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编号:10271461
氧化LDL和抗氧化剂对人脐静脉内皮细胞信号转导物DAG的影响
http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 1999年第6期
     作者:严金川刘乃丰

    单位:刘乃丰 南京铁道医学院心血管内科(南京 210009);严金川 江苏省镇江第四人民医院心内科(镇江 212001)

    关键词:

    中国病理生理杂志990632 低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)发生氧化修饰形成氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, OX-LDL)是LDL致动脉粥样硬化(arteriosclerosis,AS)的关键步骤。OX-LDL具有细胞毒性作用,可以导致内皮细胞损伤,促进血管平滑肌细胞增殖,血小板积聚以及促进单核细胞对内皮细胞的粘附。抗氧化剂可以抑制OX-LDL形成,对细胞具有保护作用。近年来,有关细胞内信号转导与细胞功能的研究越来越引起人们关注,二酰基甘油是细胞内重要信息传导系统。本文研究采用薄层层析、放射自显影及放射酶标法检测OX-LDL对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)信号转导物二酰基甘油(diacylglycerol,DAG)的影响以及抗氧化剂维生素E的干预保护作用,以其揭示OX-LDL毒性作用的分子机制和预防措施。
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    材料与方法

    1.材料:脐带由本院产房提供,胎牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品,RPMI 1640培养基、VitE系美国Sigma公司产品,DAG KIT为Amersham公司产品,[γ-32P]ATP北京原子能公司产品,液闪计数仪为Beckman LS 5000 TD。

    2.方法:

    (1)人脐静脉内皮细胞培养:参照Lorenzi等无菌条件下取健康新生儿脐带25~30 cm,PBS冲洗干净后,灌入0.1%Ⅱ型胶原酶12~15 mL,37℃孵育15 min,分离、调节细胞数在3×105/mL,用RPMI1640培养液(含20%胎牛血清)接种于6孔培养板,2~3 d后细胞铺满板底,换液后用于实验,内皮细胞鉴定采用Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色。

    (2)LDL分离和氧化修饰:以单个不连续密度梯度超速离心快速分离人血浆LDL按Steinbrecher等方法进行氧化修饰,Cu2+的终浓度为20 μmol/L。
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    (3)实验分组:①对照组:内皮细胞中未加OX-LDL。②OX-LDL组:培养液中分别加入不同浓度的OX-LDL和同一浓度不同作用时间的OX-LDL。③VitE组:实验前4 h在培养液中加入不同浓度的VitE,然后加入OX-LDL作用10 min。

    (4)细胞内DAG的提取和测定:采用DAG激酶法,使DAG降解为磷脂酸(PA),加入[γ-P32]ATP标记,通过薄层层板、放射自显影术分离出由DAG降解的PA,取下显影点,液闪计数,根据标准曲线求出DAG的含量。

    3.统计:实验数据均以表示,采用小样本t检验进行统计处理。

    结果

    1.OX-LDL刺激内皮细胞产生DAG的时间曲线,DAG产生具有双时相性,分别在15 s和10 min出现2个峰值,其DAG含量分别为(448.50±8.40) pmol.L-1和(638.50±10.25) pmol.L-1,见图1。
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    Fig 1 Line graph showing time courses of formation of DAG induced by OX-LDL (100 μg/L) in cultured HUVEC (,n=5)

    图1 OX-LDL刺激人脐静脉内皮细胞产生DAG的时间曲线

    2.不同浓度OX-LDL对内皮细胞DAG含量的影响,如表1所示:OX-LDL作用内皮细胞10 min测得的DAG含量,随OX-LDL浓度增加而逐渐升高,与对照组相比具有显著差异(P<0.01),见表1。

    表1 不同浓度的OX-LDL作用人脐静脉内皮细胞

    10 min时产生DAG的影响
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    Tab 1 The effect of different concentrations of OX-LDL-stimulated

    formation on DAG in HUVEC(,n=5) OX-LDL(μg/L)

    DAG(pmol/L)

    0

    220.0±6.8

    50

    382.5±12.3**

    100

    638.5±10.2**
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    **P<0.01,vs control

    3.抗氧化剂VitE对OX-LDL干预内皮细胞产生DAG的影响,如表2所示,随着VitE浓度加大,DAG水平明显减少,具有浓度依赖效应,但仍较正常对照组为高。

    表2 VitE对OX-LDL刺激人脐静脉内皮细胞产生DAG的影响

    Tab 2 The effect of VitE on OX-LDL-stimulated formation

    of DAG in HUVEC(,n=5) Group

    DAG(pmol/L)

    Control
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    220.0±6.8

    OX-LDL (100 μg.L-1)

    638.5±10.2

    OX-LDL (100 μg.L-1)+VitE(50 mg/L)

    498.5±9.4**△

    OX-LDL (100 μg.L-1)+VitE(100 mg/L)

    410.5±8.2**△

    **P<0.01, vs OX-LDL; △P<0.01,vs control
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    讨论

    近年来,OX-LDL与细胞特异性受体结合通过激活胞内第二信使途径而发挥其生物效应,特别是二酰基甘油-蛋白激酶C(DAG-PKC)信号转导通路越来越受到普遍关注。DAG是细胞内重要的信使物质,它可将外界的刺激信号通过激活细胞内重要的蛋白激酶C(PKC),并磷酸化各种底物蛋白,产生相应的生物学效应。DAG主要来源于磷酸肌醇脂(IP)的转化和磷脂酰胆碱(PC)的裂解。研究表明,低密度脂蛋白特别是氧化修饰的LDL在致动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)中起重要作用,在人体和动物模型的粥样斑块中均发现大量OX-LDL积聚。Natarajan等研究发现OX-LDL能使血管平滑肌细胞增殖,并且是通过受体介导激活磷脂酶D产生DAG而促进DNA的合成。我们应用OX-LDL刺激内皮细胞DAG水平出现双时相变化,并且具有浓度依赖效应。这说明OX-LDL导致的DAG水平变化是由受体介导,其机理可能是通过受体途径使G蛋白变构激活磷脂酶C而水解IP和/或PC产生DAG短暂和缓慢持久升高的二个阶段,继之由DAG激活PKC而引起一系列细胞生物学效应。
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    维生素E是体内重要的抗氧化剂,大量实验证据进一步证实了抗氧化剂在AS中,具有保护内皮细胞的血管壁功能完整性,抑制平滑肌细胞增生。本实验应用VitE预先处理培养的内皮细胞,然后给予OX-LDL干预,结果发现DAG含量明显减少,呈浓度依赖效应;然而这种作用并未完全阻断,仅为部分抑制。新近研究发现,VitE不仅能抑制高糖引起的DAG/PKC途径激活,而且可以预防糖尿病导致的DAG/PKC信号转导通路异常引起的血流障碍。Tran等应用VitE预先处理人脐静脉内皮细胞后,发现其产生DAG的活性明显减弱,进一步研究证实VitE激活DAG激酶活性,加速了DAG的降解。这与我们的结果相似,因此,我们推测上述效应也是由于VitE激活了DAG激酶活性,导致DAG的含量降低。VitE抑制内皮细胞产生DAG可能是抗氧化剂在AS中起保护作用的重要机制。

    (1998年5月18日收稿,1999年元月11日修回), http://www.100md.com