATPase 活性测定[4]：反应液为(mmol/L):KCl 100.0，histidine 50.0,MgCl2 5.0,PEP 3.3,PK 15U/mL,EGTA 0.1， pH 7.0,加入50μg蛋白质的核，终反应体积为1.0 mL。采用双复管测定。反应液中的Ca2+浓度为100～3 200 nmol/L，通过EGTA与Ca2+的缓冲体系控制，根据Bartifi的多元缓冲对计算方法确定[5]，然后用Fura-2(10 μmol/L)荧光测定法核对。37℃预温5 min后，加入2.0 mmol/L的ATP始动反应，孵育10 min。加入终止液2.5 mL终止反应，测定无机磷产量。Ca2+-ATPase 活性为总ATPase活性与Mg2+-ATPase活性之差。酶活性单位为nmol/min.mg蛋白质。
, 百拇医药
(五)核[45Ca2+]转运测定[4]：反应液为(mmol/L):KCl 125.0, HEPES 20.0, MgCl2 5.0, pH7.0, ATP 2.0, EGTA 0.1, [45Ca2+]18.5 kBq, Ca2+浓度同Ca2+-ATPase测定，终体积0.5 mL。37℃预温5 min后通过加入0.2 mg蛋白质的核，始动反应，孵育一定时间后加入1mL 0.2mol/L MgCl2终止反应，在Millipore抽滤器上以0.45 μm微孔滤膜抽滤，用0.1 mol/L MgCl2冲洗3次。滤膜干燥后加入闪烁液，在β-液闪计数仪上测定[45Ca2+]放射性强度。同时做非特异摄入管，操作同上，但反应液中不含ATP。核[45Ca2+]转运=总摄入-非特异摄入，以pmol/mg蛋白质表示。
, 百拇医药
(六)统计处理：所得数据以ONE WAY ANOVA 分析，结果以均值±标准差(
)表示，采用t检验。
结果
(一)ISO引起大鼠心肌坏死特点及核制备：实验组大鼠经皮下大剂量注射ISO 3 d，引起心肌坏死，表现为心肌组织由心内膜到心外膜有广泛大片坏死，坏死灶之间相互连接，肌纤维排列紊乱，肌浆网肿胀，细胞核凝固。ISO组动物血浆MDA和LDH水平显著增加，较对照组分别升高47%和72%(P<0.01)。心肌组织MDA和钙含量分别增加57%和80%(P<0.01)。本实验制备的心肌细胞核在显微镜下观察无细胞碎片污染，核蛋白质含量较匀浆低40倍，蛋白质与DNA含量比值仅为10～12，DNA 回收率约为17%～20%，各亚细胞组份标志酶的活性均低于5%。ISO组心系数显著增加35%(P<0.01)，但匀浆得率和细胞核得率显著降低25%和31%，提示心肌明显肿胀。结果如表1所示。
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表1 ISO心肌坏死大鼠血浆LDH和MDA、心肌MDA和钙含量的变化
Tab 1 Plasma level of LDH and MDA,and myocardial content of calcium
and MDA in ISO induced cardiac necrosis(，n=10)
Plasma
Myocardium
Homogenate
yield
, 百拇医药
(mg/g WW)
Heart W/
body W
(mg/g)
Nucleus
yield
(mg/g WW)
LDH
(U/L)
MDA
(nmol/L)
MDA
, http://www.100md.com (nmol/mg pr)
Ca2+
(nmol/mg pr)
Control
1.19±0.11
13.94±0.91
1.06±0.05
4.18±0.91
136.7±4.6
3.87±0.42
1.44±0.13
, 百拇医药 ISO
2.05±0.04**
20.52±0.79**
1.67±0.07**
7.53±0.70**
102.9±11.8**
5.22±0.25**
1.00±0.07*
*P<0.05, **P<0.01,vs control
, 百拇医药
(二)大鼠ISO坏死心肌细胞核Ca2+-ATPase活性的变化：ISO组坏死心肌细胞核Ca2+-ATPase的[Ca2+]反应最大反应速度(Vmax)较对照组降低27.5%(P<0.01),Ka增加43%，但无显著差异(P>0.05)。如表2和图1所示。在[Ca2+]为400 nmol/L时，ISO组心肌细胞核对[ATP]反应的Vmax较对照组略低，也无显著差异，Km增加61.7%(P<0.05),如表2和图2所示。
Fig 1 [Ca2+]-response of myocardial nuclear Ca2+-ATPase in isoproterenol induced rat myocardial necrosis(,n=4)
, 百拇医药
图1 ISO坏死大鼠心肌细胞核钙泵活性对[Ca2+]反应的变化
Fig 2 [ATP]-response of myocardial nuclear Ca2+-ATPase in isoproterenol induced rat myocardial necrosis(,n=4)
, 百拇医药
图2 ISO坏死大鼠心肌细胞核钙泵活性对[ATP]反应的变化
表2 大鼠心肌坏死时心肌细胞核Ca2+-ATPase的动力学改变
Tab 2 Kinetic changes of myocardial nuclear Ca2+-ATPase in rat
myocardial necrosis (,n=4)
[Ca2+]-dependent
[ATP]-dependent
, 百拇医药
Vmax
(nmol/min.mg)
Ka
(nmol/L)
Vmax
(nmol/min.mg)
Km
(mmol/L)
Control
107±9
474±170
59±11
, 百拇医药
0.222±0.064
ISO
78±4**
679±303*
41±11
0.359±0.066*
*P<0.05, **P<0.01, vs control
(三)大鼠ISO坏死心肌细胞核45Ca2+摄取的变化：在ATP存在下，心肌细胞核对[45Ca2+]摄取具有[Ca2+]依赖性。ISO组心肌细胞核在[Ca2+]各浓度点45Ca2+摄取均显著低于对照组(P<0.01)。其Vmax与对照组相比降低46.1%，分别为(1020±320) pmol/L vs (1891±559) pmol/mg,P<0.01，Km无显著变化，分别为(286±110) vs (332±55) nmol/L。结果如图3所示。
, 百拇医药
Fig 3 Changes of myocardial nuclear 45Ca2+ in isoproterenol induced myocardial necrosis in rat.(,n=6,)
图3 ISO坏死心肌细胞核钙摄取的变化
讨论
儿茶酚胺大量释放引起的心肌损伤是心肌缺血、心肌梗塞、心力衰竭等许多疾病的重要环节之一，其机制与儿茶酚胺引起的脂质过氧化和细胞内钙超载有关[7]。细胞钙超载被认为是细胞不可逆损伤共同通路[8]。对于心肌损伤时钙通道、Na+-Ca2+交换以及肌浆网钙摄入、释放的稳态调节失衡改变，目前已有较清楚阐明。以往认为，细胞核和胞浆之间无特异的钙屏障，二者的游离钙是相互平衡的。但近年发现，在细胞核上也存在Ca2+的转运结合和释放等调节成分。如在肝细胞和海胆卵细胞发现，细胞核被膜上存在钙泵和IP3系统，在细胞核内还存在钙调素、PKC、calpain等多种钙结合蛋白。日益增多的证据提示，核内存在一个独立于胞浆Ca2+的主动转运系统，核钙稳态的失衡可能参与许多病理生理过程。我们曾经报告了大鼠和家兔心肌细胞核钙泵(Ca2+-ATPase),能主动摄取[45Ca2+]，其活性受[Ca2+]和[ATP]浓度依赖，并被核蛋白磷酸化调节[9，10]。但迄今心肌缺血、坏死等损伤时细胞核钙转运的影响尚不清楚。
, 百拇医药
本工作大剂量皮下注射ISO造成弥散性、局灶性心肌坏死大鼠模型。其心脏增大、心肌组织钙积聚、脂质过氧化增强及细胞内酶(LDH)漏出。ISO组心肌组织匀浆和细胞核得率降低，即单位重量心肌组织的蛋白质和细胞核含量减少，提示由于心肌损伤坏死导致心肌水肿且单位重量的心肌细胞数目降低。采用分离纯化的心肌细胞核观察发现，损伤的心肌细胞核Ca2+-ATPase对[Ca2+]反应的Vmax显著降低，但Ka值无显著变化，表明核Ca2+-ATPase对Ca2+的亲和力无显著改变，而酶活性降低。这一现象可能在心肌损伤、钙超载的心肌细胞里具有适应性负反馈调节意义。ISO心肌损伤时核Ca2+-ATPase对[ATP]反应的Vmax有所降低，而Km显著增加，表明酶与ATP亲和力降低。用[45Ca2+]示踪，直接测定核Ca2+转运，发现ISO心肌损伤时核钙转运速率(Vmax)显著降低，与钙泵的改变一致。心肌细胞核的钙调节功能对心肌的核反应具有重要的意义，推测细胞核钙转运功能降低可能是导致坏死心肌重塑的重要环节之一。
, 百拇医药
综上所述，ISO致大鼠心肌坏死时，细胞核钙泵和[45Ca2+]转运的动力学特性发生显著改变，[45Ca2+]转运能力显著降低，其病理生理意义值得进一步研究。
参考文献
1 Czubryt MP,Ramjia WB,Gilchrist Jsc,et al.The presence and partitioning of calcium binding proteins in hepatic and cardiac nuclei.J Mol Cell Cardiol,1996,28:455.
2 Rona G,Chappel CL,Blalazs J,et al.An infarct like myocardial lesion and other toxic manifestations produced by isoproterenol in the rat.Am Physiol,1959,67:443.
, http://www.100md.com
3 Nicotera P,McConkey DJ,Jones DP,et al.ATP stimulates Ca2+ uptake and increases the free Ca concentration in isolated rat liver nuclei.Pro Natl Acad Sci USA,1989,86:453.
4 Jones LR,Beseech HRJr.Isolation of canine cardiac sarcolemmal vesicles.Meth Pharmacol,1984,5:1.
5 Bartifi T.Preparation of metal-chelate complexes and the design of steady-state kinetic experiments involving metal nucleotide complexes.Adv Cyclic Nucleotide Res,1979,10:219.
, 百拇医药
6 Dixom T G, Purdom M.Serum-5'-nucleotidase.J Clin Pathol,1954,7:341.
7 Buhler FR,Laragh JH,Holzgreve H.Cardiovascular remodeling and its correction toward a comprehensive strategy.Am J Med Sci,1993, 94(S4A):4A.
8 Clapham DE.Calcium signalling. Cell,1995,80:259.
9 王培勇，庞永政，苏静怡，等.兔心肌细胞核钙转运.生物化学与生物物理学报，1997，29(6)：567.
10 王培勇，汤健，庞永政，等.心肌细胞核Ca2+-ATPase活性特征的研究.北京医科大学学报，1997，10(29)：329.
(1997年10月8日收稿，1998年3月17日修回), 百拇医药
单位：北京医科大学心血管基础研究所病生室(北京 100083)
关键词：心肌；坏死；钙；细胞核；Ca2+转运ATP酶
异丙肾上腺素致大鼠心肌坏死时心肌 细胞核钙转运功能的变化 摘 要 目的：观察ISO心肌坏死时大鼠心肌细胞核钙转运系统的改变。方法：大鼠心肌坏死模型采用皮下注射ISO制备，心肌细胞核采用差速离心和密度梯度离心分离纯化，用酶学方法鉴定核的纯度及测定ATPase活性，用45Ca2+同位素法测定核钙摄取。结果：与对照组相比，ISO坏死心脏组织呈显著的损伤和坏死，心系数增加35%(P<0.01)，心肌组织MDA和钙含量分别增加57%和80%(P<0.01)。与对照组相比，ISO心肌坏死细胞核Ca-ATPase的[Ca2+]反应Vmax降低27.5%(P<0.01)，Ka无显著变化；对[ATP]反应的Vmax无显著变化，而Km增加61.7%(P<0.05)；ISO组45Ca2+摄取显著降低(P<0.01)，Vmax与对照组相比降低46.1%(P<0.01)，Km无显著变化。结论：坏死心肌细胞核钙转运系统功能显著降低，可能与心肌坏死时细胞核功能紊乱有关。
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Dysfunction of myocardial nuclear calcium transport in isoproterenol induced myocardial necrosis in rats
WANG Pei-Yong， YAO Xing-Hai,SU Jing-Yi,TANG Jian, TANG Chao-shu
Laboratory of Pathophysiology,Cardiovascular Basic Research Institute,Beijing Medical University, Beijing(100083)
Abstract AIM:Myocardial nuclear calcium transport was investigated on the model of isoproterenol(ISO)induced cardiac hypertrophy.METHODS:Rats were given injections of ISO subcutaneously(69 μmol.kg-1.d-1. for 3 days).Myocardial nuclei were purified with sucrose density centrifugation and identified zymologically,the activity of Ca2+-ATPase was measured zymologically and calcium uptake was assayed with [45 Ca2+]isotope.RESULTS:ISO-injured heart presented obvious myocardial injury and necrosis. The ratio of heart weight to body weight in ISO group increased by 35%(P<0.01).MDA and calcium content in myocardial tissue increased by 57% and 80% respectively(P<0.01 compared with control).Vmax to [Ca2+]and Km to [ATP]of ATPase activity decreased by about 27.5%和61.7% respectively(P<0.05).Significant decrease of nuclear[45Ca2+]uptake was observed and Vmax value was lowered by 46.1% compared with that of control(P<0.01),but Km value remained unchanged.CONCLUSION：Dysfunction of nuclear calcium transport in isoproterenol induced myocardial injury.
, 百拇医药
MeSH Myocardium; Necrosis; Calcium;Cell nucleus;Ca2+-transporting ATPase
Ca2+是细胞内重要的第二信使，不仅调节细胞的功能代谢，而且在细胞核内还对细胞分化、发育、增殖、坏死和凋亡等核功能也起重要作用。近年发现，胞浆的Ca2+进入胞核，主要是通过核膜上的钙泵和核IP3受体等核钙主动转运系统调节，而不是通过核孔被动摄取[1]。心血管疾病时，核钙转运系统的变化及其意义，目前均不清楚。本工作在异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)心肌坏死大鼠模型上，观察心肌细胞核被膜钙泵(Ca-ATPase)活性和核[45Ca2+]摄取的变化，以探讨心肌损伤时心肌细胞核功能紊乱的可能机制。
材料和方法
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(一)材料与试剂：Wistar 大鼠由本校实验动物中心提供，isoproterenol、ATP-Na2、dithiothreiol(DTT)、phenylmethylsulfonyl fluride(PMSF)、phosphoenolpyrovate(PEP)、pyrovate kinase(PK)以及标志酶测定试剂购自Sigma Co., [45CaCl2]为Amersham产品。其余试剂均为国产GR或AR级，所用各溶液均以超纯水配制。
(二)大鼠异丙肾上腺素心肌坏死模型制备：雄性Wistar大鼠，体重100～150 g，按Rona等方法略作改良复制ISO心肌坏死模型[2]。ISO组(n=20)动物每日上午皮下注射ISO(69 μmol/kg)1次，连续注射3 d。对照组(n=20)动物生理盐水代替ISO皮下注射。全部动物于末次注射后24 h，以20%乌拉坦 (l g/kg,ip)麻醉，动脉放血处死动物，收集血液，4℃分离血浆。采用生化自动分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，用硫代巴比妥酸比色法测定脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量。开胸取心脏，称重，取心尖部位用10%福尔马林固定用于病理学检查，其余心肌用于以下实验。
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(三)心肌细胞核分离：参照文献[3]方法改进：大鼠心脏用冷TKM液冲洗(mmol/L:Tris/HCl 50.0,KCI 25.0,MgCl2 5.0,EGTA 1.0, DTT 1.0， PMSF 1.0,leupeptin 0.001,pH 7.4),剪碎后按1∶5(W/V)加入等渗匀浆介质(TKM含0.25 mol/L蔗糖和1.0 mmol/L EGTA)，内切式匀浆器低速(8 000 r/min)匀浆2.5 min,再经玻璃匀浆器匀浆，纱布过滤后离心(1 200×g, 10 min)，弃上清，将沉淀再匀浆和离心1次，加入1倍体积的含1.0 mol/L蔗糖-TKM液混匀，再加入3倍体积2.5 mol/L的蔗糖-TKM液，混匀离心，(120 000×g,60 min)后，收集沉淀即为心肌细胞核，于-70℃储存备用。采用Lowry法行蛋白质定量，二苯胺法行DNA定量。用原子吸收分光光度法测定钙含量。按文献方法测定下述亚细胞成分标识酶的活性：5’-核苷酸酶(肌质膜)、葡萄糖-6-磷酸酶(肌浆网)和琥珀酸脱氢酶(线粒体)[4～6]。用分离纯化的心肌细胞核进行下述实验。
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(四)核Ca2+-ATPase 活性测定[4]：反应液为(mmol/L):KCl 100.0，histidine 50.0,MgCl2 5.0,PEP 3.3,PK 15U/mL,EGTA 0.1， pH 7.0,加入50μg蛋白质的核，终反应体积为1.0 mL。采用双复管测定。反应液中的Ca2+浓度为100～3 200 nmol/L，通过EGTA与Ca2+的缓冲体系控制，根据Bartifi的多元缓冲对计算方法确定[5]，然后用Fura-2(10 μmol/L)荧光测定法核对。37℃预温5 min后，加入2.0 mmol/L的ATP始动反应，孵育10 min。加入终止液2.5 mL终止反应，测定无机磷产量。Ca2+-ATPase 活性为总ATPase活性与Mg2+-ATPase活性之差。酶活性单位为nmol/min.mg蛋白质。
, 百拇医药
(五)核[45Ca2+]转运测定[4]：反应液为(mmol/L):KCl 125.0, HEPES 20.0, MgCl2 5.0, pH7.0, ATP 2.0, EGTA 0.1, [45Ca2+]18.5 kBq, Ca2+浓度同Ca2+-ATPase测定，终体积0.5 mL。37℃预温5 min后通过加入0.2 mg蛋白质的核，始动反应，孵育一定时间后加入1mL 0.2mol/L MgCl2终止反应，在Millipore抽滤器上以0.45 μm微孔滤膜抽滤，用0.1 mol/L MgCl2冲洗3次。滤膜干燥后加入闪烁液，在β-液闪计数仪上测定[45Ca2+]放射性强度。同时做非特异摄入管，操作同上，但反应液中不含ATP。核[45Ca2+]转运=总摄入-非特异摄入，以pmol/mg蛋白质表示。
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(六)统计处理：所得数据以ONE WAY ANOVA 分析，结果以均值±标准差(
)表示，采用t检验。结果
(一)ISO引起大鼠心肌坏死特点及核制备：实验组大鼠经皮下大剂量注射ISO 3 d，引起心肌坏死，表现为心肌组织由心内膜到心外膜有广泛大片坏死，坏死灶之间相互连接，肌纤维排列紊乱，肌浆网肿胀，细胞核凝固。ISO组动物血浆MDA和LDH水平显著增加，较对照组分别升高47%和72%(P<0.01)。心肌组织MDA和钙含量分别增加57%和80%(P<0.01)。本实验制备的心肌细胞核在显微镜下观察无细胞碎片污染，核蛋白质含量较匀浆低40倍，蛋白质与DNA含量比值仅为10～12，DNA 回收率约为17%～20%，各亚细胞组份标志酶的活性均低于5%。ISO组心系数显著增加35%(P<0.01)，但匀浆得率和细胞核得率显著降低25%和31%，提示心肌明显肿胀。结果如表1所示。
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表1 ISO心肌坏死大鼠血浆LDH和MDA、心肌MDA和钙含量的变化
Tab 1 Plasma level of LDH and MDA,and myocardial content of calcium
and MDA in ISO induced cardiac necrosis(
，n=10)Plasma
Myocardium
Homogenate
yield
, 百拇医药
(mg/g WW)
Heart W/
body W
(mg/g)
Nucleus
yield
(mg/g WW)
LDH
(U/L)
MDA
(nmol/L)
MDA
, http://www.100md.com (nmol/mg pr)
Ca2+
(nmol/mg pr)
Control
1.19±0.11
13.94±0.91
1.06±0.05
4.18±0.91
136.7±4.6
3.87±0.42
1.44±0.13
, 百拇医药 ISO
2.05±0.04**
20.52±0.79**
1.67±0.07**
7.53±0.70**
102.9±11.8**
5.22±0.25**
1.00±0.07*
*P<0.05, **P<0.01,vs control
, 百拇医药
(二)大鼠ISO坏死心肌细胞核Ca2+-ATPase活性的变化：ISO组坏死心肌细胞核Ca2+-ATPase的[Ca2+]反应最大反应速度(Vmax)较对照组降低27.5%(P<0.01),Ka增加43%，但无显著差异(P>0.05)。如表2和图1所示。在[Ca2+]为400 nmol/L时，ISO组心肌细胞核对[ATP]反应的Vmax较对照组略低，也无显著差异，Km增加61.7%(P<0.05),如表2和图2所示。
Fig 1 [Ca2+]-response of myocardial nuclear Ca2+-ATPase in isoproterenol induced rat myocardial necrosis(
,n=4), 百拇医药
图1 ISO坏死大鼠心肌细胞核钙泵活性对[Ca2+]反应的变化
Fig 2 [ATP]-response of myocardial nuclear Ca2+-ATPase in isoproterenol induced rat myocardial necrosis(
,n=4), 百拇医药
图2 ISO坏死大鼠心肌细胞核钙泵活性对[ATP]反应的变化
表2 大鼠心肌坏死时心肌细胞核Ca2+-ATPase的动力学改变
Tab 2 Kinetic changes of myocardial nuclear Ca2+-ATPase in rat
myocardial necrosis (
,n=4)[Ca2+]-dependent
[ATP]-dependent
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Vmax
(nmol/min.mg)
Ka
(nmol/L)
Vmax
(nmol/min.mg)
Km
(mmol/L)
Control
107±9
474±170
59±11
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0.222±0.064
ISO
78±4**
679±303*
41±11
0.359±0.066*
*P<0.05, **P<0.01, vs control
(三)大鼠ISO坏死心肌细胞核45Ca2+摄取的变化：在ATP存在下，心肌细胞核对[45Ca2+]摄取具有[Ca2+]依赖性。ISO组心肌细胞核在[Ca2+]各浓度点45Ca2+摄取均显著低于对照组(P<0.01)。其Vmax与对照组相比降低46.1%，分别为(1020±320) pmol/L vs (1891±559) pmol/mg,P<0.01，Km无显著变化，分别为(286±110) vs (332±55) nmol/L。结果如图3所示。
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Fig 3 Changes of myocardial nuclear 45Ca2+ in isoproterenol induced myocardial necrosis in rat.(
,n=6,)图3 ISO坏死心肌细胞核钙摄取的变化
讨论
儿茶酚胺大量释放引起的心肌损伤是心肌缺血、心肌梗塞、心力衰竭等许多疾病的重要环节之一，其机制与儿茶酚胺引起的脂质过氧化和细胞内钙超载有关[7]。细胞钙超载被认为是细胞不可逆损伤共同通路[8]。对于心肌损伤时钙通道、Na+-Ca2+交换以及肌浆网钙摄入、释放的稳态调节失衡改变，目前已有较清楚阐明。以往认为，细胞核和胞浆之间无特异的钙屏障，二者的游离钙是相互平衡的。但近年发现，在细胞核上也存在Ca2+的转运结合和释放等调节成分。如在肝细胞和海胆卵细胞发现，细胞核被膜上存在钙泵和IP3系统，在细胞核内还存在钙调素、PKC、calpain等多种钙结合蛋白。日益增多的证据提示，核内存在一个独立于胞浆Ca2+的主动转运系统，核钙稳态的失衡可能参与许多病理生理过程。我们曾经报告了大鼠和家兔心肌细胞核钙泵(Ca2+-ATPase),能主动摄取[45Ca2+]，其活性受[Ca2+]和[ATP]浓度依赖，并被核蛋白磷酸化调节[9，10]。但迄今心肌缺血、坏死等损伤时细胞核钙转运的影响尚不清楚。
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本工作大剂量皮下注射ISO造成弥散性、局灶性心肌坏死大鼠模型。其心脏增大、心肌组织钙积聚、脂质过氧化增强及细胞内酶(LDH)漏出。ISO组心肌组织匀浆和细胞核得率降低，即单位重量心肌组织的蛋白质和细胞核含量减少，提示由于心肌损伤坏死导致心肌水肿且单位重量的心肌细胞数目降低。采用分离纯化的心肌细胞核观察发现，损伤的心肌细胞核Ca2+-ATPase对[Ca2+]反应的Vmax显著降低，但Ka值无显著变化，表明核Ca2+-ATPase对Ca2+的亲和力无显著改变，而酶活性降低。这一现象可能在心肌损伤、钙超载的心肌细胞里具有适应性负反馈调节意义。ISO心肌损伤时核Ca2+-ATPase对[ATP]反应的Vmax有所降低，而Km显著增加，表明酶与ATP亲和力降低。用[45Ca2+]示踪，直接测定核Ca2+转运，发现ISO心肌损伤时核钙转运速率(Vmax)显著降低，与钙泵的改变一致。心肌细胞核的钙调节功能对心肌的核反应具有重要的意义，推测细胞核钙转运功能降低可能是导致坏死心肌重塑的重要环节之一。
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综上所述，ISO致大鼠心肌坏死时，细胞核钙泵和[45Ca2+]转运的动力学特性发生显著改变，[45Ca2+]转运能力显著降低，其病理生理意义值得进一步研究。
参考文献
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, http://www.100md.com
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9 王培勇，庞永政，苏静怡，等.兔心肌细胞核钙转运.生物化学与生物物理学报，1997，29(6)：567.
10 王培勇，汤健，庞永政，等.心肌细胞核Ca2+-ATPase活性特征的研究.北京医科大学学报，1997，10(29)：329.
(1997年10月8日收稿，1998年3月17日修回), 百拇医药