新霉素耐药基因(NeoR)的整合与表达并不改变人乳癌细胞(MDA)的原有生物学特性*
作者：郭斯启 奚永志 宋三泰 金荔 陈兴国 孔繁华
单位：军事医学科学院附属医院免疫学研究室(北京 100039)
关键词：乳房；癌；细胞；新霉素；基因；生物学
中国病理生理杂志990817 摘 要 目的：通过对比MDA-NeoR与MDA人乳癌细胞的生物学特征，阐明原核标志基因NeoR的长期稳定整合与表达是否对乳癌细胞原有的生物学特性产生影响。方法：对已建立且证实表达NeoR基因>6个月的7株MDA-NeoR细胞系进行G418抗性、表面抗原、细胞倍增时间、细胞周期、肿瘤细胞集落形成及裸鼠体内成瘤能力的检测。结果：MDA-NeoR细胞对高浓度的G418仍产生抗性并表达NeoR基因；其细胞倍增时间、S期分数、肿瘤细胞体外集落形成率与MDA无明显区别(P>0.05)；角蛋白CK19与表面膜抗原EMA的表达在两组是等同的；并且MDA-NeoR 7细胞系在裸鼠体内的成瘤能力与MDA细胞也是相似的。结论：外源标志基因NeoR的长期稳定整合与表达对MDA人乳癌细胞的原有生物学特性无明显影响。
, http://www.100md.com
Biological characteristics of human breast cancer cell line
(MDA) expressing neomycin resistance gene (NeoR)
GUO Si-Qi,XI Yong-Zhi,SONG San-Tai,JIN Li,CHEN Xing-Guo,KONG Fan-Hua
Laboratory of Immunology, Affiliated Hospital for Academy of Military Medical Sciences, Beijing (100039)
Abstract AIM: To compare the biological characters of MDA cell line with MDA-NeoR cell lines, those of expressing neomycin resistance gene (NeoR). METHODS: Several biological characters were identified. They are G418 (geneticin) resistance, the expression of cell membrane antigens, double-cell time, the fraction of cell cycle phase, the numbers of tumor colony formation in vitro and the tumor formation ratio of nude mice in vivo.RESULTS: MDA-NeoR cells cultured in vitro for six months are still endurable for G418(6×105 U/L); The expression of CK19 (cytokeratin 19) and epithelial membrane antigen detected by (flow cytometer ) are negative; Double-cell time, the ratio of cell in S phase, and the colony formation numbers in vitro are insignificant statistically (P>0.05) between MDA and MDA-NeoR cell lines; The tumor formation ratio of nude mice in vivo of MDA and one of MDA-NeoR cell lines are 1/4 and 2/5 respectively, have no difference. CONCLUSION: The integration and expression of hetrogenious NeoR gene do not make any changes in the characters of MDA.
, 百拇医药
MeSH Breast; Carcinoma; Cells; Neomycin; Genes; Biology
为了深入探索乳癌细胞的生物学特性、转移、浸润、微小病变的检测以及自身造血干细胞移植前的净化新策略，新近我们已成功地建立了特异性表达原核标志基因NeoR(neomycin resistance gene，新霉素耐药基因)的人乳癌细胞模型。由于迄今为止所有的转基因方法均缺乏组织特异性或定向性，所转外源基因达不到基因打靶或基因定点整合，因此有可能使整合的外源基因激活靶细胞的原癌基因、灭活抗癌基因、启动转化基因等其它相关的功能性基因，从而引起靶细胞的一系列原有生物学特性的改变。为此，全面系统地阐明NeoR基因在MDA(MDA-MB-231，乳癌细胞系)细胞基因组中的长期稳定整合与表达能否改变该细胞原有的生物学特性显得尤为重要，这也是该模型在被广泛应用之前必须阐明的关键问题。
材料与方法
, http://www.100md.com
(一)材料：MDA-MB-231由军事医学科学院三所陆应麟教授馈赠，7株MDA-NeoR(NeoR基因转入MDA-MB-231)细胞由本室建立并培养>6个月；鼠抗人角蛋白19(cytokeratin 19, CK19)单抗、表面膜抗原(EMA)单抗和异硫氰酸荧光素(FITC)结合的兔抗鼠二抗为DAKO公司产品，碘化丙锭PI为Sigma公司产品；表皮生长因子(EGF)由军事医学科学院八所朱厚础教授馈赠，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)为日本麒麟公司产品；Balb-c裸鼠购自中国医学科学院。
(二)MDA-NeoR细胞对G418(geneticin)的抗性
*国家自然科学基金资助(No.39370272)
及NeoR基因表达的检测：将MDA-NeoR细胞及MDA原代细胞在含有终浓度为6×105 U/L G418的1640培养基中传代培养，观察对G418的抗性；同时提取各细胞的基因组DNA，PCR扩增NeoR基因的特异性产物，以检验NeoR基因的整合。
, 百拇医药
(三)MDA-NeoR细胞倍增时间检测：参照文献[1]方法。连续计数培养24、48、72及96 h的细胞，取其平均值，分别计算细胞倍增时间，每一种细胞均重复测定3次。
(四)MDA-NeoR细胞表面抗原的表达：方法见文献[1]。细胞浓度为1010/L，抗CK19和抗EMA单抗的浓度为1：50，FITC(异硫氰酸荧光素)结合二抗的浓度为1：15，标记后用FCM检测。
(五)MDA-NeoR细胞周期状态的检测[1]：按设计定时取所培养的细胞用70%酒精固定后4℃保存。检测时稀释成109个/L，用RNA酶A 5×105 U/L于37℃水浴作用30 min。加PI(碘化丙锭，propidium iodide) 50 mg/L，30 min后上FCM检测细胞周期G0/G1：G2/M：S值，结果以BD公司MODFIT LT软件分析，计算S期分数。
, 百拇医药
(六)MDA-NeoR细胞的集落形成[1]：培养体系为每毫升含20% FBS、0.3%琼脂、100个细胞的1640液，培养10～14 d后在倒置显微镜下计数集落的数目。此外，还分别观察了EGF 100 μg/L及GM-CSF 106 U/L对其的影响。
(七)MDA-NeoR细胞在裸鼠体内的成瘤能力：将Balb-c裸鼠随机分组，每组6只。选择与MDA细胞生物学特性一致的一株MDA-NeoR细胞按107/只在右侧背部皮下分别接种。观察6周以上，记录两者的成瘤率。
(八)统计学处理：采用上海医科大学编的SMUP-PC生物处理系统作单因素方差分析中的成组t检验，SAS软件作二因素析因分析。
结 果
, 百拇医药
(一)NeoR基因在MDA-NeoR细胞中稳定的整合：在含有G418的培养基中，MDA细胞很快死亡，而MDA-NeoR细胞生长良好，见图1。在所有的7株MDA-NeoR细胞中，PCR均扩增出NeoR基因的特异性条带，见图2。证明原核NeoR基因已在MDA-NeoR细胞中长期稳定整合。
Fig 1 The different growth curves between MDA and MDA-NeoR
cell line cultured with G418 (6×105 U/L)
图1 MDA细胞及MDA-NeoR细胞在含G418培养
, 百拇医药
条件下的生长曲线
Fig 2 The results of NeoR gene integration in the MDA-NeoR
cell line identified by PCR
M:DNA molecular marker; 1 lane: MDA cell line; 2～8 lanes: MDA-NeoR cell
lines, 9 lane: plasmid positive control
图2 PCR鉴定NeoR基因在转基因后MDA细胞中整合的结果
, 百拇医药
(二)NeoR基因对MDA细胞倍增时间的影响：由表1可见，7株MDA-NeoR细胞中有3株的倍增时间较MDA细胞有所延长，但无明显差别(P>0.05)，另4株则与MDA细胞相近。
表1 MDA与MDA-NeoR乳癌细胞倍增时间和S期分数的比较
Tab 1 The comparison of double-cell time and fraction of S-phase
between MDA and MDA-NeoR cell lines (
±s,n=3) Cell lines
Double-cell time(h)
, 百拇医药
Fraction of sphase(%)
MDA
26.6±6.1
52.21±12.81
MDA-NeoR1
26.5±1.8
61.81±2.97
MDA-NeoR2
31.2±13.5
61.11±2.79
MDA-NeoR3
, 百拇医药
31.2±5.5
59.66±5.79
MDA-NeoR4
25.6±0.3
57.96±17.65
MDA-NeoR5
32.9±11.3
63.73±3.48
MDA-NeoR6
26.5±5.0
64.14±6.51
, 百拇医药
MDA-NeoR7
26.9±6.1
61.62±7.78
(三)NeoR基因对MDA细胞周期状态的影响：如表1所示，7株MDA-NeoR细胞的S期分数也无明显改变(P>0.05)。
(四)NeoR基因对MDA细胞表面抗原的影响：FCM检测的结果显示，MDA及MDA-NeoR细胞均不表达CK19与EMA抗原。同时亦表明NeoR基因的整合并未改变这两种抗原在MDA及MDA-NeoR细胞中的表达。
(五)NeoR基因对MDA细胞集落形成能力的影响：在本实验条件下，MDA细胞的平均集落形成率为(86±4)CFU/100个细胞；而7株MDA-NeoR细胞的与之相似，两组相比无明显差异(P>0.05)。并且GM-CSF和EGF对两种细胞的集落形成也无明显刺激或抑制作用，结果见表2。表2 MDA与MDA-NeoR乳癌细胞体外集落形成能力的比较
, 百拇医药
Tab 2 A comparison of tumor colony numbers in vitro between
MDA and MDA-NeoR cell lines (±s,n=3) Cell line
No. of tumor colony formation
No GFs
GM-CSF
EGF
MDA
86±4
, 百拇医药 83±18
82±7
MDA-NeoR1
90±13
86±8
80±6
MDA-NeoR2
86±35
80±22
87±22
MDA-NeoR3
88±14
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88±16
86±8
MDA-NeoR4
79±4
79±6
87±8
MDA-NeoR5
74±14
76±17
88±2
MDA-NeoR6
71±13
, http://www.100md.com
83±14
78±20
MDA-NeoR7
68±11
73±8
69±6
(六)NeoR基因对MDA细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响：MDA细胞组中的2只在接种第4周因感染死亡而未记入总数，其成瘤数为1/4；而MDA-NeoR细胞组中的1只在接种第5周时也因感染死亡亦未记入总数，其成瘤数为2/5。讨 论
细胞倍增时间与周期状态是反映细胞增殖能力的两个最重要指标。通过对比MDA-NeoR与MDA细胞发现，7株MDA-NeoR细胞的S期分数有增高的趋势，而其中3株的细胞倍增时间较MDA细胞延长4.6～6.3 h。这些改变虽然无统计学意义，但向人们展示这样一个事实，即外源基因的整合与表达的确会引起靶细胞原有生物学特性的某些改变。这些改变有时是甚为严重或毙命的，诸如激活靶细胞原癌基因、灭活抗癌基因、启动转化基因或抑制其它相关的功能性基因等。因此，在临床上应用基因治疗策略治疗病人前必须澄清这些重大问题。
, 百拇医药
研究表明，新鲜乳癌细胞95～98%高表达角蛋白CK19抗原，MCF-7乳癌细胞也有一定量的表达[2]，并且两者均高表达EMA抗原；而本研究表明，MDA与MDA-NeoR细胞均不表达CK19和EMA，由此证明NeoR基因的整合也未改变MDA细胞对两种抗原的表达模式，同时亦提示MDA细胞的确为CK19和EMA阴性的乳癌细胞系，有关这方面的研究资料迄今未见报道。
有报道EGF能刺激新鲜乳癌细胞的生长[3]，但对高表达EGF受体的MDA-MB-231却无刺激作用[4]；GM-CSF在体外可促进MCF-7乳癌细胞系的集落形成[5]，并且还能动员体内的乳癌细胞[6]。而本研究显示，所有MDA-NeoR与MDA细胞的集落形成能力是相似的，并且对EGF和GM-CSF的刺激均无反应。更重要的是两者的致瘤特性是相似的[7]。从而也提示MDA细胞与新鲜乳癌细胞及MCF-7乳癌细胞系的生物学特征的确是有明显区别的。
, 百拇医药
总之，我们不但建立了可选择性表达特异标志NeoR基因的人乳癌细胞模型，而且证明外源性原核NeoR基因在MDA细胞基因组中的长期稳定整合与表达对MDA-NeoR人乳癌细胞的生物学特性并无明显影响。这为进一步探索乳癌细胞生物学特性、转移、浸润、微小病变的检测及自身造血干细胞移植前的净化奠定了基础。
参考文献
1 陈姗姗.细胞光度测定与定量分析.见：杨景山主编.医用细胞化学与细胞生物学技术.北京医科大学与中国协和医科大学出版社联合出版，1990.388～401.
2 Moll R, Werner WF, Dorothea LS, et al. The catalog of human cytokeratins: Patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell,1982,31:11.
, 百拇医药
3 Koenders P, Beex L, Kienhuis C, et al. Epidermal growth factor and receptor and prognosis in human breast: a prospective study. Breast Cancer Res Treat,1992,23:134.
4 Fitzpatrick SL, Lachance MP, Schuttz GS, et al. Characterization of epidermal growth factor receptor and action on human breast cancer cells in culture. Cancer Res,1984,44:3442.
5 Dedhar S, Gaboury L, Galloway P, et al. Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor is a growth factor active on a variety of cell types of nonhematopoietic origin. Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:9253.
, 百拇医药
6 Brugger W, Bross KJ, Glatt M, et al. Mobilization of tumor cells and hematopoietic progenitor cells into peripheral blood of patients with solid tumors. Blood,1994,83(3):636.
7 Price JE, Polyzos A, Zhang RD, et al. Tumorigenicity and metastases of human breast cells. Cancer Res,1990,50:717.
(1998年4月15日收稿，1998年10月14日修回), 百拇医药
单位：军事医学科学院附属医院免疫学研究室(北京 100039)
关键词：乳房；癌；细胞；新霉素；基因；生物学
中国病理生理杂志990817 摘 要 目的：通过对比MDA-NeoR与MDA人乳癌细胞的生物学特征，阐明原核标志基因NeoR的长期稳定整合与表达是否对乳癌细胞原有的生物学特性产生影响。方法：对已建立且证实表达NeoR基因>6个月的7株MDA-NeoR细胞系进行G418抗性、表面抗原、细胞倍增时间、细胞周期、肿瘤细胞集落形成及裸鼠体内成瘤能力的检测。结果：MDA-NeoR细胞对高浓度的G418仍产生抗性并表达NeoR基因；其细胞倍增时间、S期分数、肿瘤细胞体外集落形成率与MDA无明显区别(P>0.05)；角蛋白CK19与表面膜抗原EMA的表达在两组是等同的；并且MDA-NeoR 7细胞系在裸鼠体内的成瘤能力与MDA细胞也是相似的。结论：外源标志基因NeoR的长期稳定整合与表达对MDA人乳癌细胞的原有生物学特性无明显影响。
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Biological characteristics of human breast cancer cell line
(MDA) expressing neomycin resistance gene (NeoR)
GUO Si-Qi,XI Yong-Zhi,SONG San-Tai,JIN Li,CHEN Xing-Guo,KONG Fan-Hua
Laboratory of Immunology, Affiliated Hospital for Academy of Military Medical Sciences, Beijing (100039)
Abstract AIM: To compare the biological characters of MDA cell line with MDA-NeoR cell lines, those of expressing neomycin resistance gene (NeoR). METHODS: Several biological characters were identified. They are G418 (geneticin) resistance, the expression of cell membrane antigens, double-cell time, the fraction of cell cycle phase, the numbers of tumor colony formation in vitro and the tumor formation ratio of nude mice in vivo.RESULTS: MDA-NeoR cells cultured in vitro for six months are still endurable for G418(6×105 U/L); The expression of CK19 (cytokeratin 19) and epithelial membrane antigen detected by (flow cytometer ) are negative; Double-cell time, the ratio of cell in S phase, and the colony formation numbers in vitro are insignificant statistically (P>0.05) between MDA and MDA-NeoR cell lines; The tumor formation ratio of nude mice in vivo of MDA and one of MDA-NeoR cell lines are 1/4 and 2/5 respectively, have no difference. CONCLUSION: The integration and expression of hetrogenious NeoR gene do not make any changes in the characters of MDA.
, 百拇医药
MeSH Breast; Carcinoma; Cells; Neomycin; Genes; Biology
为了深入探索乳癌细胞的生物学特性、转移、浸润、微小病变的检测以及自身造血干细胞移植前的净化新策略，新近我们已成功地建立了特异性表达原核标志基因NeoR(neomycin resistance gene，新霉素耐药基因)的人乳癌细胞模型。由于迄今为止所有的转基因方法均缺乏组织特异性或定向性，所转外源基因达不到基因打靶或基因定点整合，因此有可能使整合的外源基因激活靶细胞的原癌基因、灭活抗癌基因、启动转化基因等其它相关的功能性基因，从而引起靶细胞的一系列原有生物学特性的改变。为此，全面系统地阐明NeoR基因在MDA(MDA-MB-231，乳癌细胞系)细胞基因组中的长期稳定整合与表达能否改变该细胞原有的生物学特性显得尤为重要，这也是该模型在被广泛应用之前必须阐明的关键问题。
材料与方法
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(一)材料：MDA-MB-231由军事医学科学院三所陆应麟教授馈赠，7株MDA-NeoR(NeoR基因转入MDA-MB-231)细胞由本室建立并培养>6个月；鼠抗人角蛋白19(cytokeratin 19, CK19)单抗、表面膜抗原(EMA)单抗和异硫氰酸荧光素(FITC)结合的兔抗鼠二抗为DAKO公司产品，碘化丙锭PI为Sigma公司产品；表皮生长因子(EGF)由军事医学科学院八所朱厚础教授馈赠，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)为日本麒麟公司产品；Balb-c裸鼠购自中国医学科学院。
(二)MDA-NeoR细胞对G418(geneticin)的抗性
*国家自然科学基金资助(No.39370272)
及NeoR基因表达的检测：将MDA-NeoR细胞及MDA原代细胞在含有终浓度为6×105 U/L G418的1640培养基中传代培养，观察对G418的抗性；同时提取各细胞的基因组DNA，PCR扩增NeoR基因的特异性产物，以检验NeoR基因的整合。
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(三)MDA-NeoR细胞倍增时间检测：参照文献[1]方法。连续计数培养24、48、72及96 h的细胞，取其平均值，分别计算细胞倍增时间，每一种细胞均重复测定3次。
(四)MDA-NeoR细胞表面抗原的表达：方法见文献[1]。细胞浓度为1010/L，抗CK19和抗EMA单抗的浓度为1：50，FITC(异硫氰酸荧光素)结合二抗的浓度为1：15，标记后用FCM检测。
(五)MDA-NeoR细胞周期状态的检测[1]：按设计定时取所培养的细胞用70%酒精固定后4℃保存。检测时稀释成109个/L，用RNA酶A 5×105 U/L于37℃水浴作用30 min。加PI(碘化丙锭，propidium iodide) 50 mg/L，30 min后上FCM检测细胞周期G0/G1：G2/M：S值，结果以BD公司MODFIT LT软件分析，计算S期分数。
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(六)MDA-NeoR细胞的集落形成[1]：培养体系为每毫升含20% FBS、0.3%琼脂、100个细胞的1640液，培养10～14 d后在倒置显微镜下计数集落的数目。此外，还分别观察了EGF 100 μg/L及GM-CSF 106 U/L对其的影响。
(七)MDA-NeoR细胞在裸鼠体内的成瘤能力：将Balb-c裸鼠随机分组，每组6只。选择与MDA细胞生物学特性一致的一株MDA-NeoR细胞按107/只在右侧背部皮下分别接种。观察6周以上，记录两者的成瘤率。
(八)统计学处理：采用上海医科大学编的SMUP-PC生物处理系统作单因素方差分析中的成组t检验，SAS软件作二因素析因分析。
结 果
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(一)NeoR基因在MDA-NeoR细胞中稳定的整合：在含有G418的培养基中，MDA细胞很快死亡，而MDA-NeoR细胞生长良好，见图1。在所有的7株MDA-NeoR细胞中，PCR均扩增出NeoR基因的特异性条带，见图2。证明原核NeoR基因已在MDA-NeoR细胞中长期稳定整合。
Fig 1 The different growth curves between MDA and MDA-NeoRcell line cultured with G418 (6×105 U/L)
图1 MDA细胞及MDA-NeoR细胞在含G418培养
, 百拇医药
条件下的生长曲线
Fig 2 The results of NeoR gene integration in the MDA-NeoR
cell line identified by PCR
M:DNA molecular marker; 1 lane: MDA cell line; 2～8 lanes: MDA-NeoR cell
lines, 9 lane: plasmid positive control
图2 PCR鉴定NeoR基因在转基因后MDA细胞中整合的结果
, 百拇医药
(二)NeoR基因对MDA细胞倍增时间的影响：由表1可见，7株MDA-NeoR细胞中有3株的倍增时间较MDA细胞有所延长，但无明显差别(P>0.05)，另4株则与MDA细胞相近。
表1 MDA与MDA-NeoR乳癌细胞倍增时间和S期分数的比较
Tab 1 The comparison of double-cell time and fraction of S-phase
between MDA and MDA-NeoR cell lines (
±s,n=3) Cell linesDouble-cell time(h)
, 百拇医药
Fraction of sphase(%)
MDA
26.6±6.1
52.21±12.81
MDA-NeoR1
26.5±1.8
61.81±2.97
MDA-NeoR2
31.2±13.5
61.11±2.79
MDA-NeoR3
, 百拇医药
31.2±5.5
59.66±5.79
MDA-NeoR4
25.6±0.3
57.96±17.65
MDA-NeoR5
32.9±11.3
63.73±3.48
MDA-NeoR6
26.5±5.0
64.14±6.51
, 百拇医药
MDA-NeoR7
26.9±6.1
61.62±7.78
(三)NeoR基因对MDA细胞周期状态的影响：如表1所示，7株MDA-NeoR细胞的S期分数也无明显改变(P>0.05)。
(四)NeoR基因对MDA细胞表面抗原的影响：FCM检测的结果显示，MDA及MDA-NeoR细胞均不表达CK19与EMA抗原。同时亦表明NeoR基因的整合并未改变这两种抗原在MDA及MDA-NeoR细胞中的表达。
(五)NeoR基因对MDA细胞集落形成能力的影响：在本实验条件下，MDA细胞的平均集落形成率为(86±4)CFU/100个细胞；而7株MDA-NeoR细胞的与之相似，两组相比无明显差异(P>0.05)。并且GM-CSF和EGF对两种细胞的集落形成也无明显刺激或抑制作用，结果见表2。表2 MDA与MDA-NeoR乳癌细胞体外集落形成能力的比较
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Tab 2 A comparison of tumor colony numbers in vitro between
MDA and MDA-NeoR cell lines (
±s,n=3) Cell lineNo. of tumor colony formation
No GFs
GM-CSF
EGF
MDA
86±4
, 百拇医药 83±18
82±7
MDA-NeoR1
90±13
86±8
80±6
MDA-NeoR2
86±35
80±22
87±22
MDA-NeoR3
88±14
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88±16
86±8
MDA-NeoR4
79±4
79±6
87±8
MDA-NeoR5
74±14
76±17
88±2
MDA-NeoR6
71±13
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83±14
78±20
MDA-NeoR7
68±11
73±8
69±6
(六)NeoR基因对MDA细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响：MDA细胞组中的2只在接种第4周因感染死亡而未记入总数，其成瘤数为1/4；而MDA-NeoR细胞组中的1只在接种第5周时也因感染死亡亦未记入总数，其成瘤数为2/5。讨 论
细胞倍增时间与周期状态是反映细胞增殖能力的两个最重要指标。通过对比MDA-NeoR与MDA细胞发现，7株MDA-NeoR细胞的S期分数有增高的趋势，而其中3株的细胞倍增时间较MDA细胞延长4.6～6.3 h。这些改变虽然无统计学意义，但向人们展示这样一个事实，即外源基因的整合与表达的确会引起靶细胞原有生物学特性的某些改变。这些改变有时是甚为严重或毙命的，诸如激活靶细胞原癌基因、灭活抗癌基因、启动转化基因或抑制其它相关的功能性基因等。因此，在临床上应用基因治疗策略治疗病人前必须澄清这些重大问题。
, 百拇医药
研究表明，新鲜乳癌细胞95～98%高表达角蛋白CK19抗原，MCF-7乳癌细胞也有一定量的表达[2]，并且两者均高表达EMA抗原；而本研究表明，MDA与MDA-NeoR细胞均不表达CK19和EMA，由此证明NeoR基因的整合也未改变MDA细胞对两种抗原的表达模式，同时亦提示MDA细胞的确为CK19和EMA阴性的乳癌细胞系，有关这方面的研究资料迄今未见报道。
有报道EGF能刺激新鲜乳癌细胞的生长[3]，但对高表达EGF受体的MDA-MB-231却无刺激作用[4]；GM-CSF在体外可促进MCF-7乳癌细胞系的集落形成[5]，并且还能动员体内的乳癌细胞[6]。而本研究显示，所有MDA-NeoR与MDA细胞的集落形成能力是相似的，并且对EGF和GM-CSF的刺激均无反应。更重要的是两者的致瘤特性是相似的[7]。从而也提示MDA细胞与新鲜乳癌细胞及MCF-7乳癌细胞系的生物学特征的确是有明显区别的。
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总之，我们不但建立了可选择性表达特异标志NeoR基因的人乳癌细胞模型，而且证明外源性原核NeoR基因在MDA细胞基因组中的长期稳定整合与表达对MDA-NeoR人乳癌细胞的生物学特性并无明显影响。这为进一步探索乳癌细胞生物学特性、转移、浸润、微小病变的检测及自身造血干细胞移植前的净化奠定了基础。
参考文献
1 陈姗姗.细胞光度测定与定量分析.见：杨景山主编.医用细胞化学与细胞生物学技术.北京医科大学与中国协和医科大学出版社联合出版，1990.388～401.
2 Moll R, Werner WF, Dorothea LS, et al. The catalog of human cytokeratins: Patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell,1982,31:11.
, 百拇医药
3 Koenders P, Beex L, Kienhuis C, et al. Epidermal growth factor and receptor and prognosis in human breast: a prospective study. Breast Cancer Res Treat,1992,23:134.
4 Fitzpatrick SL, Lachance MP, Schuttz GS, et al. Characterization of epidermal growth factor receptor and action on human breast cancer cells in culture. Cancer Res,1984,44:3442.
5 Dedhar S, Gaboury L, Galloway P, et al. Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor is a growth factor active on a variety of cell types of nonhematopoietic origin. Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:9253.
, 百拇医药
6 Brugger W, Bross KJ, Glatt M, et al. Mobilization of tumor cells and hematopoietic progenitor cells into peripheral blood of patients with solid tumors. Blood,1994,83(3):636.
7 Price JE, Polyzos A, Zhang RD, et al. Tumorigenicity and metastases of human breast cells. Cancer Res,1990,50:717.
(1998年4月15日收稿，1998年10月14日修回), 百拇医药