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编号:10271538
大鼠细动脉平滑肌细胞内酸中毒对ATP敏感钾通道的影响
http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 1999年第8期
     作者:刘杰 赵克森 金春华

    单位:第一军医大学病理生理教研室(广州 5105515)

    关键词:酸中毒;小动脉;肌;平滑;大鼠

    中国病理生理杂志990807 摘 要 目的:研究细胞内酸中毒对细动脉平滑肌细胞膜KATP通道的影响。方法:应用膜片钳技术的内面向外式记录酶性分离的细动脉平滑肌上KATP通道。结果:当细胞内无ATP时,细胞内酸中毒降低通道电导,通道平均开放时间(Tom)和开放时间长成分有所增大,对通道开放概率无明显影响;当细胞内有ATP时,细胞内酸中毒使通道电导增大,通道开放概率增加。结论:平滑肌细胞内酸中毒减弱ATP对KATP通道的抑制作用,并能在ATP存在条件下激活KATP通道,是酸中毒降低血管平滑肌反应性的重要机制之一。

, http://www.100md.com     Effect of intracellular acidosis on ATP-sensitive K+ channels

    in arteriolar smooth muscle cells

    LIU Jie, ZHAO Ke-Sen, JIN Chun-Hua

    Department of Pathophysiology, The First Military Medical University, Guangzhou (510515)

    Abstract AIM:To study the effect of intracellular acidosis on KATP channels.METHODS:The currents of KATP channels were recorded on inside-out patches of enzymatically isolated arteriolar smooth muscle cells.RESULTS:In the absence of ATP, a decrease of intracellular pH (pHi) significantly reduced the single channel conductance. The mean open time and time constant for open time were slightly increased. In the presence of ATP, a decrease of pHi significantly increased the single channel conductance and the open probability. CONCLUSIONS:Intracellular acidosis markedly reduced the inhibitory effect of ATP on KATP channels in excised patches from arteriolar smooth muscle and activated these channels in the presence of ATP. The activation of KATP channels might be one of the mechanisms for acidosis decreasing vascular reactivity.
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    MeSH Acidosis; Arterioles; Muscle, smooth;Rats

    自从ATP敏感钾通道(KATP)在心肌发现以来,又先后在胰岛β-细胞,骨骼肌,平滑肌和神经元发现该通道的存在。不同组织,通道活性的调节机制不同,各自所起的生理作用不同。在血管平滑肌细胞,KATP通道对膜电位和血管张力的调节起重要作用[1]。KATP通道对细胞内ATP十分敏感,细胞内ATP抑制通道活性[2]。此外,它还受代谢因素调节。已发现细胞内酸中毒改变心肌、骨骼肌、胰岛β-细胞KATP通道活性[3~5],继而影响它们的收缩和分泌功能。血管平滑肌细胞内酸中毒发生于许多疾病和病理过程,我室曾发现,重症休克后期,细动脉平滑肌细胞内发生严重酸中毒,减弱血管的舒缩功能。但细胞内酸中毒减弱平滑肌舒缩功能的机制尚不清楚,至今未见其对KATP通道作用的报道。因此,本实验将应用膜片钳技术,探讨血管平滑肌细胞内酸中毒对KATP通道的影响,从细胞、分子水平阐明细胞内酸中毒减弱血管反应性的机制。
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    材料与方法

    (一)细动脉平滑肌细胞分离:采用我室建立的细动脉平滑肌分离方法[6]。健康成年SD大鼠,雌雄不拘,体重180~220 g。断头处死后,打开腹腔,用含0.1%胰蛋白酶的无钙HPSS液(HPSS mmol/L:NaCl 130, KCl 5,MgCl2 1.2, CaCl2 1.5, hepes 10, glucose 10, pH 7.2)灌注肠系膜血管床10 min以去除血管内皮。分离肠系膜2~3级细动脉(直径<120 μm),在36℃下,用含链酶蛋白酶E 1~1.5 mg/mL的HPSS液消化20 min左右。取出血管用HPSS液彻底清洗残余酶,用针头将血管分离成丝状,再用吸管反复吹打使细胞游离。将含细胞液体吸入离心管静置竖立约2 min,让未散开的大块组织下沉,取上部细胞悬液置于4℃冰箱备用。经透射电镜超微结构观察及培养分离细胞用抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体鉴定为平滑肌细胞。

, 百拇医药     (二)单离子通道记录和分析:采用膜片钳技术的内面向外式。充灌电极和浴槽液同为高钾溶液,此时细胞膜静息电位接近0 mV,便于K+通道的识别和结果分析。电极液为(mmol/L):KCl 140, MgCl2 1, CaCl2 2, CdCl2 0.3, TTX 0.001, hepes10, pH7.2。浴槽液为细胞内膜面所接触的液体,相当于细胞内液(mmol/L):KCl 120, KOH 20, EGTA 5, MgCl2 1, TTX 0.001, hepes 10, 根据需要加或不加K2-ATP,通过改变KOH浓度使浴槽液pH调整到所需的7.2, 7.0, 6.8。

    玻璃微电极用微电极拉制器(PE-7,Narishige)常规两步法拉制,尖端直径为0.5~1.5 μm,充灌液体后电阻约为8~16 MΩ。记录电流经膜片钳放大器(CEZ-2300, KOHDEN)放大,探头反馈电阻10 GΩ。低通滤波频率为3 kHz。计算机Fetchex程序采样。
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    用pCLAMP分析程序Fetchan进行开关事件的测量,设定通道开、关事件时间分辨率为200 μs,测量幅度的时间分辨率为500 μs,测量结果用pSTAT程序进行统计分析。

    所有统计学处理均用Microsoft Excel进行,数据用±s,各参数比较用Student's t检验,以P<0.05为差异显著性界限。

    结 果

    (一)KATP通道的鉴定:由于电极液中加有TTX阻断了Na+通道,使用CdCl2阻断了Ca2+通道,在0 mV, -20 mV,-40 mV钳制电压下,电流幅度分别为0,-3.06,-6.26 pA,对二者用回归分析,发现通道反转电位在0 mV附近,因此记录的电流是钾通道电流。向浴槽液中加入ATP能阻断通道电流,这是KATP通道的特点,证明所记录的通道为KATP通道。
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    (二)浴槽液中无ATP时,H+对细动脉平滑肌KATP通道的影响:在细胞内面向外式记录时,电流幅度在同一钳制电压下基本相同,其幅度分布直方图呈对称的单峰状,并能很好地进行正态拟合。实验记录了-20 mV和-40 mV钳制电压下,pH分别为7.2,7.0,6.8时单通道电流幅度。发现随着pH降低,电流幅度有降低趋势,pH越低,相同钳制电压下电流幅度越小(表1)。

    表1 平滑肌细胞内缺乏ATP时细胞内H+对KATP

    通道电流幅度(pA)的影响

    Tab 1 Effect of intracellular H+ on amplitude (pA) of KATP channel

    in arteriolar smooth muscle cells in the absence of ATP Voltage
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    Amplitude

    (pH)7.2

    7.0

    6.8

    -20mv

    3.06±0.40

    2.61±0.46**

    2.59±0.71

    (n)

    8

    8

    5
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    -40mV

    6.27±1.56

    5.77±1.53

    5.45±0.31

    (n)

    8

    8

    5

    **P<0.01, vs pH7.2

    通道开放以单个独立开放(Single)和短簇状开放(Burst)为主(图1),通道开放时程分布直方图呈指数分布,且符合双指数拟合。随pH由7.2向6.8递减,通道开放时间Tom、通道开放时间长成分τ02有所延长,但与pH7.2相比无显著差异(P>0.05);通道开放概率Po各pH值之间无显著差异(P>0.05)(表2)。 Fig 1 The currents of KATP channel on arteriolar smooth muscle cells in an inside-out patch
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    (A):Single channel currents in pHi 7.2 in the absence of ATP;

    (B):The same channel currents in the presence of 0.5 mmol/L ATP;

    (C): pHi was changed to 6.8; Holding potential:-60mV.

    c:close; o:open

    图1 细动脉平滑肌KATP通道电流图

    表2 平滑肌细胞内缺乏ATP时细胞内H+对KATP通道动力学的影响

    Tab 2 Effect of intracellular H+ on the kinetic properties of KATP channels in isolated rat
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    arteriolar smooth muscle cells in the absence of ATP Channel

    -20 mV

    -40 mV

    properties

    pH7.2

    pH7.0

    pH6.8

    pH7.2

    pH7.0

    pH6.8

    (n=8)
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    (n=8)

    (n=5)

    (n=8)

    (n=8)

    (n=5)

    τo1(ms)

    3.90±2.13

    3.14±2.70

    1.96±2.35

    3.80±1.90

    3.91±1.88

    3.27±3.17
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    τo2(ms)

    12.86±8.97

    18.15±18.20

    25.00±10.65

    14.83±13.38

    18.84±17.38

    24.04±21.47

    Tom(ms)

    3.09±0.88

    3.19±1.53

    3.62±2.73
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    3.87±1.74

    4.18±2.48

    5.10±1.97

    SCo

    0.44±0.20

    0.39±0.20

    0.46±0.24

    0.52±0.19

    0.47±0.24

    0.56±0.33

    Po(%)

    2.03±2.13
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    2.06±3.60

    2.86±2.19

    3.16±2.83

    4.49±3.73

    3.18±3.77

    τo1 and τo2=the time constants of component 1 and 2 for open times; Tom= mean open time; SCo=short constiuents of open time; Po=open probability

    (三)浴槽液中有ATP时,H+对细胞脉平滑肌KATP通道的影响:浴槽液内加入0.2 mmol/L ATP,通道的活动明显减弱(图1)。
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    在-40 mV钳制电压下共记录6例膜片(来自6只大鼠),单通道电流幅度在pH7.2时为(-4.78±1.08) pA,在pH 6.8时电流幅度增大为(-6.44±2.86) pA。

    在浴槽液内有ATP时,酸中毒对通道开放概率Po影响最为明显。pH7.2时,Po为0.016±0.011, pH6.8时,Po为0.151±0.148,升高9.4倍。

    讨 论

    细动脉张力的调节主要受代谢因素影响,休克时平滑肌细胞内酸中毒是改变血管张力,减弱血管反应性的重要因素,严重时可导致外周血管麻痹,顽固性低血压,以致威胁患者生命。血管张力和舒缩功能受KATP通道激活或抑制状态的影响,研究细胞内酸中毒对平滑肌KATP通道的作用对于阐明发病机制具有重要意义。

    本实验发现,当平滑肌细胞内无ATP时,细胞内酸中毒可使KATP通道在不同钳制电压下电流幅度下降,电导降低;通道开放时间Tom有所延长,开放时间长成分τo2增大,但改变无明显差异;细胞内酸中毒不影响通道开放概率。而当细胞内有ATP时,细胞内酸中毒使通道电导增大,通道开放概率增加,提示细胞内酸中毒使细胞内ATP对通道抑制作用减弱,并能在ATP存在的条件下激活KATP通道。生理条件下,细胞内通常含有毫摩尔数量级的ATP,几乎可使细胞膜上KATP通道基本完全抑制[7]。通常,通道的半数抑制浓度很低,心肌细胞的半数抑制浓度仅为20~30 μmol/L ATP[8]。即使出现严重代谢阻滞时,并不能使细胞内ATP完全耗竭,此时,当平滑肌细胞内酸中毒时可激活KATP通道,通过使平滑肌细胞超极化,引起平滑肌松弛和反应性降低。我室曾发现重症休克后期,细动脉平滑肌细胞内酸中毒,平滑肌呈超极化改变,而KATP通道特异性阻滞剂优降糖能减轻超极化改变[9],说明KATP通道激活可能是重症休克酸中毒所致血管反应性降低的机制之一。
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    参考文献

    1 Quast U, Guillon JM, Cavero I. Cellular pharmacology of potassium channel openers in vascular smooth muscle. Cardiovaasc Res, 1994, 28:805.

    2 Michel Lazdunski. ATP-sensitive potassium channels:An overreview. J Cardiovasc Pharmacol, 1994, 24(suppl 4):S1.

    3 Fan Z, Makielski JC. Intracellular H+ and Ca2+ modulation of trypsin-modified ATP-sensitive K+ channels in rabbit ventricular myocytes. Circ Res, 1993, 72:715.
, 百拇医药
    4 Davies NW. Modulation of ATP-sensitive K+ channels in skeletal muscle by intracellular protons. Nature, 1990, 343:375.

    5 Porks P, Makoto Takano, Ashcroft FM. Effects of intracellular pH on ATP-sensitive K+ channels in mouse pancreatic β-cells. J Physiol, 1994, 475:33.

    6 刘 杰,赵克森.钙动力学变化在重症休克血管反应性低下发生中的作用.中华创伤杂志,1997, 13:333.

    7 Quast U. Potassium channel openers:pharmacological and clinical aspects. Fundam Clin Pharmacol, 1992, 6:279.

    8 Bindlay I, Baivre JE, ATP-sensitive K channel in heart muscle, Spare channels. FEBS Lett, 1991, 279:95.

    9 刘 杰,赵克森.重症休克大鼠细动平滑肌膜电位变化在血管反应性降低中的作用.中国病理生理杂志,1998,14:39.

    (1998年3月3日收稿,1998年8月28日修回), 百拇医药