动脉内皮损伤后平滑肌细胞维甲酸受体的表达及维甲酸的作用*
作者：李大主 曹林生 冯义柏 曾秋棠 李裕舒 毛 奕 宋建新
单位：
李大主 曹林生 冯义柏 曾秋棠 李裕舒 毛 奕 同济医科大学心血管病研究所(武汉 430022)；宋建新 同济医科大学同济医院传染科
关键词：动脉粥样硬化；维甲酸；家兔
中国病理生理杂志990611 摘 要 目的：研究动脉内皮损伤后VSMC中RAR表达的规律及其与内膜增生的关系。方法：放射配基法测量用维甲酸与未用药两组内皮损伤后不同时期的受体最大结合容量和平衡解离常数。同时用形态学方法测量血管内膜面积。结果：动脉内皮损伤后早期VSMC中RAR数量显著低于正常(P<0.01)，于第4周恢复正常，同时血管内膜面积增加，用维甲酸后，RAR显著增加，于术后2周即接近正常，血管内膜面积显著少于未用药组。结论：动脉损伤后早期RAR表达下调，维甲酸能向上调节其表达，RAR可能在动脉内皮损伤后的内膜增生中起重要作用。
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Retinoic acid receptor expression in arterial smooth muscle cells
after endothelial injury and effects of all-trans retinoic acid
LI Da-Zhu, CAO Lin-Sheng, FENG Yi-Bai, ZHEN Qiu-Tang, LI Yu-Shu, MAO Yi, SONG Jin-Xin
Institute of Cardiovascular Disease, Tongji Medical University, Wuhan (430022)
Abstract AIM: To investigate expression of retinoic acid receptor (RAR) in smooth muscle cells after endothelial injury and its relation to intimal hyperplasia. METHODS：Rabbits were divided into two groups:all-trans retinoic acid (RA) treated group and non-drug group, arteries were harvested 24h, 1, 2 and 4 weeks after injury. Receptor Bmax and KD were calculated by the use of [3 H]-RA radioligand binding method, neointimal area(IA) were measured morphologically.RESULTS：Compared with normal arteries, number of RAR in smooth muscle cells reduced significantly (P<0.01) in the first two weeks after injury, and recovered to normal in the 4th week, at the meantime, IA increased significantly. In RA treated group, RAR number increased significantly when compared with non-drug group, and were about to normal level 2 weeks after injury. IA decreased at the same time. CONCLUSION：RAR down regulation existed in the early stage after endothelial injury, RA upregulated RAR expression, RAR might play an important role in intimal hyperplasia after artery injury.
, 百拇医药
MeSH Atherosclerosis; Tretionin; Rabbits
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的迁移增殖是许多增生性血管疾病发生发展的重要环节[1]，而迁移增殖的VSMC绝大多数为未成熟的合成表型[2]。已知Vit A在组织细胞的发育分化中起重要作用，VSMC中存在与内源性Vit A结合的维甲酸受体(retinoic acid receptor, RAR)[3]，通过该受体，Vit A及其衍生物(如维甲酸，retinoic acid, RA)能调控VSMC向成熟分化[3，4]，防止其过度增殖。其它细胞系研究表明，细胞的低分化与RAR的低表达有关[5]，动脉损伤后VSMC的低分化及增殖是否与RAR的低表达有关目前尚无研究，本文就此进行探讨。
材料与方法
, 百拇医药
一、动脉内皮损伤模型的建立：
参照文献介绍的干燥法损伤动脉内皮细胞。简言之，新西兰家兔36只，雌雄不限，体重2～2.5 kg。氯胺酮(30 mg/kg)和安定(3 mg/kg)经静脉全麻下暴露双侧股动脉2 cm，其中32只暂时结扎游离动脉段两端，生理盐水冲洗管腔，再注入空气，持续8 min，解除结扎，恢复血流。32只动物随机分为2组：损伤对照组只喂饲料；损伤用药组每日经胃管灌入全反式维甲酸(atRA)(上海第六制药厂)20 mg。分别于术后24 h, 1、 2及4周处死动物，取损伤段血管液氮保存。另4只动物分离出血管后直接缝合皮肤，不损伤血管内皮，此为正常对照组，于术后第4周取动脉。所有动物均于术后当天起给予含2%胆固醇的饲料喂养。
二、组织处理：
参照文献方法进行组织处理[3]。每段动脉条取部份位置PBS液中清洗，剥去系膜组织，置含0.25%弹力酶Ⅰ和胶原酶的DMEM液中消化25 min以进一步去除系膜组织及内皮细胞。将消化后的血管条剪碎，匀浆，1 000×g离心5 min后弃上清，匀浆进行蛋白定量(考马斯亮兰法)。
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三、放射配体结合饱和实验：
结合反应在DMEM液中进行，反应总体积为200 μL，含匀浆100 μL， 3 H-atRA(Sigma公司)(2×10-6 mol/L浓度) 50 μL， 缓冲液50 μL。非特异结合管中加2×10-6～2×10-5 mol/L 的9-cis-RA 50 μL反应管在37℃水浴中温育30 min后加预冷的2 mL PBS液中止反应，1 000×g离心3 min，弃上清，再洗3次，以除去游离的RA，沉淀物行液闪计数。按Scatchard作图求受体最大结合容量(Bmax)和平衡解离常数(KD)。
四、形态学测量：
动脉段行常规固定、包埋、切片，HE及Van Gieson染色。自动图像处理系统测血管内膜面积。
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五、统计方法：
数据均用
表示，均数差异的显著性用t检验判定。
结果
一、动脉内皮损伤后VSMC中RAR的表达(表1)：
表1 内皮损伤对VSMC中RAR表达的影响及RA的作用
Tab 1 Expression of RAR in VSMC after endothelial injury and effect of RA(,n=8) Group(arteries)
No-RA
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RA
Bmax(nmol/mg.pro.)
KD(nmol/L)
Bmax(nmol/mg.pro.)
KD(nmol/L)
Normal
445.74±85.37
2.54±0.84
24 h
397.65±67.18
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2.47±0.75
405.83±87.42
1.95±0.72
1week
193.25±54.25**
1.87±0.57
297.66±68.27▲
2.37±0.81
2week
248.63±66.45**
1.75±0.63
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385.61±77.24▲
2.18±0.74
4week
394.27±80.52
2.14±0.68
413.25±85.46
2.35±0.89
**P<0.01, vs normal; ▲P<0.05, vs no-RA
动脉内皮损伤后1～2周，VSMC中RAR数量明显减少，至第4周接近正常，RAR亲和力无明显变化。
二、维甲酸的作用(表1)：
, 百拇医药
用RA组VSMC中RAR数量于损伤后1周明显低于正常，却明显高于未用药组，并提前于第2周恢复正常；维甲酸对RAR亲和力无影响。
三、维甲酸对内膜增生的影响(表2)：
表2 维甲酸对内皮损伤后血管内膜面积的影响
Tab 2 Effect of RA on intimal areas after endothelial injury () Group
n
No-RA(mm2)
RA(mm2)
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Normal
8
0.37±0.07
24h
8
0.34±0.08
0.35±0.08
1week
8
0.94±0.25*
0.75±0.28
2week
, 百拇医药
8
1.97±0.84**
1.13±0.37▲
4week
8
3.21±0.68**
1.76±0.27▲▲
*P<0.05,**P<0.01, vs normal;
▲P<0.05,▲▲P<0.01, vs No-RA;
用RA组，血管内膜面积自术后第2周起明显小于未用药组，作用稍迟于其对受体的影响，但显著抑制了内膜增厚。
, 百拇医药
讨论
VSMC的迁移，增殖和基质的分泌是动脉粥样硬化和动脉成形术后再狭窄的重要机制[1]。实验动物[2]和人[6]的粥样硬化细胞形态学研究均发现斑块中VSMC在形态学上表现为一未成熟的合成表型，并与VSMC的上述功能密切相关[4，7]。动脉损伤后VSMC的低分化的原因尚不清楚，业已证明Vit A在组织细胞的发育分化中起重要作用，机体的许多细胞系包括VSMC能表达一类识别Vit A的受体-维甲酸受体[3]，Vit A通过该受体调控组织细胞的生理性分化。对肿瘤细胞系的研究发现，细胞RAR的低表达与细胞的低分化以及细胞转移、无限制性生长的特性密切相关[5]。本研究表明，内皮损伤后1周内VSMC中RAR的表达下降，此时正是VSMC迁移的阶段，两者存在时间上的联系，并且RAR的低表达伴随着内膜的过度增生。用外源性细胞分化诱导剂at-RA使VSMC中RAR表达升高的同时，内膜增生明显受抑制，说明内皮损伤后RAR的表达状态与内膜的增生程度有内在联系。VSMC中RAR表达的调控机制尚不清楚，其它细胞系的研究认为RAR的下调是受体基因转录水平被抑制的结果，而at-RA通过与细胞核中的RAR结合一方面激活维甲酸反应单元产生相应的生物学效应，另一方面激活基因A，促进RAR自身的表达[5]，上调RAR的数量。阐明动脉损伤后RAR表达的抑制因素可能有助于防治动脉粥样硬化和动脉成形术后再狭窄。
, 百拇医药
* 日本心血管研究基金会内田国际资助
参考文献
1 Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993, 362:801.
2 Thyberg J, Hedin V, Sjolund M, et al. Regulation of differentiate properties and proliferation of artery smooth muscle cells. Arteriosclerosis, 1990, 10:966.
3 Miano JM, Topouzis S, Majesky MW, et al. Retinoic receptor expression and all-trans retinoic acid-induced growth inibition in VSMCs. Circultion, 1996, 93:1886.
, 百拇医药
4 Paoly RR, Passaniti A, Bilato L, et al. Migration of cultured vascular smooth muscle cells through a basement membrance barrier require type-Ⅳ collagenase activity and is inhibited by cellular differentiation. Circ Res, 1994, 75:41.
5 Takayama K, Toshi J, Uchida M, et al. Retinoic acid differentially up-regulates the gene expression of retinoic acid receptor and isoforms in embryo and adult rats. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 222(2):395.
, 百拇医药
6 Chen YH, Chen YL, Lin SJ, et al. Electron microscopic studies of phenotypic modulation of SMC in coronary arteries of patients with variant anginal pectoris and post-PTCA restenosis. Circulation, 1997, 95:1169.
7 李大主，宋建新，曹林生，等.维甲酸对动脉内皮损伤后血管壁t-PA含量的影响.中国病理生理杂志，1998，14：63.
(1998年7月2日收稿，1999年3月16日修回), 百拇医药
单位：
李大主 曹林生 冯义柏 曾秋棠 李裕舒 毛 奕 同济医科大学心血管病研究所(武汉 430022)；宋建新 同济医科大学同济医院传染科
关键词：动脉粥样硬化；维甲酸；家兔
中国病理生理杂志990611 摘 要 目的：研究动脉内皮损伤后VSMC中RAR表达的规律及其与内膜增生的关系。方法：放射配基法测量用维甲酸与未用药两组内皮损伤后不同时期的受体最大结合容量和平衡解离常数。同时用形态学方法测量血管内膜面积。结果：动脉内皮损伤后早期VSMC中RAR数量显著低于正常(P<0.01)，于第4周恢复正常，同时血管内膜面积增加，用维甲酸后，RAR显著增加，于术后2周即接近正常，血管内膜面积显著少于未用药组。结论：动脉损伤后早期RAR表达下调，维甲酸能向上调节其表达，RAR可能在动脉内皮损伤后的内膜增生中起重要作用。
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Retinoic acid receptor expression in arterial smooth muscle cells
after endothelial injury and effects of all-trans retinoic acid
LI Da-Zhu, CAO Lin-Sheng, FENG Yi-Bai, ZHEN Qiu-Tang, LI Yu-Shu, MAO Yi, SONG Jin-Xin
Institute of Cardiovascular Disease, Tongji Medical University, Wuhan (430022)
Abstract AIM: To investigate expression of retinoic acid receptor (RAR) in smooth muscle cells after endothelial injury and its relation to intimal hyperplasia. METHODS：Rabbits were divided into two groups:all-trans retinoic acid (RA) treated group and non-drug group, arteries were harvested 24h, 1, 2 and 4 weeks after injury. Receptor Bmax and KD were calculated by the use of [3 H]-RA radioligand binding method, neointimal area(IA) were measured morphologically.RESULTS：Compared with normal arteries, number of RAR in smooth muscle cells reduced significantly (P<0.01) in the first two weeks after injury, and recovered to normal in the 4th week, at the meantime, IA increased significantly. In RA treated group, RAR number increased significantly when compared with non-drug group, and were about to normal level 2 weeks after injury. IA decreased at the same time. CONCLUSION：RAR down regulation existed in the early stage after endothelial injury, RA upregulated RAR expression, RAR might play an important role in intimal hyperplasia after artery injury.
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MeSH Atherosclerosis; Tretionin; Rabbits
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的迁移增殖是许多增生性血管疾病发生发展的重要环节[1]，而迁移增殖的VSMC绝大多数为未成熟的合成表型[2]。已知Vit A在组织细胞的发育分化中起重要作用，VSMC中存在与内源性Vit A结合的维甲酸受体(retinoic acid receptor, RAR)[3]，通过该受体，Vit A及其衍生物(如维甲酸，retinoic acid, RA)能调控VSMC向成熟分化[3，4]，防止其过度增殖。其它细胞系研究表明，细胞的低分化与RAR的低表达有关[5]，动脉损伤后VSMC的低分化及增殖是否与RAR的低表达有关目前尚无研究，本文就此进行探讨。
材料与方法
, 百拇医药
一、动脉内皮损伤模型的建立：
参照文献介绍的干燥法损伤动脉内皮细胞。简言之，新西兰家兔36只，雌雄不限，体重2～2.5 kg。氯胺酮(30 mg/kg)和安定(3 mg/kg)经静脉全麻下暴露双侧股动脉2 cm，其中32只暂时结扎游离动脉段两端，生理盐水冲洗管腔，再注入空气，持续8 min，解除结扎，恢复血流。32只动物随机分为2组：损伤对照组只喂饲料；损伤用药组每日经胃管灌入全反式维甲酸(atRA)(上海第六制药厂)20 mg。分别于术后24 h, 1、 2及4周处死动物，取损伤段血管液氮保存。另4只动物分离出血管后直接缝合皮肤，不损伤血管内皮，此为正常对照组，于术后第4周取动脉。所有动物均于术后当天起给予含2%胆固醇的饲料喂养。
二、组织处理：
参照文献方法进行组织处理[3]。每段动脉条取部份位置PBS液中清洗，剥去系膜组织，置含0.25%弹力酶Ⅰ和胶原酶的DMEM液中消化25 min以进一步去除系膜组织及内皮细胞。将消化后的血管条剪碎，匀浆，1 000×g离心5 min后弃上清，匀浆进行蛋白定量(考马斯亮兰法)。
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三、放射配体结合饱和实验：
结合反应在DMEM液中进行，反应总体积为200 μL，含匀浆100 μL， 3 H-atRA(Sigma公司)(2×10-6 mol/L浓度) 50 μL， 缓冲液50 μL。非特异结合管中加2×10-6～2×10-5 mol/L 的9-cis-RA 50 μL反应管在37℃水浴中温育30 min后加预冷的2 mL PBS液中止反应，1 000×g离心3 min，弃上清，再洗3次，以除去游离的RA，沉淀物行液闪计数。按Scatchard作图求受体最大结合容量(Bmax)和平衡解离常数(KD)。
四、形态学测量：
动脉段行常规固定、包埋、切片，HE及Van Gieson染色。自动图像处理系统测血管内膜面积。
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五、统计方法：
数据均用
表示，均数差异的显著性用t检验判定。结果
一、动脉内皮损伤后VSMC中RAR的表达(表1)：
表1 内皮损伤对VSMC中RAR表达的影响及RA的作用
Tab 1 Expression of RAR in VSMC after endothelial injury and effect of RA(
,n=8) Group(arteries)No-RA
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RA
Bmax(nmol/mg.pro.)
KD(nmol/L)
Bmax(nmol/mg.pro.)
KD(nmol/L)
Normal
445.74±85.37
2.54±0.84
24 h
397.65±67.18
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2.47±0.75
405.83±87.42
1.95±0.72
1week
193.25±54.25**
1.87±0.57
297.66±68.27▲
2.37±0.81
2week
248.63±66.45**
1.75±0.63
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385.61±77.24▲
2.18±0.74
4week
394.27±80.52
2.14±0.68
413.25±85.46
2.35±0.89
**P<0.01, vs normal; ▲P<0.05, vs no-RA
动脉内皮损伤后1～2周，VSMC中RAR数量明显减少，至第4周接近正常，RAR亲和力无明显变化。
二、维甲酸的作用(表1)：
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用RA组VSMC中RAR数量于损伤后1周明显低于正常，却明显高于未用药组，并提前于第2周恢复正常；维甲酸对RAR亲和力无影响。
三、维甲酸对内膜增生的影响(表2)：
表2 维甲酸对内皮损伤后血管内膜面积的影响
Tab 2 Effect of RA on intimal areas after endothelial injury (
) Groupn
No-RA(mm2)
RA(mm2)
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Normal
8
0.37±0.07
24h
8
0.34±0.08
0.35±0.08
1week
8
0.94±0.25*
0.75±0.28
2week
, 百拇医药
8
1.97±0.84**
1.13±0.37▲
4week
8
3.21±0.68**
1.76±0.27▲▲
*P<0.05,**P<0.01, vs normal;
▲P<0.05,▲▲P<0.01, vs No-RA;
用RA组，血管内膜面积自术后第2周起明显小于未用药组，作用稍迟于其对受体的影响，但显著抑制了内膜增厚。
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讨论
VSMC的迁移，增殖和基质的分泌是动脉粥样硬化和动脉成形术后再狭窄的重要机制[1]。实验动物[2]和人[6]的粥样硬化细胞形态学研究均发现斑块中VSMC在形态学上表现为一未成熟的合成表型，并与VSMC的上述功能密切相关[4，7]。动脉损伤后VSMC的低分化的原因尚不清楚，业已证明Vit A在组织细胞的发育分化中起重要作用，机体的许多细胞系包括VSMC能表达一类识别Vit A的受体-维甲酸受体[3]，Vit A通过该受体调控组织细胞的生理性分化。对肿瘤细胞系的研究发现，细胞RAR的低表达与细胞的低分化以及细胞转移、无限制性生长的特性密切相关[5]。本研究表明，内皮损伤后1周内VSMC中RAR的表达下降，此时正是VSMC迁移的阶段，两者存在时间上的联系，并且RAR的低表达伴随着内膜的过度增生。用外源性细胞分化诱导剂at-RA使VSMC中RAR表达升高的同时，内膜增生明显受抑制，说明内皮损伤后RAR的表达状态与内膜的增生程度有内在联系。VSMC中RAR表达的调控机制尚不清楚，其它细胞系的研究认为RAR的下调是受体基因转录水平被抑制的结果，而at-RA通过与细胞核中的RAR结合一方面激活维甲酸反应单元产生相应的生物学效应，另一方面激活基因A，促进RAR自身的表达[5]，上调RAR的数量。阐明动脉损伤后RAR表达的抑制因素可能有助于防治动脉粥样硬化和动脉成形术后再狭窄。
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* 日本心血管研究基金会内田国际资助
参考文献
1 Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993, 362:801.
2 Thyberg J, Hedin V, Sjolund M, et al. Regulation of differentiate properties and proliferation of artery smooth muscle cells. Arteriosclerosis, 1990, 10:966.
3 Miano JM, Topouzis S, Majesky MW, et al. Retinoic receptor expression and all-trans retinoic acid-induced growth inibition in VSMCs. Circultion, 1996, 93:1886.
, 百拇医药
4 Paoly RR, Passaniti A, Bilato L, et al. Migration of cultured vascular smooth muscle cells through a basement membrance barrier require type-Ⅳ collagenase activity and is inhibited by cellular differentiation. Circ Res, 1994, 75:41.
5 Takayama K, Toshi J, Uchida M, et al. Retinoic acid differentially up-regulates the gene expression of retinoic acid receptor and isoforms in embryo and adult rats. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 222(2):395.
, 百拇医药
6 Chen YH, Chen YL, Lin SJ, et al. Electron microscopic studies of phenotypic modulation of SMC in coronary arteries of patients with variant anginal pectoris and post-PTCA restenosis. Circulation, 1997, 95:1169.
7 李大主，宋建新，曹林生，等.维甲酸对动脉内皮损伤后血管壁t-PA含量的影响.中国病理生理杂志，1998，14：63.
(1998年7月2日收稿，1999年3月16日修回), 百拇医药