血栓素A2、肿瘤坏死因子和地塞米松对兔气道平滑肌细胞增殖的影响*
作者：戚好文 刘振千 廖建军 李焕章
单位：第四军医大学西京医院呼吸内科(西安 710032)
关键词：血栓烷A2；肿瘤坏死因子；肌；平滑；增生；地塞米松
中国病理生理杂志990506 摘 要 目的：探讨血栓素A2(TXA2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、地塞米松(Dex)对气管平滑肌细胞(ASMC)增生的影响。方法：[3H]-TdR掺入法及细胞计数检测上述因素作用下体外培养ASMC增生过程。结果：TXA2可刺激ASMC增生，TNF-α能抑制TXA2的促增生作用，Dex又可使TNF-α的抑增生作用消失。结论：TXA2、TNF-α在ASMC增生中起重要作用，Dex在治疗哮喘过程中，有可能加重ASMC的增生。
, http://www.100md.com
Effects of thromboxane A2, tumor necrosis factor-α and dexamethasone on the proliferation of ASMC in rabbit
QI Hao-Wen，LIU Zhen-Qian， LIAO Jian-Jun， LI Huan-Zhang
Respiratory Department of Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xian(710032)
Abstract AIM:To study the effects of thromboxane A2(TXA2), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and dexamethasone (Dex) on the proliferation of airway smooth muscle cell (ASMC).METHODS：The amount of [3 H]-thymidine incorporation into ASMC and cell number were counted before and after the use of TXA2, TNF-α and Dex. RESULTS：TXA2 could stimulate ASMC proliferation while TNF-α inhibits it's proliferation in response to TXA2, Dex could reverse the action of TXA2.CONCLUSION：TXA2, TNF-α might have important functions in ASMC hyperplasia. Dex might increase proliferation of ASMC in the treatment of asthma.
, 百拇医药
MeSH Thromboxane A2; Tumor necrosis factor; Muscle, smooth; Hyperplasia; Dexamethasone
哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，许多炎症细胞释放的多种炎症介质与哮喘气道狭窄的发生、发展有密切关系[1]。有研究表明，ASMC增生是哮喘气道狭窄的重要病理改变[2，3]。本文通过细胞培养方法探讨哮喘炎症介质TXA2、TNF-α及地塞米松Dex对家兔ASMC增生的影响，以阐明ASMC增生的机制。
材料与方法
(一)动物：雄性新西兰家兔，体重1.5 kg，由本校实验动物中心提供。
(二)主要试剂：TXA2(美国Sigma公司)，TNF-α(军事医学科学院)，[3H]-胸苷嘧啶([3H]-TdR,北京原子能研究所)，抗α肌动蛋白抗体(美国ZYMED)，DMEM(美国，Sigma)，NIH/3T3细胞由本校口腔医院中心实验室提供。
, http://www.100md.com
(三)细胞培养：放血处死动物，无菌取出气管，剥去外膜，利器刮尽内膜上皮，用含抗菌素的生理盐水冲洗后剪下C型软骨接口处平滑肌，制成1 mm×1 mm×1 mm小块，置于0.5%混合型胶原酶溶液中，37℃消化12～16 h。用含10%胎牛血清(FCS)的DMEM冲洗、过滤、离心后制成细胞悬液，接种于培养瓶内。待瓶内细胞达到80%融合后，1∶2消化传代，取4～6代细胞用于实验[5，6]。
(四)平滑肌细胞的鉴定：主要依据形态学及免疫组织化学。镜下观察培养的平滑肌细胞排列成漩涡状，抗平滑肌α-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色，也证实为平滑肌细胞[3]。
(五)TXA2、TNF-α、Dex对ASMC增生的影响：以4×103个/孔将细胞接种于96孔培养板内， 经含10%FCS的DMEM培养72 h后，细胞达到融合状态，吸去上清液，无血清DEME清洗两遍，加入1%FCS的DMEM，培养12 h后按下列步骤实验。
, 百拇医药
1.TXA2组：加入环-TXA2(为TXA2的稳定替代物，以下简称TXA2)，使其终浓度为100 nmol/L。2.TNF-α组：加入TNF-α(终浓度300 pmol/L)。 3. TNF-α+TXA2组：用300 pmol/L的TNF-α预培养ASMC 4 h后，加入TXA2，使其终浓度为100 nmol/L。4.TNF-α+TXA2+Dex组：Dex(终浓度2 μmol/L)孵育ASMC 2 h后，用TNF-α(终浓度300 pmol/L)再预培养3 h，再加入TXA2(终浓度100 nmol/L)。5.空白对照组：不加上述任何因子，同时观察1% FCS对[3H]-TdR掺入量的影响。6.平行对照组：将TXA2(终浓度100 nmol/L)加入对数生长期的NIH/3T3细胞。
经上述处理后，每孔加[3H]-TdR 1.85×104 Bq/50 μL继续孵育18 h，终止时弃去上清液，胰酶消化、收集细胞，洗涤干燥后，测每分钟放射性核素闪烁计数值(counts.min-1)。
, 百拇医药
(六)细胞计数：将ASMC以8×104个/瓶接种于25 mL培养瓶内，按上述方式预培养后，改用1%FCS的DMEM，给予TXA2(终末浓度为100 nmol/L),TNF-α(300 pmol/L)+TXA2(100 nmol/L)及TXA2(100 nmol/L)+TNF-α(300 pmol/L)+Dex(100 nmol/L)，并分别于第1、3、6 d胰酶消化计数。
(七)统计处理：各项结果以均数±标准差(
)表示，结果统计采用t检验。
结果
运用[3H]-TdR掺入法，6 h孵育后，经检测TXA2组中ASMC放射值明显高于对照组，TNF-α预处理后再加入TXA2，ASMC中放射值与对照组无显著差异，显著低于TXA2组，当用Dex预先孵育ASMC后再用TNF-α及TXA2处理ASMC，则其[3H]-TdR掺入量又明显高于TNF-α+TXA2组及对照组，而3T3细胞应用TXA2后则无改变(表1)。
, 百拇医药
表1 TXA2、TNF-α、Dex对ASMC[3H]-TdR掺入的影响
Tab 1 Effects of TXA2，TNF-α and Dex on [3H]-TdR
incorporation into ASMC (,n=8)
ASMC(counts.min-1)
3T3(counts.min-1)
Control
, 百拇医药
370±34
511±40
TNF-α
394±40
506±43
TXA2
1481±97*＃
512±47
TXA2+TNF-α
431±27
508±51
TXA2+TNF-α+Dex
, 百拇医药
1 387±60*#
516±57
*P<0.01, vs control group; #P<0.01, vs TXA2+TNF-α group
经数天培养后，细胞计数亦显示TXA2组细胞数显著高于对照组，TXA2+TNF-α组则与对照组无显著差异(表2)。1%FCS对[3H]-TdR掺入ASMC无影响(表1)。
表2 TXA2、TNF-α对ASMC增殖的影响
Tab 2 Effects of TXA2 and TNF-α on proliferation
, 百拇医药
of ASMC (,n=9)
Cell counts(×104/mL)
Day1
Day2
Day3
Control
1.80±0.25
1.78±0.02
1.84±0.04
TXA2
, 百拇医药
1.88±0.20
2.70±0.04*
3.70±0.11*
TXA2+TNF-α
1.81±0.35
1.82±0.05＃
1.90±0.17#
TXA2+TNF-α+Dex
1.83±0.33
2.58±0.04#
, 百拇医药
3.75±0.10#
*P<0.05, vs control group; ＃P<0.05, vs TXA2 group
讨论
气道组织结构重塑(airway re-modelling)是哮喘气道狭窄的主要病理改变[2，4]，组胺、内皮素等可刺激体外培养的ASMC增生[5，6]，TXA2、TNF-α亦是哮喘发病过程中的重要炎症介质，有关它们与ASMC增生的关系尚未见报道。
本研究结果提示，TXA2组的[3H]-TdR掺入量显著高于1%FCS对照组，表明TXA2具有刺激ASMC DNA合成、促ASMC增生作用。当预先加入TNF-α再加入TXA2后，其[3H]-TdR掺入量与1%FCS组无明显差异，表明TNF-α对TXA2的促增生作用具有逆转作用，同时也提示TNF-α对ASMC增生有抑制作用。预先用Dex孵育ASMC后，再用TNF-α及TXA2处理ASMC，则其[3H]-TdR的掺入量又明显高于TNF-α+TXA2组，表明Dex可使TNF-α的抑制增生作用消失，这也提示Dex在发挥抗炎、抗过敏、缓解气道平滑肌痉挛的治疗作用的同时，还有加重哮喘气道壁增厚的不利一面。3T3细胞对TXA2、TNF-α、Dex均无反应，提示TXA2的促增殖作用有组织选择性，这可能与细胞膜上这些因子的受体类型及激活细胞内的信号途径不同有关[7]。细胞计数亦表明，TXA2可刺激ASMC增生，TNF-α则抑制其增生，Dex又可使TNF-α的抑增生作用消失。
, 百拇医药
TXA2能激活磷脂酶A2，磷脂酶A2的激活可产生LTD4，用阿的平阻断磷脂酶A2的活性后，ASMC的增生则受到抑制，当向处于静止状态的ASMC中加入LTD4时，ASMC可出现增殖反应[8]。因此，LTD4是TXA2促ASMC增生的最终介质。
TNF受体的激活往往伴有磷脂酶A2的激活及花生四烯酸的代谢[9]，当磷脂酶A2、5-磷脂氧化酶、环加氧酶的活性被抑制后，即阻断了花生四烯酸及其代谢产物的产生，TNF-α抗增生作用并未消失，表明TNF-α抗增生作用，并不是通过花生四烯酸的代谢产物来实现的。
对TNF-α的抗增生作用目前只能认为是一种非选择性的，因为凝血酶、FCS、TXA2、EGF等对ASMC的促增生作用均能被TNF-α抑制，而这些促增生因子可分为GPT结合蛋白连接型受体激动剂(TXA2、凝血酶)和激活内源性酪氨酸蛋白激酶受体型激动剂(EGF、FCS主要为PDGF)，因此，TNF-α只能是作用于这些酶激活后的下面共同传导途径来抑制ASMC的增生，故是非选择性的。Dex对TNF-α的拮抗作用可能是Dex干扰了TNF-α的上述作用。
, 百拇医药
气道肌层增厚是引起气道狭窄的主要因素。TXA2具有促ASMC增生作用，TNF-α可抑制TXA2的促ASMC增生作用，因此，TNF-α在哮喘发病中还有抑制ASMC增生的作用。糖皮质激素是哮喘治疗的有效药物，但长期使用疗效下降，可能与其促进ASMC增生、加重气道壁增厚有关。
*国家自然科学基金资助(39370325)
参考文献
1 Key AB. Inflammatory cells in acute and chronic asthma. Am Rev Respir Dis, 1987, 135:S63.
2 Pare PD. Hyperplasia and hypertrophy of airway smooth muscle in asthma:the change of airway hyperresponsiveness? Eur Respir J, 1993, 6:228S.
, http://www.100md.com
3 James AL, Pare PD,Hogg JC. The mechanics of airway narrowing in asthma. Am Rev Respir Dis, 1989, 139:242.
4 Ebna M, Yaegeashi H, Chiba R, et al. Hyperreactive site in the airway tree of asthmatic patients revealed by thickening of bronchial muscles. Am Rev Respir Dis, 1990, 141:1327.
5 Pannettieri KA, Yadvish PA, Kelly AM, et al. Histamine stimulates proliferation of airway smooth muscle and induces c-fos expression. Am J Physiol, 1990, 259:L365.
, http://www.100md.com
6 Glassberg MK, Ergul A, Wanner A, et al. Endothelin-1 promotes mitogenesis in airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994,10:316.
7 Reidy MA. Factors controlling smooth-muscle cells proliferation. Arch Pathol Lab Med, 1992, 116:1276.
8 Noveral JP, Grunstein MM. Role and mechanism of thromboxane-induced proliferation of cultured ASM cells. Am J Physiol, 1992, 263:L555.
9 Schalkwijk C, Vervoordeldonk M, Pfeilschiffer J, et al. Cytokine and forskolin-induced synthesis of group Ⅱ phospholipase A2 and prostaglandin E2 in rat mesangial cells is prevented by dexamethasone. Biochem Bilphys Res Commun, 1991, 180:46.
(1997年10月7日收稿，1998年9月21日修回), 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院呼吸内科(西安 710032)
关键词：血栓烷A2；肿瘤坏死因子；肌；平滑；增生；地塞米松
中国病理生理杂志990506 摘 要 目的：探讨血栓素A2(TXA2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、地塞米松(Dex)对气管平滑肌细胞(ASMC)增生的影响。方法：[3H]-TdR掺入法及细胞计数检测上述因素作用下体外培养ASMC增生过程。结果：TXA2可刺激ASMC增生，TNF-α能抑制TXA2的促增生作用，Dex又可使TNF-α的抑增生作用消失。结论：TXA2、TNF-α在ASMC增生中起重要作用，Dex在治疗哮喘过程中，有可能加重ASMC的增生。
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Effects of thromboxane A2, tumor necrosis factor-α and dexamethasone on the proliferation of ASMC in rabbit
QI Hao-Wen，LIU Zhen-Qian， LIAO Jian-Jun， LI Huan-Zhang
Respiratory Department of Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xian(710032)
Abstract AIM:To study the effects of thromboxane A2(TXA2), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and dexamethasone (Dex) on the proliferation of airway smooth muscle cell (ASMC).METHODS：The amount of [3 H]-thymidine incorporation into ASMC and cell number were counted before and after the use of TXA2, TNF-α and Dex. RESULTS：TXA2 could stimulate ASMC proliferation while TNF-α inhibits it's proliferation in response to TXA2, Dex could reverse the action of TXA2.CONCLUSION：TXA2, TNF-α might have important functions in ASMC hyperplasia. Dex might increase proliferation of ASMC in the treatment of asthma.
, 百拇医药
MeSH Thromboxane A2; Tumor necrosis factor; Muscle, smooth; Hyperplasia; Dexamethasone
哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，许多炎症细胞释放的多种炎症介质与哮喘气道狭窄的发生、发展有密切关系[1]。有研究表明，ASMC增生是哮喘气道狭窄的重要病理改变[2，3]。本文通过细胞培养方法探讨哮喘炎症介质TXA2、TNF-α及地塞米松Dex对家兔ASMC增生的影响，以阐明ASMC增生的机制。
材料与方法
(一)动物：雄性新西兰家兔，体重1.5 kg，由本校实验动物中心提供。
(二)主要试剂：TXA2(美国Sigma公司)，TNF-α(军事医学科学院)，[3H]-胸苷嘧啶([3H]-TdR,北京原子能研究所)，抗α肌动蛋白抗体(美国ZYMED)，DMEM(美国，Sigma)，NIH/3T3细胞由本校口腔医院中心实验室提供。
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(三)细胞培养：放血处死动物，无菌取出气管，剥去外膜，利器刮尽内膜上皮，用含抗菌素的生理盐水冲洗后剪下C型软骨接口处平滑肌，制成1 mm×1 mm×1 mm小块，置于0.5%混合型胶原酶溶液中，37℃消化12～16 h。用含10%胎牛血清(FCS)的DMEM冲洗、过滤、离心后制成细胞悬液，接种于培养瓶内。待瓶内细胞达到80%融合后，1∶2消化传代，取4～6代细胞用于实验[5，6]。
(四)平滑肌细胞的鉴定：主要依据形态学及免疫组织化学。镜下观察培养的平滑肌细胞排列成漩涡状，抗平滑肌α-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色，也证实为平滑肌细胞[3]。
(五)TXA2、TNF-α、Dex对ASMC增生的影响：以4×103个/孔将细胞接种于96孔培养板内， 经含10%FCS的DMEM培养72 h后，细胞达到融合状态，吸去上清液，无血清DEME清洗两遍，加入1%FCS的DMEM，培养12 h后按下列步骤实验。
, 百拇医药
1.TXA2组：加入环-TXA2(为TXA2的稳定替代物，以下简称TXA2)，使其终浓度为100 nmol/L。2.TNF-α组：加入TNF-α(终浓度300 pmol/L)。 3. TNF-α+TXA2组：用300 pmol/L的TNF-α预培养ASMC 4 h后，加入TXA2，使其终浓度为100 nmol/L。4.TNF-α+TXA2+Dex组：Dex(终浓度2 μmol/L)孵育ASMC 2 h后，用TNF-α(终浓度300 pmol/L)再预培养3 h，再加入TXA2(终浓度100 nmol/L)。5.空白对照组：不加上述任何因子，同时观察1% FCS对[3H]-TdR掺入量的影响。6.平行对照组：将TXA2(终浓度100 nmol/L)加入对数生长期的NIH/3T3细胞。
经上述处理后，每孔加[3H]-TdR 1.85×104 Bq/50 μL继续孵育18 h，终止时弃去上清液，胰酶消化、收集细胞，洗涤干燥后，测每分钟放射性核素闪烁计数值(counts.min-1)。
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(六)细胞计数：将ASMC以8×104个/瓶接种于25 mL培养瓶内，按上述方式预培养后，改用1%FCS的DMEM，给予TXA2(终末浓度为100 nmol/L),TNF-α(300 pmol/L)+TXA2(100 nmol/L)及TXA2(100 nmol/L)+TNF-α(300 pmol/L)+Dex(100 nmol/L)，并分别于第1、3、6 d胰酶消化计数。
(七)统计处理：各项结果以均数±标准差(
)表示，结果统计采用t检验。结果
运用[3H]-TdR掺入法，6 h孵育后，经检测TXA2组中ASMC放射值明显高于对照组，TNF-α预处理后再加入TXA2，ASMC中放射值与对照组无显著差异，显著低于TXA2组，当用Dex预先孵育ASMC后再用TNF-α及TXA2处理ASMC，则其[3H]-TdR掺入量又明显高于TNF-α+TXA2组及对照组，而3T3细胞应用TXA2后则无改变(表1)。
, 百拇医药
表1 TXA2、TNF-α、Dex对ASMC[3H]-TdR掺入的影响
Tab 1 Effects of TXA2，TNF-α and Dex on [3H]-TdR
incorporation into ASMC (
,n=8)ASMC(counts.min-1)
3T3(counts.min-1)
Control
, 百拇医药
370±34
511±40
TNF-α
394±40
506±43
TXA2
1481±97*＃
512±47
TXA2+TNF-α
431±27
508±51
TXA2+TNF-α+Dex
, 百拇医药
1 387±60*#
516±57
*P<0.01, vs control group; #P<0.01, vs TXA2+TNF-α group
经数天培养后，细胞计数亦显示TXA2组细胞数显著高于对照组，TXA2+TNF-α组则与对照组无显著差异(表2)。1%FCS对[3H]-TdR掺入ASMC无影响(表1)。
表2 TXA2、TNF-α对ASMC增殖的影响
Tab 2 Effects of TXA2 and TNF-α on proliferation
, 百拇医药
of ASMC (
,n=9)Cell counts(×104/mL)
Day1
Day2
Day3
Control
1.80±0.25
1.78±0.02
1.84±0.04
TXA2
, 百拇医药
1.88±0.20
2.70±0.04*
3.70±0.11*
TXA2+TNF-α
1.81±0.35
1.82±0.05＃
1.90±0.17#
TXA2+TNF-α+Dex
1.83±0.33
2.58±0.04#
, 百拇医药
3.75±0.10#
*P<0.05, vs control group; ＃P<0.05, vs TXA2 group
讨论
气道组织结构重塑(airway re-modelling)是哮喘气道狭窄的主要病理改变[2，4]，组胺、内皮素等可刺激体外培养的ASMC增生[5，6]，TXA2、TNF-α亦是哮喘发病过程中的重要炎症介质，有关它们与ASMC增生的关系尚未见报道。
本研究结果提示，TXA2组的[3H]-TdR掺入量显著高于1%FCS对照组，表明TXA2具有刺激ASMC DNA合成、促ASMC增生作用。当预先加入TNF-α再加入TXA2后，其[3H]-TdR掺入量与1%FCS组无明显差异，表明TNF-α对TXA2的促增生作用具有逆转作用，同时也提示TNF-α对ASMC增生有抑制作用。预先用Dex孵育ASMC后，再用TNF-α及TXA2处理ASMC，则其[3H]-TdR的掺入量又明显高于TNF-α+TXA2组，表明Dex可使TNF-α的抑制增生作用消失，这也提示Dex在发挥抗炎、抗过敏、缓解气道平滑肌痉挛的治疗作用的同时，还有加重哮喘气道壁增厚的不利一面。3T3细胞对TXA2、TNF-α、Dex均无反应，提示TXA2的促增殖作用有组织选择性，这可能与细胞膜上这些因子的受体类型及激活细胞内的信号途径不同有关[7]。细胞计数亦表明，TXA2可刺激ASMC增生，TNF-α则抑制其增生，Dex又可使TNF-α的抑增生作用消失。
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TXA2能激活磷脂酶A2，磷脂酶A2的激活可产生LTD4，用阿的平阻断磷脂酶A2的活性后，ASMC的增生则受到抑制，当向处于静止状态的ASMC中加入LTD4时，ASMC可出现增殖反应[8]。因此，LTD4是TXA2促ASMC增生的最终介质。
TNF受体的激活往往伴有磷脂酶A2的激活及花生四烯酸的代谢[9]，当磷脂酶A2、5-磷脂氧化酶、环加氧酶的活性被抑制后，即阻断了花生四烯酸及其代谢产物的产生，TNF-α抗增生作用并未消失，表明TNF-α抗增生作用，并不是通过花生四烯酸的代谢产物来实现的。
对TNF-α的抗增生作用目前只能认为是一种非选择性的，因为凝血酶、FCS、TXA2、EGF等对ASMC的促增生作用均能被TNF-α抑制，而这些促增生因子可分为GPT结合蛋白连接型受体激动剂(TXA2、凝血酶)和激活内源性酪氨酸蛋白激酶受体型激动剂(EGF、FCS主要为PDGF)，因此，TNF-α只能是作用于这些酶激活后的下面共同传导途径来抑制ASMC的增生，故是非选择性的。Dex对TNF-α的拮抗作用可能是Dex干扰了TNF-α的上述作用。
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气道肌层增厚是引起气道狭窄的主要因素。TXA2具有促ASMC增生作用，TNF-α可抑制TXA2的促ASMC增生作用，因此，TNF-α在哮喘发病中还有抑制ASMC增生的作用。糖皮质激素是哮喘治疗的有效药物，但长期使用疗效下降，可能与其促进ASMC增生、加重气道壁增厚有关。
*国家自然科学基金资助(39370325)
参考文献
1 Key AB. Inflammatory cells in acute and chronic asthma. Am Rev Respir Dis, 1987, 135:S63.
2 Pare PD. Hyperplasia and hypertrophy of airway smooth muscle in asthma:the change of airway hyperresponsiveness? Eur Respir J, 1993, 6:228S.
, http://www.100md.com
3 James AL, Pare PD,Hogg JC. The mechanics of airway narrowing in asthma. Am Rev Respir Dis, 1989, 139:242.
4 Ebna M, Yaegeashi H, Chiba R, et al. Hyperreactive site in the airway tree of asthmatic patients revealed by thickening of bronchial muscles. Am Rev Respir Dis, 1990, 141:1327.
5 Pannettieri KA, Yadvish PA, Kelly AM, et al. Histamine stimulates proliferation of airway smooth muscle and induces c-fos expression. Am J Physiol, 1990, 259:L365.
, http://www.100md.com
6 Glassberg MK, Ergul A, Wanner A, et al. Endothelin-1 promotes mitogenesis in airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994,10:316.
7 Reidy MA. Factors controlling smooth-muscle cells proliferation. Arch Pathol Lab Med, 1992, 116:1276.
8 Noveral JP, Grunstein MM. Role and mechanism of thromboxane-induced proliferation of cultured ASM cells. Am J Physiol, 1992, 263:L555.
9 Schalkwijk C, Vervoordeldonk M, Pfeilschiffer J, et al. Cytokine and forskolin-induced synthesis of group Ⅱ phospholipase A2 and prostaglandin E2 in rat mesangial cells is prevented by dexamethasone. Biochem Bilphys Res Commun, 1991, 180:46.
(1997年10月7日收稿，1998年9月21日修回), 百拇医药