糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞产生一氧化氮量及其合酶的影响
作者：严金川 黄晓明 刘乃丰
单位：严金川 黄晓明 刘乃丰 南京铁道医学院心血管病研究室(南京 210009)
关键词：糖基化终产物；高级；内皮；细胞；一氧化氮
糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞产生 一氧化氮量及其合酶的影响 摘 要 目的和方法：利用体外培养的人脐静脉内皮细胞 ，观察 糖基化终产物对该细胞产生一氧化氮(NO)及其对一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。结 果：发现糖基化终产物组一氧化氮含量明显降低而一氧化氮合酶活性却明显增高， 并随浓度、作用时间而发生相应变化。结论：糖基化终产物对内皮细胞产 生一氧化氮的影响并不是通过降低NO合酶活性而起作用。
Effects of advanced glycosylation end-products on NO productio n
, 百拇医药
and nitric oxide synthase activity in cultured
human umbilical vein endoth elial cells
YAN Jin-Chuan, HUAN Xiao-Min, LIU Nai-Feng
Cardiovascular Institute of Nan Jing Railway Medical College, Nanjing (21 0009)
Abstract AIM and METHODS：The effects of advanced glycosylatio n end-products (AGEs) on nitric oxide (NO) production and nitric oxide synthase ( N OS) activity in cultured human umbilical vein endothelial cells (EC) were studie d. RESULTS：AGEs decreased NO levels, however, significantly increase d NOS activity in a dose and time dependent manner.CONCLUSION：Inhibition of NO production of AGEs be not contributed to the decrease of NOS activity.
, 百拇医药
MeSH Glycoslation end products, advanced; Endothelium; Cells; Nitric oxide
一氧化氮(nitric oxide,NO)是血管内皮源性松驰因子的主要成份，它 在维持血管平 滑肌张力中起重要作用。糖尿病病人由于持续高血糖，体内蛋白质被葡萄糖非酶促修饰，形 成糖基化终产物，使糖尿病病人发展为以微血管病变为主的多种并发症。糖基化终产物对血 管内皮细胞损害导致其功能失调，从而诱发多种并发症。本文旨在探讨体外糖基化终产物对 人脐静脉内皮细胞一氧化氮及其合酶的影响，从而进一步揭示糖尿病的发生机制。
材料和方法
1.人脐静脉内皮细胞的分离与培养：参照Lorenzi等[1]取附院产科新鲜脐带25 ～30 cm, PBS冲洗干净后，灌入0.1%Ⅱ型胶原酶12 mL,37℃孵育15 min，分离、调节细 胞数在3×105/mL用RPMI 1640培养液(含20%小牛血清)进行培养，2～3 d后细胞铺满 板底，换液后加入糖基化终产物进行干预。内皮细胞鉴定采用Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色 [2]。
, http://www.100md.com
2.糖基化终产物(advanced glycosylation end-products, AGEs-BSA)的制备：将葡萄糖用 pH 7.4 PBS液配制成0.5 mol/L溶液，无菌过滤4℃保存。取牛血清白蛋白(BSA)5.0 g/L 加入葡萄糖使终浓度为50 mmol/L，在37℃无菌孵育8周，上述孵育液中一同加入终浓度为0 .5 mmol/L的EDTA，以减少氧化反应的产生，实验前用pH 7.4 BPS透析去除未结合的葡萄 糖及EDTA。对照组BSA中不含葡萄糖及EDTA，余条件一致。
3.实验分组及处理：生长密度为105/cm2的内皮
镇江市第四人民医院心内科(212001)
细胞中分别加入对照(BSA)、不 同浓 度的AGEs(50、100、200 μg/L)和不同作用时间(6 h、12 h、24 h)分别测培养液一氧化氮 代谢产物亚硝酸盐浓度和内皮细胞NOS的活性。测定方法按照NO及NOS试剂盒说明书(北京军 事医学科学院生产)操作。
, 百拇医药
NOS活性测定 原理：NOS催化L-精氨酸和分子氧反应形成NO，NO与亲合性物质生成有 色化合物，在530 nm波长下测定吸光度，代表细胞NOS活性。
计算：酶活性定义为每毫克组织蛋白酶中生成1 nmol NO为一个活性单位。
4.统计处理：数据均以
±s表示，采用小样本t检验。
结 果
1.不同浓度AGEs一氧化氮含量变化：如图1所示，随浓度增加呈负效应，对照组培养液内亚 硝酸盐(NO)代谢产物生成量为(28.47±4.3) nmol/106 cells.24 h-1(n = 5)。AGEs处理后同一时间内、不同浓度培养液亚硝酸盐生成明显减少，最低达(4.78±0.31 ) nmol/106cells.24 h-1(n=5,P<0.01)。
, 百拇医药
Fig 1Dose-dependent effects of AGEs on EC-derived NO levels. Ba rs indicated that AGEs (50～200 μg/L) dose-dependently inhibited nitrite pr oduction (±s,n=5)
图1 AGEs抑制EC产生NO的量效关系
2.AGEs作用不同时间后内皮细胞NO含量变化：图2可见，随着AGEs对内皮细胞作 用时间延长，NO含量逐渐减少(P<0.01)。
, http://www.100md.com
Fig 2 Time-dependent effects of AGEs on EC-derived NO synthe s is. Bars indicated that AGEs(200 μg/L) time-dependently inhibited nitrite prod uction (±s，n=5)
图2 AGEs抑制EC产生NO的时效关系
3.图3所示，内皮细胞一氧化氮合酶活性变化：不同浓度AGEs作用内皮细胞24 h 后，NOS随浓度增加而活性增强，明显高于对照组(P<0.01)。
, http://www.100md.com
Fig 3 Dose-dependent effects of AGEs on EC-derived NOS activi ty. Bars indicated that AGEs (50～200 μg/L) dose-dependently enhanced NOS a ctivity (±s，n=5)
图3 AGEs对NOS活性影响的量效关系
4.AGEs作用不同时间后内皮细胞NOS活性变化：图4可见AGEs对EC作用时间延长 ，NOS活性逐渐升高，明显高于对照组(P<0.01)。
, http://www.100md.com
Fig 4 Time-dependent effects of AG Es on EC-derive d NOS activity. Bars indicated that AGEs (200 μg/L) time-dependently enhanced NOS activity (±s,n＝5)
图4 AGEs对NOS活性影响的时效关系
讨 论
近年来，随着对NO生理功能及其生物学性质的进一步阐明[3]，对很多研究领域产 生了重大的影响，它被称为一种新发现细胞信使分子，通过第二信使cGMP和钙离子发挥作用 。NO可引起血管舒张、血流增加和血管通透性增高，这些效应与糖尿病早期的特征性改变相 同。在病理条件下，如高血压、高血脂、糖尿病、动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)、 心 力衰竭等都有内皮细胞受损，表现是NO的储备或基础NO的减少[4]。本实验研究体 外AGEs对内皮细胞NO产生及其NOS的影响，随浓度增加与作用时间延长NO产生减少，而对 照组BSA对内皮细胞NO产生及其NOS的影响无显著差异(本文未给出详细资料)。然而，AGEs却 明显增高NOS活性，说明AGEs对内皮细胞产生NO的抑制作用并不是通过降低NOS的活性。可能 是通过直接对NO产物影响，直接加速了NO的清除，或是象OX-LDL抑制TNF和IL-1基因表达那 样 [5，6]，通过NOS的基因表达变构而改变NOS表现型，从而影响NO的产生，这种抑制 作用并不是通过损伤效应产生的，因为经AGEs处理24 h后，用台盼蓝染色显示90%以上的细 胞仍为活细胞，而且，时间效应显示短时间处理就有抑制作用，其确切的机理有待对NOS基 因表达作进一步研究。
, 百拇医药
AGEs广泛存在糖尿病人体内，糖尿病病人易患冠心病，已有研究发现AS患者斑块中NOS活性 及其基因表达量下降[7]，说明NO释放量的下降与AS的发生密切相关，AGEs抑制NO 的合成可能是其导致AS发生的一个重要原因。
参考文献
1 Lorenzi M, Cadliero E, Markey B, et al. Interaction of huma n endothelial cells with elevated glucose concentrations and native and glycosyla ted low density lipoproteins. Diabetologia, 1984, 26:218.
2 Ryan U S. Isolation and culture of pulmonary endothelial cell. Environ Health Perspect, 1984, 56:103.
, 百拇医药
3 Fleelisch M, Tepoel M, Zamora R, et al. Understanding the controversy over the identity of EDRF. Nature, 1994, 386. 62.
4 Chester A H, O Neil G S, Moncada S, et al. Low basal and stimulated re l ease of nitric oxide in atherosclerotic epcardial coronary arteries. Lancet , 1990, 336:897.
5 Hamilton T A, Ma G P, Chisolm G M. Oxidized low density lipoprotein su ppresses the expression of tumor necrosis factor-α mRNA in stimulated murine pe ritoneal macrophages. J Immunol, 1990, 144:2343.
6 Fong LG, Fong TA, Coper AD. Inhibition of lipopolysacchride induced in terlukin-1 beta mRNA expression in mouse macrophages by oxidized low density lip oprotein. J Lipid Res, 1991, 32:1899.
7 宋良文，王雪涛，张秉钧，等.内皮素和一氧化氮合酶在家兔动脉粥样硬化斑块 中的表达.中国动脉硬化杂志，1994， 2：18.
(1997年12月18日收稿，1998年9月11日修回), 百拇医药
单位：严金川 黄晓明 刘乃丰 南京铁道医学院心血管病研究室(南京 210009)
关键词：糖基化终产物；高级；内皮；细胞；一氧化氮
糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞产生 一氧化氮量及其合酶的影响 摘 要 目的和方法：利用体外培养的人脐静脉内皮细胞 ，观察 糖基化终产物对该细胞产生一氧化氮(NO)及其对一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。结 果：发现糖基化终产物组一氧化氮含量明显降低而一氧化氮合酶活性却明显增高， 并随浓度、作用时间而发生相应变化。结论：糖基化终产物对内皮细胞产 生一氧化氮的影响并不是通过降低NO合酶活性而起作用。
Effects of advanced glycosylation end-products on NO productio n
, 百拇医药
and nitric oxide synthase activity in cultured
human umbilical vein endoth elial cells
YAN Jin-Chuan, HUAN Xiao-Min, LIU Nai-Feng
Cardiovascular Institute of Nan Jing Railway Medical College, Nanjing (21 0009)
Abstract AIM and METHODS：The effects of advanced glycosylatio n end-products (AGEs) on nitric oxide (NO) production and nitric oxide synthase ( N OS) activity in cultured human umbilical vein endothelial cells (EC) were studie d. RESULTS：AGEs decreased NO levels, however, significantly increase d NOS activity in a dose and time dependent manner.CONCLUSION：Inhibition of NO production of AGEs be not contributed to the decrease of NOS activity.
, 百拇医药
MeSH Glycoslation end products, advanced; Endothelium; Cells; Nitric oxide
一氧化氮(nitric oxide,NO)是血管内皮源性松驰因子的主要成份，它 在维持血管平 滑肌张力中起重要作用。糖尿病病人由于持续高血糖，体内蛋白质被葡萄糖非酶促修饰，形 成糖基化终产物，使糖尿病病人发展为以微血管病变为主的多种并发症。糖基化终产物对血 管内皮细胞损害导致其功能失调，从而诱发多种并发症。本文旨在探讨体外糖基化终产物对 人脐静脉内皮细胞一氧化氮及其合酶的影响，从而进一步揭示糖尿病的发生机制。
材料和方法
1.人脐静脉内皮细胞的分离与培养：参照Lorenzi等[1]取附院产科新鲜脐带25 ～30 cm, PBS冲洗干净后，灌入0.1%Ⅱ型胶原酶12 mL,37℃孵育15 min，分离、调节细 胞数在3×105/mL用RPMI 1640培养液(含20%小牛血清)进行培养，2～3 d后细胞铺满 板底，换液后加入糖基化终产物进行干预。内皮细胞鉴定采用Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色 [2]。
, http://www.100md.com
2.糖基化终产物(advanced glycosylation end-products, AGEs-BSA)的制备：将葡萄糖用 pH 7.4 PBS液配制成0.5 mol/L溶液，无菌过滤4℃保存。取牛血清白蛋白(BSA)5.0 g/L 加入葡萄糖使终浓度为50 mmol/L，在37℃无菌孵育8周，上述孵育液中一同加入终浓度为0 .5 mmol/L的EDTA，以减少氧化反应的产生，实验前用pH 7.4 BPS透析去除未结合的葡萄 糖及EDTA。对照组BSA中不含葡萄糖及EDTA，余条件一致。
3.实验分组及处理：生长密度为105/cm2的内皮
镇江市第四人民医院心内科(212001)
细胞中分别加入对照(BSA)、不 同浓 度的AGEs(50、100、200 μg/L)和不同作用时间(6 h、12 h、24 h)分别测培养液一氧化氮 代谢产物亚硝酸盐浓度和内皮细胞NOS的活性。测定方法按照NO及NOS试剂盒说明书(北京军 事医学科学院生产)操作。
, 百拇医药
NOS活性测定 原理：NOS催化L-精氨酸和分子氧反应形成NO，NO与亲合性物质生成有 色化合物，在530 nm波长下测定吸光度，代表细胞NOS活性。
计算：酶活性定义为每毫克组织蛋白酶中生成1 nmol NO为一个活性单位。
4.统计处理：数据均以
±s表示，采用小样本t检验。结 果
1.不同浓度AGEs一氧化氮含量变化：如图1所示，随浓度增加呈负效应，对照组培养液内亚 硝酸盐(NO)代谢产物生成量为(28.47±4.3) nmol/106 cells.24 h-1(n = 5)。AGEs处理后同一时间内、不同浓度培养液亚硝酸盐生成明显减少，最低达(4.78±0.31 ) nmol/106cells.24 h-1(n=5,P<0.01)。
, 百拇医药
Fig 1Dose-dependent effects of AGEs on EC-derived NO levels. Ba rs indicated that AGEs (50～200 μg/L) dose-dependently inhibited nitrite pr oduction (
±s,n=5)图1 AGEs抑制EC产生NO的量效关系
2.AGEs作用不同时间后内皮细胞NO含量变化：图2可见，随着AGEs对内皮细胞作 用时间延长，NO含量逐渐减少(P<0.01)。
, http://www.100md.com
Fig 2 Time-dependent effects of AGEs on EC-derived NO synthe s is. Bars indicated that AGEs(200 μg/L) time-dependently inhibited nitrite prod uction (
±s，n=5)图2 AGEs抑制EC产生NO的时效关系
3.图3所示，内皮细胞一氧化氮合酶活性变化：不同浓度AGEs作用内皮细胞24 h 后，NOS随浓度增加而活性增强，明显高于对照组(P<0.01)。
, http://www.100md.com
Fig 3 Dose-dependent effects of AGEs on EC-derived NOS activi ty. Bars indicated that AGEs (50～200 μg/L) dose-dependently enhanced NOS a ctivity (
±s，n=5)图3 AGEs对NOS活性影响的量效关系
4.AGEs作用不同时间后内皮细胞NOS活性变化：图4可见AGEs对EC作用时间延长 ，NOS活性逐渐升高，明显高于对照组(P<0.01)。
, http://www.100md.com
Fig 4 Time-dependent effects of AG Es on EC-derive d NOS activity. Bars indicated that AGEs (200 μg/L) time-dependently enhanced NOS activity (
±s,n＝5)图4 AGEs对NOS活性影响的时效关系
讨 论
近年来，随着对NO生理功能及其生物学性质的进一步阐明[3]，对很多研究领域产 生了重大的影响，它被称为一种新发现细胞信使分子，通过第二信使cGMP和钙离子发挥作用 。NO可引起血管舒张、血流增加和血管通透性增高，这些效应与糖尿病早期的特征性改变相 同。在病理条件下，如高血压、高血脂、糖尿病、动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)、 心 力衰竭等都有内皮细胞受损，表现是NO的储备或基础NO的减少[4]。本实验研究体 外AGEs对内皮细胞NO产生及其NOS的影响，随浓度增加与作用时间延长NO产生减少，而对 照组BSA对内皮细胞NO产生及其NOS的影响无显著差异(本文未给出详细资料)。然而，AGEs却 明显增高NOS活性，说明AGEs对内皮细胞产生NO的抑制作用并不是通过降低NOS的活性。可能 是通过直接对NO产物影响，直接加速了NO的清除，或是象OX-LDL抑制TNF和IL-1基因表达那 样 [5，6]，通过NOS的基因表达变构而改变NOS表现型，从而影响NO的产生，这种抑制 作用并不是通过损伤效应产生的，因为经AGEs处理24 h后，用台盼蓝染色显示90%以上的细 胞仍为活细胞，而且，时间效应显示短时间处理就有抑制作用，其确切的机理有待对NOS基 因表达作进一步研究。
, 百拇医药
AGEs广泛存在糖尿病人体内，糖尿病病人易患冠心病，已有研究发现AS患者斑块中NOS活性 及其基因表达量下降[7]，说明NO释放量的下降与AS的发生密切相关，AGEs抑制NO 的合成可能是其导致AS发生的一个重要原因。
参考文献
1 Lorenzi M, Cadliero E, Markey B, et al. Interaction of huma n endothelial cells with elevated glucose concentrations and native and glycosyla ted low density lipoproteins. Diabetologia, 1984, 26:218.
2 Ryan U S. Isolation and culture of pulmonary endothelial cell. Environ Health Perspect, 1984, 56:103.
, 百拇医药
3 Fleelisch M, Tepoel M, Zamora R, et al. Understanding the controversy over the identity of EDRF. Nature, 1994, 386. 62.
4 Chester A H, O Neil G S, Moncada S, et al. Low basal and stimulated re l ease of nitric oxide in atherosclerotic epcardial coronary arteries. Lancet , 1990, 336:897.
5 Hamilton T A, Ma G P, Chisolm G M. Oxidized low density lipoprotein su ppresses the expression of tumor necrosis factor-α mRNA in stimulated murine pe ritoneal macrophages. J Immunol, 1990, 144:2343.
6 Fong LG, Fong TA, Coper AD. Inhibition of lipopolysacchride induced in terlukin-1 beta mRNA expression in mouse macrophages by oxidized low density lip oprotein. J Lipid Res, 1991, 32:1899.
7 宋良文，王雪涛，张秉钧，等.内皮素和一氧化氮合酶在家兔动脉粥样硬化斑块 中的表达.中国动脉硬化杂志，1994， 2：18.
(1997年12月18日收稿，1998年9月11日修回), 百拇医药