血管内皮生长因子及其基因在自发性高血压大鼠心肌中的表达*
作者：李夏 李昭波 高云秋 杨萍 李维根 唐朝枢
单位：李昭波 高云秋 李维根 北京医科大学 1运动医学研究所；唐朝枢 心血管基础研究所；杨萍 北医三院眼 科(北京 100083)；李夏 山西职工医学院基础部(太原 030012)
关键词：生长物质；内皮；血管；心肌；肥大；高血压
中国病理生理杂志/990703 摘 要 目的：血管内皮生长因子(VEGF)是新近确定的一 种特异作用于血管内皮细胞的活性肽。最近发现正常心肌细胞有VEGF及其基因表达，但对高 血压肥大心脏心肌VEGF及其基因表达的变化尚不清楚。方法：本实验采用 免疫组化和分子杂交方法，对自发性高血压大鼠(SHR)肥大心脏心肌VEGF及其基因表达进行 研究。结果：免疫组化结果表明，SHR心肌细胞浆内特异性VEGF染色颗粒明 显多于WKY对照大鼠。Northern分子杂交结果表明，SHR心肌VEGF mRNA表达明显强于WKY对照 大 鼠。结论：目前对这一结果的生理意义还不清楚，推测可能与心肌肥大时 细胞间质血管增生有关。
, 百拇医药
Expression of vascular endothelial growth factor and its
gene in myocardium of spontaneously hypertensive rats
LI Xia, LI Zhao-Bo, GAO Yun-Qiu, YANG Ping, LI Wei-Gen, TANG Zhao S hu*
Institute of Sport Medicine, Institute of Cardiovascular Research*,Bei jing Medical University, Beijing (100083)
Abstract AIM：Vascular endothelial growth factor(VEGF), a growt h and permeability factor specific for endothelial cell, has been identified in m yocardium of the normal adult heart, but the change of VEGF in myocardium of hyp ertensive hypertrophic heart was unclear. METHODS：We therefor stu d ied the expression of VEGF and its gene in myocardium of spontaneously hypertens ive rats(SHR) by immunohistochemistry assay and Northen bolt. The results were analyzed by scanning densitometry.RESULTS：Compared with control W istar Kyoto (WKY) rats, the left ventricle weight/body weight of SHR increased b y 61%(P<0.01). The intracellular VEGF immunoactivity was present in myocard ium of WKY rats and SHR, but the immunoactivity of SHR was 91% strong er than that of WKY rats. The results of Northern bolt showed that the expressio n of VEGF mRNA of SHR increased by 67% than that of WKY by scanning densitometr y. CONCLUSION：Although little is known about the role of expressi on upregulation of VEGF and its gene in myocardium of SHR, it seems to respond to vascular proliferation of hypertrophic heart.
, 百拇医药
MeSH Growth substances; Endothelium, vascular; Myocardium; Hyper trophy; Hypertension
心肌肥大是心脏自身针对血流动力学因素改变，通过自分泌和旁分泌 调节而发生的一种适应性变化[1]。大量研究表明血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,A ngⅡ)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和胰岛素样生 长因子(insulin-like growth factor, IGF)等心肌分泌的活性因子在心肌肥大的形成过程 中具有重要的调节作用[1]。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是新近确定的一种存 在于血管内皮细胞，特异刺激血管内皮细胞增殖的活性肽[2]。随后研究发现正常 心肌细胞有VEGF及其基因的表达[3]，故VEGF也属心源性活性肽。最近研究发 现由肺动脉狭窄引起的右心肥大心脏的心肌细胞VEGF基因表达增强[4]，提示VEGF 可能参与心肌肥大机制。但目前尚未见高血压肥大心脏心肌VEGF变化的研究报道。本实验采 用免疫组化和Northern分子杂交方法，通过对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertens ive rats, SHR)心肌VEGF及其基因表达的研究，进一步探讨心肌肥大形成的内分泌或旁分泌 机制。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料：
体重200～230 g雄性SHR和WKY大鼠各6只，购自北京阜外心血管医院动物科。兔抗人VEGF多 克隆抗体和SPTM试剂盒为Zymed产品。VEGF cDNA探针由美国国家卫生研究院(NIH)Marvin. O.B oluyt教授馈赠。β-actin cDNA探针购自华美公司。随机引物标记试剂盒为Pro mege产品。[α-32P]-dCTP购自北京亚辉生物工程公司。其余试剂为Sigma产品和 国产分析纯。
二、方法：
(一)血压测定和心肌肥大计算：大鼠禁食自由饮水24 h后，称体重(BW)，戊巴比妥钠 (35 mg/kg.ip)麻醉。经颈总动脉插管，用RM-6000生理多导仪测颈总动脉血压。然后开胸 取 出心脏，4℃预冷生理盐水冲洗，沿室间隔剔除心房和右心室，称左心重(LVW)。心肌肥大程 度以心系数(LVW/BW)表示。
, 百拇医药
(二)免疫组化实验：常规石蜡切片。按试剂盒说明操作。特异性一抗VEGF 1∶1000 稀释，阴性对照用PBS代 替。湿盒4℃过夜。生物素标记的二抗1∶200稀释，37℃孵育30 min。辣根酶标记的链霉卵 白素1∶200稀释，37℃孵育30 min。新配制DAB显色，苏木素复染。用于图象分析的切片不 复染。
(三)Northern分子杂交：两只大鼠心脏合并一例。异硫氰酸胍一步法提取总RNA。1 %琼脂糖凝胶行甲醛变性电泳 分离RNA，虹吸印迹法转移RNA至尼龙膜上。80℃干烤2 h后保存。VEGF和β-actin cDNA探 针采用随机引物标记法标记[α-32P]-dCTP同位素。42℃预杂交24 h后，杂交24 h 。-70℃放射自显影4～7 d。VEGF和β-actin用同一张膜杂交。先杂交VEGF，用5 0%甲酰胺和0.1%SSPE洗膜并经放射自显影确认无杂交信号后，再进行β-actin杂交。
(四)统计处理：免疫组化结果用组织切片表示。杂交结果用放射自显影斑点图表 示，并用ISAS2000图 象分析系统对组化切片特异染色颗粒和分子杂交斑点进行半定量分析，其结果用光密度平均 值(OD)表示。免疫组化切片每组分析5张，每张取5个视野的平均值。血压和心系数用
±s表示，采用方差分析组间q检验行统计处理。
, 百拇医药
结果
WKY大鼠心系数(2.21±0.18)mg/g。SHR心系数(3.56±0.27) mg/g，比WKY大鼠提 高61%(P<0.01)。WKY大鼠血压(12.27±1.06/10.40±0.53) kPa。SHR血 压(24 .93±0 .93/23.33±1.60)kPa，比WKY大鼠收缩压增加103%，舒张压增加124%(P<0.01)。
免疫组化结果表明，WKY大鼠心肌细胞胞浆内有一定量VEGF特异褐黄染色颗粒(图1-A)。 SHR心肌细胞胞浆内VEGF特异褐黄染色颗粒明显多于WKY大鼠(图1-B)。图像分析结果表明，S HR心肌细胞胞浆内特异染 色颗粒灰度OD值为1.01，比WKY大鼠心肌OD值0.53高出91%(表1)。
, http://www.100md.com
Fig 1 Immunohistochemical staining of VEGF (1∶200) in left v entricular myocardium of WKY (A) and SHR (B). PBS was substituted for VEGF anti body in staining procedure as negative control (C)
图1 自发性高血压大鼠(B)和对照大鼠(A)心肌细胞VEGF免疫组化结果.用 PBS代替VEGF抗体作为阴性对照组(C)
表1 两组大鼠心肌VEGF免疫组化染色颗粒和分子杂交斑
点灰度扫描光密度值比较
Tab 1 OD value of VEGF level and its mRNA expression in
, 百拇医药
myocardium of two group by scanning densitometry Group
VEGF level
VEGF mRNA/β-act in mRNA
WKY
0.53
0.58
SHR
1.01
0.97
Northern分子杂交结果表明，WKY大鼠心肌有少量VEGF mRNA表达，SHR 心肌VEGF 表达明显增强(图2)。图像分析结果表明，WKY心肌mRNA表达杂交斑点灰度OD值为0.58，SHR 心肌OD值0.97，比WKY高出67%(表1)。
, 百拇医药
Fig 2 Autoradiographs of VEGF mRNA hybridized blot of left v entricular myocardium of WKY (C) and SHR (H) by Northern blot analysis with 20 μ g total RNA hybridized before VEGF probe analysis. The blot was finally hybridiz ed to β-actin for normalizing difference in RNA concentration
图2 自发性高血压大鼠(H)和对照大鼠(C)心肌VEGF分子杂交放射自显影 结果
讨 论
本实验结果表明高血压性肥大心脏心肌VEGF及其基因表达比正常心脏增强，与文献报道 由肺动脉狭窄引起右心肥大时的变化相一致[4]。由于目前尚未在心肌细胞膜上发 现有VEGF受体存在[2]，故对心肌中VEGF表达的生理意义还不清楚。研究表明在心 肌肥大的发展过程中，为维持恒定的氧灌流，间质血管常伴随心肌肥大而增生[5] ，最近发现心肌VEGF表达增强常与冠状动脉阻塞后侧支循环的建立相伴随[6]。由 于VEGF被认为是目前作用最强的特异刺激血管内皮增生的生长因子[2]，由此可推 论高血压肥大心脏心肌细胞VEGF及其基因表达增强可能与其间质血管增生有密切的关系。
, http://www.100md.com
文献报道培养心肌细胞在缺氧条件下，VEGF基因表达增强[7]，而压力负荷所 致的肥大心脏，心内膜血流量减少，存在心肌局部缺氧现象[8]。提示高血压肥大 心脏心肌VEGF及其基因表达增强可能与心肌局部缺血缺氧刺激有关。
* 国家自然科学基金资助(No.39500168)
参考文献
1 Komuro I, Yazaki Y. Molecular mechanism of cardiac hypertr ophy and failure. Clin Sci, 1994, 87:115.
2 Breier G, Albrecht U, Sterrer S, et al. Expression of vascular endoth elial growth factor during embryonic angiogenesis and endothelial cell different iation. Development, 1990, 85:507.
, 百拇医药
3 Berse B, Brown LF, Dvorak HF, et al. Vascular permeability factor (vas cular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tiss ues, macrophages, and tumors. Mol Biol Cell, 1992, 3:211.
4 Carroll SM, Nimmo LE, Knoepfler PS, et al. Gene expression in a swine model of right ventricular hypertrophy:intercellular adhesion molecule, vascular endothelial growth factor and plasminogen activators are upregulated during pres sure overload. J Mol Cell Cardiol, 1995, 27:1427.
, http://www.100md.com
5 Kassab GS, Imoto K, White FC, et al. Coronary arterial tree remodeling in right ventricular hypertrophy. Am J Physiol, 1993, 265:H366.
6 Carroll SM, Magnet AD, Knoepfer PS, et al. Vascular endothelial growth factor(VEGF) is increased during collateral development in the ischemic heart ( abstract). Circulation, 1993, 88:I-239.
7 Shweiki D, Itin A, Soffer D, et al. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature, 1992, 359 :843.
8 White FC, Sanders M, Peterson T, et al. Ischemic myocardial injury aft er exercise stress in the pressure-overloaded heart. Am J Pathol, 1979, 97:473.
(1997年12月18日收稿，1998年5月13日修回), 百拇医药
单位：李昭波 高云秋 李维根 北京医科大学 1运动医学研究所；唐朝枢 心血管基础研究所；杨萍 北医三院眼 科(北京 100083)；李夏 山西职工医学院基础部(太原 030012)
关键词：生长物质；内皮；血管；心肌；肥大；高血压
中国病理生理杂志/990703 摘 要 目的：血管内皮生长因子(VEGF)是新近确定的一 种特异作用于血管内皮细胞的活性肽。最近发现正常心肌细胞有VEGF及其基因表达，但对高 血压肥大心脏心肌VEGF及其基因表达的变化尚不清楚。方法：本实验采用 免疫组化和分子杂交方法，对自发性高血压大鼠(SHR)肥大心脏心肌VEGF及其基因表达进行 研究。结果：免疫组化结果表明，SHR心肌细胞浆内特异性VEGF染色颗粒明 显多于WKY对照大鼠。Northern分子杂交结果表明，SHR心肌VEGF mRNA表达明显强于WKY对照 大 鼠。结论：目前对这一结果的生理意义还不清楚，推测可能与心肌肥大时 细胞间质血管增生有关。
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Expression of vascular endothelial growth factor and its
gene in myocardium of spontaneously hypertensive rats
LI Xia, LI Zhao-Bo, GAO Yun-Qiu, YANG Ping, LI Wei-Gen, TANG Zhao S hu*
Institute of Sport Medicine, Institute of Cardiovascular Research*,Bei jing Medical University, Beijing (100083)
Abstract AIM：Vascular endothelial growth factor(VEGF), a growt h and permeability factor specific for endothelial cell, has been identified in m yocardium of the normal adult heart, but the change of VEGF in myocardium of hyp ertensive hypertrophic heart was unclear. METHODS：We therefor stu d ied the expression of VEGF and its gene in myocardium of spontaneously hypertens ive rats(SHR) by immunohistochemistry assay and Northen bolt. The results were analyzed by scanning densitometry.RESULTS：Compared with control W istar Kyoto (WKY) rats, the left ventricle weight/body weight of SHR increased b y 61%(P<0.01). The intracellular VEGF immunoactivity was present in myocard ium of WKY rats and SHR, but the immunoactivity of SHR was 91% strong er than that of WKY rats. The results of Northern bolt showed that the expressio n of VEGF mRNA of SHR increased by 67% than that of WKY by scanning densitometr y. CONCLUSION：Although little is known about the role of expressi on upregulation of VEGF and its gene in myocardium of SHR, it seems to respond to vascular proliferation of hypertrophic heart.
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MeSH Growth substances; Endothelium, vascular; Myocardium; Hyper trophy; Hypertension
心肌肥大是心脏自身针对血流动力学因素改变，通过自分泌和旁分泌 调节而发生的一种适应性变化[1]。大量研究表明血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,A ngⅡ)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和胰岛素样生 长因子(insulin-like growth factor, IGF)等心肌分泌的活性因子在心肌肥大的形成过程 中具有重要的调节作用[1]。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是新近确定的一种存 在于血管内皮细胞，特异刺激血管内皮细胞增殖的活性肽[2]。随后研究发现正常 心肌细胞有VEGF及其基因的表达[3]，故VEGF也属心源性活性肽。最近研究发 现由肺动脉狭窄引起的右心肥大心脏的心肌细胞VEGF基因表达增强[4]，提示VEGF 可能参与心肌肥大机制。但目前尚未见高血压肥大心脏心肌VEGF变化的研究报道。本实验采 用免疫组化和Northern分子杂交方法，通过对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertens ive rats, SHR)心肌VEGF及其基因表达的研究，进一步探讨心肌肥大形成的内分泌或旁分泌 机制。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料：
体重200～230 g雄性SHR和WKY大鼠各6只，购自北京阜外心血管医院动物科。兔抗人VEGF多 克隆抗体和SPTM试剂盒为Zymed产品。VEGF cDNA探针由美国国家卫生研究院(NIH)Marvin. O.B oluyt教授馈赠。β-actin cDNA探针购自华美公司。随机引物标记试剂盒为Pro mege产品。[α-32P]-dCTP购自北京亚辉生物工程公司。其余试剂为Sigma产品和 国产分析纯。
二、方法：
(一)血压测定和心肌肥大计算：大鼠禁食自由饮水24 h后，称体重(BW)，戊巴比妥钠 (35 mg/kg.ip)麻醉。经颈总动脉插管，用RM-6000生理多导仪测颈总动脉血压。然后开胸 取 出心脏，4℃预冷生理盐水冲洗，沿室间隔剔除心房和右心室，称左心重(LVW)。心肌肥大程 度以心系数(LVW/BW)表示。
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(二)免疫组化实验：常规石蜡切片。按试剂盒说明操作。特异性一抗VEGF 1∶1000 稀释，阴性对照用PBS代 替。湿盒4℃过夜。生物素标记的二抗1∶200稀释，37℃孵育30 min。辣根酶标记的链霉卵 白素1∶200稀释，37℃孵育30 min。新配制DAB显色，苏木素复染。用于图象分析的切片不 复染。
(三)Northern分子杂交：两只大鼠心脏合并一例。异硫氰酸胍一步法提取总RNA。1 %琼脂糖凝胶行甲醛变性电泳 分离RNA，虹吸印迹法转移RNA至尼龙膜上。80℃干烤2 h后保存。VEGF和β-actin cDNA探 针采用随机引物标记法标记[α-32P]-dCTP同位素。42℃预杂交24 h后，杂交24 h 。-70℃放射自显影4～7 d。VEGF和β-actin用同一张膜杂交。先杂交VEGF，用5 0%甲酰胺和0.1%SSPE洗膜并经放射自显影确认无杂交信号后，再进行β-actin杂交。
(四)统计处理：免疫组化结果用组织切片表示。杂交结果用放射自显影斑点图表 示，并用ISAS2000图 象分析系统对组化切片特异染色颗粒和分子杂交斑点进行半定量分析，其结果用光密度平均 值(OD)表示。免疫组化切片每组分析5张，每张取5个视野的平均值。血压和心系数用
±s表示，采用方差分析组间q检验行统计处理。, 百拇医药
结果
WKY大鼠心系数(2.21±0.18)mg/g。SHR心系数(3.56±0.27) mg/g，比WKY大鼠提 高61%(P<0.01)。WKY大鼠血压(12.27±1.06/10.40±0.53) kPa。SHR血 压(24 .93±0 .93/23.33±1.60)kPa，比WKY大鼠收缩压增加103%，舒张压增加124%(P<0.01)。
免疫组化结果表明，WKY大鼠心肌细胞胞浆内有一定量VEGF特异褐黄染色颗粒(图1-A)。 SHR心肌细胞胞浆内VEGF特异褐黄染色颗粒明显多于WKY大鼠(图1-B)。图像分析结果表明，S HR心肌细胞胞浆内特异染 色颗粒灰度OD值为1.01，比WKY大鼠心肌OD值0.53高出91%(表1)。
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Fig 1 Immunohistochemical staining of VEGF (1∶200) in left v entricular myocardium of WKY (A) and SHR (B). PBS was substituted for VEGF anti body in staining procedure as negative control (C)
图1 自发性高血压大鼠(B)和对照大鼠(A)心肌细胞VEGF免疫组化结果.用 PBS代替VEGF抗体作为阴性对照组(C)
表1 两组大鼠心肌VEGF免疫组化染色颗粒和分子杂交斑
点灰度扫描光密度值比较
Tab 1 OD value of VEGF level and its mRNA expression in
, 百拇医药
myocardium of two group by scanning densitometry Group
VEGF level
VEGF mRNA/β-act in mRNA
WKY
0.53
0.58
SHR
1.01
0.97
Northern分子杂交结果表明，WKY大鼠心肌有少量VEGF mRNA表达，SHR 心肌VEGF 表达明显增强(图2)。图像分析结果表明，WKY心肌mRNA表达杂交斑点灰度OD值为0.58，SHR 心肌OD值0.97，比WKY高出67%(表1)。
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Fig 2 Autoradiographs of VEGF mRNA hybridized blot of left v entricular myocardium of WKY (C) and SHR (H) by Northern blot analysis with 20 μ g total RNA hybridized before VEGF probe analysis. The blot was finally hybridiz ed to β-actin for normalizing difference in RNA concentration
图2 自发性高血压大鼠(H)和对照大鼠(C)心肌VEGF分子杂交放射自显影 结果
讨 论
本实验结果表明高血压性肥大心脏心肌VEGF及其基因表达比正常心脏增强，与文献报道 由肺动脉狭窄引起右心肥大时的变化相一致[4]。由于目前尚未在心肌细胞膜上发 现有VEGF受体存在[2]，故对心肌中VEGF表达的生理意义还不清楚。研究表明在心 肌肥大的发展过程中，为维持恒定的氧灌流，间质血管常伴随心肌肥大而增生[5] ，最近发现心肌VEGF表达增强常与冠状动脉阻塞后侧支循环的建立相伴随[6]。由 于VEGF被认为是目前作用最强的特异刺激血管内皮增生的生长因子[2]，由此可推 论高血压肥大心脏心肌细胞VEGF及其基因表达增强可能与其间质血管增生有密切的关系。
, http://www.100md.com
文献报道培养心肌细胞在缺氧条件下，VEGF基因表达增强[7]，而压力负荷所 致的肥大心脏，心内膜血流量减少，存在心肌局部缺氧现象[8]。提示高血压肥大 心脏心肌VEGF及其基因表达增强可能与心肌局部缺血缺氧刺激有关。
* 国家自然科学基金资助(No.39500168)
参考文献
1 Komuro I, Yazaki Y. Molecular mechanism of cardiac hypertr ophy and failure. Clin Sci, 1994, 87:115.
2 Breier G, Albrecht U, Sterrer S, et al. Expression of vascular endoth elial growth factor during embryonic angiogenesis and endothelial cell different iation. Development, 1990, 85:507.
, 百拇医药
3 Berse B, Brown LF, Dvorak HF, et al. Vascular permeability factor (vas cular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tiss ues, macrophages, and tumors. Mol Biol Cell, 1992, 3:211.
4 Carroll SM, Nimmo LE, Knoepfler PS, et al. Gene expression in a swine model of right ventricular hypertrophy:intercellular adhesion molecule, vascular endothelial growth factor and plasminogen activators are upregulated during pres sure overload. J Mol Cell Cardiol, 1995, 27:1427.
, http://www.100md.com
5 Kassab GS, Imoto K, White FC, et al. Coronary arterial tree remodeling in right ventricular hypertrophy. Am J Physiol, 1993, 265:H366.
6 Carroll SM, Magnet AD, Knoepfer PS, et al. Vascular endothelial growth factor(VEGF) is increased during collateral development in the ischemic heart ( abstract). Circulation, 1993, 88:I-239.
7 Shweiki D, Itin A, Soffer D, et al. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature, 1992, 359 :843.
8 White FC, Sanders M, Peterson T, et al. Ischemic myocardial injury aft er exercise stress in the pressure-overloaded heart. Am J Pathol, 1979, 97:473.
(1997年12月18日收稿，1998年5月13日修回), 百拇医药