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编号:10271527
当归注射液对氢化可的松诱导的大鼠脾脏细胞凋亡的影响
http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 1999年第8期
     作者:吕小迅 黄瑶 吴新华 吕伟标

    单位:吕小迅 吴新华 吕伟标 广东药学院微生物学与免疫学教研室(广州 510224);黄瑶 广东药学院门诊部

    关键词:当归;氢化可的松;脾

    当归注射液对氢化可的松诱导的大鼠 脾脏细胞凋亡的影响 摘 要 目的:观察当归注射液对氢化可的松诱导的大鼠脾脏细胞凋亡的影响。方法:以氢化可的松诱导大鼠脾脏细胞凋亡为模型,采用流式细胞仪吖啶橙(AO)染色法检测凋亡细胞率。结果:10-7 mol/L氢化可的松作用大鼠脾脏细胞6 h,DNA片段率显著增高,达27.4%,与对照组(19.4%)相比有极显著意义(P<0.01,n=6),加入5%当归注射液后,凋亡率降至21.7%,与对照组无显著差异(P>0.05)。结论:当归注射液可抑制氢化可的松诱导的大鼠脾脏细胞凋亡,此抑制作用具有剂量依赖性。
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    Effect of Angelica Sinensis injection solution on apoptosis of

    rat spleen cells induced by hydrocortisone

    LU Xiao-Xun, HUANG Yao, WU Xin-Hua, LU Wei-Biao

    Department of Microbiology and Immunology, Guangdong College of Pharmacy, Guangzhou (510224)

    Abstract AIM:To invenstigate the effect of Angelica Sinensis injection solution (ASIS) on the apoptosis of rat spleen cells induced by hydrocortisone.METHODS:Flow cytometer with acridine orange straining method was used to observe the rate of cellular apoptosis and the apoptosis of rat spleen cells was induced by hydrocortisone (HYD).RESULTS:When the cells were incubated with 10-7 mol/L HYD for 6 h, the percentage of DNA fragmentation increased to 27.4% compared to the control group 19.4%(P<0.01,n=6),but it decreased to 21.7% (P>0.05) when 5% ASIS were added.CONCLUSION:ASIS inhibited apoptosis of rat spleen cells induced by HYD and the inhibition is dose-dependent.
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    MeSH Angelica Sinensis; Hydrocortisone; Spleen

    当归(Angelica Sinensis)为中医常用补血活血药之一,有养血补虚、化瘀止痛之效,现代医学研究表明,当归及提取物在调节机体免疫功能方面具有多重作用[1~3]。已知糖皮质激类药物对机体免疫功能有显著的抑制作用,并可诱导小鼠胸腺细胞凋亡[4]。本文以氢化可的松与大鼠脾脏细胞共同孵育,诱发大鼠脾脏细胞凋亡为模型,探讨当归注射液在体外对大鼠脾细胞凋亡的影响。

    材料和方法

    (一)实验动物:成年Spague-Dawleg大鼠(200~220 g),由中山医科大学实验动物中心提供,雌雄兼用。

    (二)药品:5%当归注射液(Angelica Sinensis injection solution, ASIS):江苏盱眙制药厂,批号980505;氢化可的松(hydrocortisone, HYD):江苏扬州制药厂,批号980301。
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    (三)脾脏细胞培养:成年SD大鼠脱颈椎处死,无菌操作取出脾脏,按常规制成脾脏细胞悬液,胎盼蓝检查细胞活性,计数并调整细胞至107/mL(终浓度),实验分3组:A.RPMI 1640组(对照)(Sigma); B.氢化可的松组;C.氢化可的松+当归注射液组。每组均做双份,各2 mL置于细胞培养孔,置含5%CO2、37℃中孵育6 h。

    (四)流式细胞术分析:取已培养6 h样品,按1∶3与70%乙醇混匀,4℃过夜后用吖啶(AO)染色,流式细胞仪(美国Coulter公司)检测凋亡细胞率,低于G1期DNA含量的亚二倍体细胞群体为凋亡细胞经计算机软件处理后得出细胞凋亡率,每份样品检测细胞数>1×104

    (五)统计处理:细胞凋亡率用百分数表示, 两组均数间的显著性检验用t检验。

    结 果
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    一、氢化可的松对大鼠脾脏细胞的作用:

    结果见表1,对照组大鼠脾脏细胞体外孵育6 h后,细胞凋亡率为19.4%,10-5,10-6,10-7mol/L的氢化可的松均有显著的促进脾脏细胞DNA片段化或亚二倍体细胞形成的作用(P<0.01),并具有剂量依赖性。

    表1 氢化可的松对大鼠脾脏细胞的作用

    Tab 1 Effect of hydrocortisone (HYD) on spleen cells of rat (n=6)

    Control

    HYD(mol/L)

    10-5
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    10-6

    10-7

    Apoptosis rate (%)

    19.4±2.6**

    39.5±6.1**

    33.4±5.0**

    27.4±3.8**

    **P<0.01, vs control

    二、当归注射液对大鼠脾脏细胞凋亡的影响:
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    在含10-6 mol/L HYD的大鼠脾脏细胞悬液中,加入当归注射液,使其终浓度分别为0.2%,1%,5%(以原5%当归注射液为100%浓度),相同条件下孵育6 h后,观察当归注射液对大鼠脾脏细胞凋亡的作用,结果如表2所示,5%的当归注射液可明显阻断氢化可的松所诱导的大鼠脾脏细胞凋亡;DNA直方图上可见位于G1峰左侧的亚二倍体细胞峰的峰型,在氢化可的松组图中显著增大(图1)。

    表2 当归注射液对大鼠脾脏细胞凋亡的影响

    Tab 2 Effect of ASIS on apoptosis of spleen cells of rat (n=6)

    Control

    HYD(10-6mol/L)
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    ASIS(%)

    0.2

    1

    5

    Apoptosis

    rate(%)

    19.4±2.6

    30.1±4.8

    24.5±3.6

    21.7±2.9*

    *P>0.05,vs control;△P<0.05, vs control2001a.gif (2010 bytes)2001b.gif (1998 bytes)2001c.gif (1999 bytes)
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    Fig 1 The effect of HYD and ASIS on apoptosis of spleen cell of rat

    A: control, apoptosis rate 19.4%

    B: HYD 10-6 mol/L, apoptosis rate 33.4%

    C: HYD 10-6 mol/L plus ASIS(5%), apoptosis rate 21.7%

    图1 HYD和ASI对大鼠脾细胞凋亡的影响

    讨 论

    细胞凋亡是体内细胞的一种生理性调节机制,在维持机体自身稳定方面起重要作用。机体免疫器官的状态与免疫功能密切相关,其细胞凋亡的活跃或不恰当的抑制均可能引起机体免疫系统功能异常,从而导致各种疾病。因此已有许多学者从细胞凋亡研究入手,寻找促进或抑制细胞凋亡的药物[4~6],以适应机体的不同状态。
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    已知基因、药物、传染、幅射等因素都能诱发细胞发生凋亡,对于临床应用非常广泛的皮质类固醇激素,国内外学者都已证实地塞米松能诱导实验动物胸腺细胞凋亡[7,8],本文结果进一步证实,10-7 mol/L氢化可的松可以诱导大鼠脾脏细胞凋亡,提示皮质类固醇激素对机体免疫器官的损伤是多方面的。目前对于凋亡细胞DNA特征性断裂的详细机制尚不清楚,一般认为是激发了一种Ca2+,Mg2+依赖的内源性限制性核酸内切酶,该酶选择性地切断核小体间的连接DNA,使之成为不连续的180~200 bp或其整数倍的DNA片段[7],流式细胞术分析可直接观察到细胞DNA含量变化,染色的小分子DNA在正常的二倍体细胞DNA峰之前形成一个亚二倍体细胞凋亡峰,称Ap峰,根据Ap峰值即可测得凋亡细胞占细胞总数的比例,本实验中10-6 mol/L氢化可的松组Ap峰较1 640对照组显著增大,而同时加有5%当归注射液时Ap峰则与正常对照无明显差异。
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    当归为中医常用名贵中药之一,在调节机体免疫功能上具有多方面的促进作用。文献表明,当归能促进小鼠白细胞介素-2(IL-2)的产生,并显著增加红细胞的免疫粘附作用[3],当归注射液不仅能使趋化移动的单核细胞数量增加,趋化移动距离增大,并能明显消除氢化可的松对单核细胞趋化移动的抑制作用[1],本文采用氢化可的松诱导大鼠脾脏的细胞凋亡为模型,进一步证实了当归注射液可显著抑制氢化可的松对脾脏细胞凋亡的诱导作用,提示当归注射液对氢化可的松所造成的免疫损害有多重抑制或解除功能,为临床上应用氢化可的松时预防免疫功能抑制提供了新的实验依据。但其机制目前尚不清楚,有待于进一步研究。

    参考文献

    1 吕小迅,张成武.当归注射液对人单核细胞趋化移动的作用.广东医药学院学报,1994,10(4):240.

    2 徐启勇,刘卫敏,林宇辉,等.当归对博来霉素致鼠急性肺损伤的预防作用. 湖北医科大学学报,1997,18(1):20.
, http://www.100md.com
    3 吕世静,黄槐莲,吴宋厦.当归对实验动物红细胞粘附功能及IL-2免疫调节作用.中国实验临床免疫学杂志,1997,9(5):61.

    4 刘玉涛,周 禾,白小薇,等.枸杞多糖对小鼠胸腺细胞凋亡的调节.北京医科大学学报, 1996, 28(2):111.

    5 何玉军,苏安英,柴锡庆,等.用血清药理学方法观察中药复方制剂诱导人胃癌细胞凋亡的研究.综合临床医学,1998,14(1):30.

    6 陈晓莉,胡 毅.葛根提取物的体外抗瘤作用及流式细胞仪分析.中药药理与临床,1997,13(6):27.

    7 Wyllie AH. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature, 1980, 284(10):555.

    8 周安宇,谌贻璞,邹万忠,等.地塞米松诱导大鼠胸腺细胞凋亡.上海免疫学杂志,1995,15(2);65.

    (1999年3月31日收稿,1999年6月4日修回), http://www.100md.com