血小板活化因子在颈髓损伤后线粒体功能损伤中的作用*
作者：肖建如 魏运栋 陆永坚 侯铁胜 赵定麟
单位：第二军医大学长征医院骨科(上海 200003)
关键词：创伤和损伤；线粒体；血小板活化因子；受体
血小板活化因子在颈髓损伤后线粒体 功能损伤中的作用 摘 要 目的和方法：采用Allen打击法造成C6.7损伤，鞘内注射血小板活化因子(PAF)及静脉注射PAF受体拮抗剂NB52021，观察其对颈髓损伤后脊髓组织PAF含量、颈髓线粒体ATP酶活性、线粒体呼吸功能的影响。结果：颈髓损伤后颈髓组织PAF含量明显增加、蛛网膜下腔注射PAF可使伤后PAF含量增加更为显著；PAF能够抑制Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，明显降低线粒体耗氧量(OUR)、呼吸控制率(RCR)、磷氧比值(P/O)、氧化磷酸化效率(OPR)：而BN52021能够抑制伤后颈髓组织PAF含量的增加，维持伤后线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性的相对稳定，减轻线粒体功能损害。结论：PAF及其受体在颈髓损伤后颈髓线粒体功能损害的病理生理过程中起重要作用，PAF受体拮抗剂能够有效地保护颈髓损伤后线粒体功能。
, 百拇医药
Effects of platelet activating factor and its receptor on mitochondrial
function damage after cervical cord injury
XIAO Jian-Ru, HU Ye-Feng, LU Yong-Jian, HOU Tie-Sheng, ZHAO Ding-Lin
Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai (200003)
Abstract AIM and METHODS:C6,7 spinal cord injury models were performed in cats by Allen's method. Platelet activating factor (PAF) and PAF receptor antagonist BN52021 were administered by intrathecal or intravenous injection respectively. Their effects on PAF level, mitochondrial ATPase activity, mitochondrial function in cervical cord were observed after cervical cord injury. RESULTS：PAF levels in cervical cord tissue significantly increased following trauma. PAF levels were evidently elevated by arachnoid space injection of PAF. PAF receptor antagonist BN52021 could inhibit the increase of PAF levels in the cervical cord tissue following trauma; PAF could inhibit mitochondrial Na+-K+-ATPase, Ca2+-Mg2+-ATPase activities and evidently decrease mitochondrial oxygen uptake rate (OUR), respiratory control rate (RCR), P/O ratio and oxidative phosphorylation rate (OPR); PAF receptor antagonist BN52021 could sustain the relative stability of Na+-K+-ATPase, Ca2+-Mg2+-ATPase activity and improve mitochondrial respiratory function. CONCLUSION：PAF and its receptor play an important role in the pathophysiology process of mitochondrial function damage after cervical cord injury. PAF antagonist can effectively protect mitochondrial function after trauma.
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MeSH Wound and injuries; Mitochondrial; Platelet activating factor; Receptor
如何改善颈髓损伤后颈髓神经功能损害、降低瘫痪及死亡率是临床迫切需要解决的课题。线粒体是细胞功能活跃的亚细胞器，细胞生命活动所需能量90%以上由线粒体氧化磷酸化提供，线粒体功能改变直接影响神经细胞的功能。近年来，血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)在脑中风、脑水肿中的作用倍受关注[1]，至于PAF及其受体对颈髓损伤后颈髓线粒体功能的作用研究甚少。本实验采用超速离心法分离颈髓细胞粒体，观察了PAF及其受体拮抗剂BN52021对颈髓损伤后线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性及线粒体呼吸功能的影响，从亚细胞水平探讨PAF及其受体对脊髓损伤后继发性损害的作用机制。
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材料与方法
(一)颈髓损伤模型复制及分组：健康成年雄性猫70只，体重2.5～3.5 kg,随机分成假手术组(对照组)、单纯脊髓损伤组(simply spinal cord injury, SSCI)、脊髓损伤(SCI)+人工脑脊液组(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)、SCI+PAF组、SCI+BN52021组。每组14只。各组动物均用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg ip)麻醉。咬除C6,7椎板，显露硬膜囊，用Allen打击法造成C6,7段脊髓挫伤，致伤力为350 g/cm。对照组仅咬除上述椎板。所有动物均行右股动、静脉插管。输液使血压维持在13 kPa以上。
(二)给药方式：SCI+PAF及其SCI+ACSF组于受伤前2 min在枕大池蛛网膜下腔向C6，7 相应部位插入1根PE10导管，分别经导管缓慢注入PAF 40 nmol/L(Sigma公司)，溶于ACSF 15 μL,SCI+ACSF组注射等量的ACSF(含131.8 mmol/L NaCl,24.6 mmol/L NaHCO3,2 mmol/L CaCl2, 3 mmol/L KCl, 0.65 mmol/L MgCl2, 6.7 mmol/L 尿素， 3.7 mmol/L glucose; pH 7.1，渗透压为302 nmol/L);SCI+BN52021组于受伤后2 h向右股静脉注射BN52021 10 mg/kg。
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(三)PAF含量测定：每组各取6只动物，伤后或术后6 h迅速切取C6,7段脊髓组织，称重后立即放入冷终止反应液(氯仿∶甲醇∶冰醋酸1∶2∶0.04 mL)3 mL中，采用改良的Bligh-Dyer方法和薄层分析分离技术[2]提取PAF。采用PAF定量生物分析技术[3]计算出样品中PAF含量。
(四)颈髓细胞线粒体提取方法：按改良的Koide法[4]，各组于术后或伤后相应时间切取C6，7颈髓组织，称重后迅速放入冷缓冲A液中(含0.32 mol/L蔗糖、10 mmol/L EGTA\, 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4),1 000 g离心10 min，取上清液17 000×g离心20 min，沉淀置于缓冲液B中(含0.32 mol/L 蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4)，在7.5%、12% Ficoll组成的不连续密度梯度上，以68 000×g离心1 h，其沉淀物即为线粒体，置于缓冲B液中低温保存待测。
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(五)线粒体ATP酶活性测定：按Faden法[5]测定Na+-K+-ATP酶活性，反应液成分(mmol/L):NaCl 68,KCl 28,MgCl2 4.5， ATP 30，L-组氨酸69，EGTA18，Tris-HCl 50,pH7.4，有或无oubain条件下释放磷之差值即为该酶之活性。根据改良的Chan法[6]测定Ca2++Mg2+-ATP酶活性，反应液成分(mmol/L):MgCl2 4.5，NaCl 68,KCl 28, Tris-HCl 50, pH 7.4, L-组氨酸69，ATP30，ouabain 1.0，有或无CaCl2 2.0。测定方法同上。在有或无CaCl2条件下释放磷之差值即为该酶活性。ATP酶单位表示：mol Pi/mg pro.h-1。
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(六)线粒体呼吸功能测定：用测氧仪连接台式自动平衡记录仪和恒温水，通过氧电极在30℃测定密闭连接搅拌的反应体系中的线粒体耗氧量，并根据线粒体耗氧量(nmo1O/min.mg-1pro)换算出线粒体体呼吸控制率、磷氧比值、氧化磷酸化效率nmol ATP/min.mg-1pro。
(七)统计学处理：所有数据以
±s表示，作双侧t检验。
结 果
(一)颈髓组织PAF含量的变化：各损伤组伤后6 h颈髓组织PAF含量均不同程度高于对照组(P<0.01)。其中以SCI+PAF组最为显著；明显高于SSCI(P<0.05)，SCI+BN52021组颈髓PAF含量明显低于单纯颈髓损伤组(P<0.01，见表1)。
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表1 颈髓损伤后颈髓组织PAF含量变化
Tab 1 Alteration of PAF levels in cervical cord tissue
after cervical cord injury(pg/g,±s,n=6)
Group
PAF
Control
294.61±91.07
SSCI
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2461.33±316.42**
SCI+ACSF
2495.28±362.04**
SCI+PAF
2986.47±379.72**△
SCI+BN52021
947.82±121.93**△△
**P<0.01, vs control; △P<0.01, △△P<0.01, vs SSCI
(二)颈髓线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性的变化：颈髓损伤各组伤后6 h颈髓线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性均有不同程度低于对照组，尤以SCI+PAF组为甚，与SCI比较有显著差异(P<0.05)。而SCI+BN52021组Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性高于SSCI组，与SSCI组也有显著差异(P<0.05)。SCI+ACSF组与SSCI之间无明显差异(P>0.05)。见表2。
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表2 颈髓损伤后颈髓线粒体ATP酶活性的变化
Tab 2 Alteration of cervical cord mitochondrial ATPase activity
after cervical cord injury (μmolPi.h-1/mg protein,±s, n=8)
Group
Na+-K+-ATPase
Ca2+-Mg2+-ATPase
, 百拇医药
Control
43.06±2.73
29.27±2.59
SSCI
24.32±2.95**
16.84±2.42**
SCI+ACSF
25.11±2.37**
17.02±2.31**
SCI+PAF
18.34±2.76**△
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10.29±2.28**△
SCI+BN52021
32.57±2.96**△
22.81±2.62**△
**P<0.01, vs control; △P<0.05,vs SSCI
(三)颈髓线粒体呼吸功能变化：颈髓损伤各组伤后6 h线粒体OUR、RCR、P/O值、OPR均不同程度低于对照组；其中以SCI+PAF组最为明显，与SSCI组比较有显著差异(P<0.05)。而SCI+BN52021组上述线粒体呼吸功能指标均显著高于SSCI组，与SSCI组比较也有显著差异(P>0.05)；其中，OUR、RCR接近对照组(P>0.05)。SCI+ACSF与SSCI之间无明显差异(P>0.05)。
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表3 颈髓损伤后颈髓线粒体功能的变化
Tab 3 Alteration of cervical cord mitochondral function after cervical cord injury(±s, n=8)
Group
OUR
RCR
P/O
OPR
Control
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189.63±32.71
6.08±0.78
2.64±0.41
383.63±46.01
SSCI
143.02±19.21*
4.68±0.63*
1.43±0.21**
240.94±57.26**
SCI+ACSF
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150.12±2109.86±
4.65±0.67*
1.46±0.27**
253.41±62.03**
SCI+PAF
18.54**△4.01*
3.71±0.59**△
0.94±0.18**△
173.52±41.34**△
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SCI+BN52021
165.17±24.06△
5.49±0.61△
1.95±0.27*△
313.36±50.12*△
*P<0.05,**P<0.01, vs control; △P<0.05, vs SSCI; OUR=oxygen uptake rate; RCR=respiratory control rate; P/O=phosphonium/oxgen; OPR=oxidative phosphorylation rate
讨 论
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颈髓损伤后颈髓组织继发性水肿、坏死是导致脊髓神经功能难以逆转及死亡的主要因素，其发生机制颇为复杂。本实验结果显示，颈髓损伤后颈髓组织PAF含量均明显增高，尤以SCI+PAF组为甚，而SCI+BN52021组颈髓组织PAF含量均较单纯颈髓损伤组明显降低。说明PAF对颈髓损伤后继发性损害的发生、发展具有重大影响。伤后脊髓组织PAF含量增高，可能系颈髓损伤后PAF合成的关键酶(PLA2和乙酰基转移酶)活性、浓度增高，刺激膜磷脂代谢，PLA2加速磷脂酰胆碱水解为溶血PAF，乙酰基转移酶促使溶血PAF乙酰化为PAF有关[1]。在创伤等应激条件下，血小板、血管内皮细胞、神经细胞均能产生大量PAF，PAF产生生物效应需要与靶细胞膜上的PAF特异性受体结合。作者在另一组实验中发现脊髓神经细胞膜存在PAF受体，PAF与其受体结合激活G蛋白、磷脂酶C，其信息转导机制是属于二酰甘油三磷酸肌醇和钙信使体系，分别引起细胞外Na+、 Ca2+内流、细胞内K+外流，造成细胞内Na+、 Ca2+浓度增加，K+浓度降低[7]。
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随着对脊髓损伤后继发性损害发生、发展机理认识的深入，线粒体等亚细胞器在继发性损伤中的作用受到重视。线粒体是氧自由基产生的场所，线粒体结构上特殊的脂质是氧自由基损伤的易感部位，而线粒体在细胞内环境稳定中起重要作用。本实验结果发现，颈髓损伤早期线粒体Na+-K+-ATP酶(钠泵)活性降低，PAF可明显抑制线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，Na+-K+-ATP酶活性对维持线粒体膜内外Na+、水平衡起重要作用，Na+-K+-ATP酶活性的明显降低，势必导致线粒体发生肿胀。同时，线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶活性亦明显降低，这样，线粒体内发生钙超载，触发一系列病理反应包括自由基反应，导致线粒体的呼吸功能障碍，从而加重颈髓组织缺氧、缺血，促进颈髓水肿的发生、发展和不可逆性的神经元损伤[8]。PAF受体拮抗剂BN52021能够调节Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，维持细胞内外Na+、K+、Ca2+、Mg2+浓度的相对平衡稳定。本实验结果还发现，颈髓线粒体在颈髓损伤后出现线粒体呼吸功能损害，PAF能加重线粒体呼吸功能损害，PAF受体拮抗剂BN52021能减轻线粒体呼吸功能损害。颈髓损伤后颈髓组织PAF、自由基的大量增加及PAF对自由基的介导作用，造成线粒体膜脂质的过氧化，损害线粒体的功能。颈髓损伤时，由于线粒体呼吸链电子传递发生障碍，还原型辅酶Ⅰ(NADH)得不到氧化而堆积，NADH是有效的电子供体，可使溶解在膜脂中的氧分子单价还原，即所谓线粒体单价泄漏，而导致的氧自由基不断生成。同时，PAF和自由基是一种活性很强的炎性介质，主要破坏膜脂质，使其上的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性下降，造成恶性循环。然而，PAF受体拮抗剂保护线粒体功能的机制可能与阻断PAF受体，抑制PAF的合成和生物效应，稳定线粒体系列酶的活性有关。
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* 国家自然科学基金资助(39870759)
参考文献
1 Lindsberg PG, Yue TL, Frerichs KU, et al. Evidence for platelet activating factor as a nervel mediator in experimental stroke in rabbit. Stroke, 1990, 21:1452.
2 Bligh EG, Dyer WJ. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol, 1959, 37:911.
3 Lalau KC, Coeffer E, Tence M, et al. Production and effect of PAF induced in vitro aggregation of rabbit and human platelet. Thromb Res, 1984, 34:346.
, 百拇医药
4 Koide T, Asano T, Matsuhita H, et al. Enhancement of ATPase activity by a lipid peroxide of AA in rat brain microvessels. J Neurochem, 1986, 46:235.
5 Faden AI, Chan Ph, Longar S. Alteration in lipid metabolism, Na+, K+ATPase activity, and tissue water content of spinal cord follwing experimental traumatic injury. J Neurochem, 1987, 48:1809.
6 Chan KM, Delfert D, Junger KD, et al. A direct colorimetric assay for Ca stimulated ATPase activity. Anal Biochem, 1986, 157:375.
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7 肖建如，赵定麟，贾连顺，等.血小板活化因子受体对脊髓损伤后继发性损害的影响.中华医学杂志，1996，76：120.
8 Anderson DK. Lipid hydrolysis and peroxidation in injuried spinal cord: Partial protection with methylprednisolone or vitamin E and selenium. Cent methylprednisolone or vitamin E and selenium. Cent Nerv Syst Trauma, 1985, 2:257.
(1997年3月12日收稿，1998年3月3日修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长征医院骨科(上海 200003)
关键词：创伤和损伤；线粒体；血小板活化因子；受体
血小板活化因子在颈髓损伤后线粒体 功能损伤中的作用 摘 要 目的和方法：采用Allen打击法造成C6.7损伤，鞘内注射血小板活化因子(PAF)及静脉注射PAF受体拮抗剂NB52021，观察其对颈髓损伤后脊髓组织PAF含量、颈髓线粒体ATP酶活性、线粒体呼吸功能的影响。结果：颈髓损伤后颈髓组织PAF含量明显增加、蛛网膜下腔注射PAF可使伤后PAF含量增加更为显著；PAF能够抑制Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，明显降低线粒体耗氧量(OUR)、呼吸控制率(RCR)、磷氧比值(P/O)、氧化磷酸化效率(OPR)：而BN52021能够抑制伤后颈髓组织PAF含量的增加，维持伤后线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性的相对稳定，减轻线粒体功能损害。结论：PAF及其受体在颈髓损伤后颈髓线粒体功能损害的病理生理过程中起重要作用，PAF受体拮抗剂能够有效地保护颈髓损伤后线粒体功能。
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Effects of platelet activating factor and its receptor on mitochondrial
function damage after cervical cord injury
XIAO Jian-Ru, HU Ye-Feng, LU Yong-Jian, HOU Tie-Sheng, ZHAO Ding-Lin
Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai (200003)
Abstract AIM and METHODS:C6,7 spinal cord injury models were performed in cats by Allen's method. Platelet activating factor (PAF) and PAF receptor antagonist BN52021 were administered by intrathecal or intravenous injection respectively. Their effects on PAF level, mitochondrial ATPase activity, mitochondrial function in cervical cord were observed after cervical cord injury. RESULTS：PAF levels in cervical cord tissue significantly increased following trauma. PAF levels were evidently elevated by arachnoid space injection of PAF. PAF receptor antagonist BN52021 could inhibit the increase of PAF levels in the cervical cord tissue following trauma; PAF could inhibit mitochondrial Na+-K+-ATPase, Ca2+-Mg2+-ATPase activities and evidently decrease mitochondrial oxygen uptake rate (OUR), respiratory control rate (RCR), P/O ratio and oxidative phosphorylation rate (OPR); PAF receptor antagonist BN52021 could sustain the relative stability of Na+-K+-ATPase, Ca2+-Mg2+-ATPase activity and improve mitochondrial respiratory function. CONCLUSION：PAF and its receptor play an important role in the pathophysiology process of mitochondrial function damage after cervical cord injury. PAF antagonist can effectively protect mitochondrial function after trauma.
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MeSH Wound and injuries; Mitochondrial; Platelet activating factor; Receptor
如何改善颈髓损伤后颈髓神经功能损害、降低瘫痪及死亡率是临床迫切需要解决的课题。线粒体是细胞功能活跃的亚细胞器，细胞生命活动所需能量90%以上由线粒体氧化磷酸化提供，线粒体功能改变直接影响神经细胞的功能。近年来，血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)在脑中风、脑水肿中的作用倍受关注[1]，至于PAF及其受体对颈髓损伤后颈髓线粒体功能的作用研究甚少。本实验采用超速离心法分离颈髓细胞粒体，观察了PAF及其受体拮抗剂BN52021对颈髓损伤后线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性及线粒体呼吸功能的影响，从亚细胞水平探讨PAF及其受体对脊髓损伤后继发性损害的作用机制。
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材料与方法
(一)颈髓损伤模型复制及分组：健康成年雄性猫70只，体重2.5～3.5 kg,随机分成假手术组(对照组)、单纯脊髓损伤组(simply spinal cord injury, SSCI)、脊髓损伤(SCI)+人工脑脊液组(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)、SCI+PAF组、SCI+BN52021组。每组14只。各组动物均用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg ip)麻醉。咬除C6,7椎板，显露硬膜囊，用Allen打击法造成C6,7段脊髓挫伤，致伤力为350 g/cm。对照组仅咬除上述椎板。所有动物均行右股动、静脉插管。输液使血压维持在13 kPa以上。
(二)给药方式：SCI+PAF及其SCI+ACSF组于受伤前2 min在枕大池蛛网膜下腔向C6，7 相应部位插入1根PE10导管，分别经导管缓慢注入PAF 40 nmol/L(Sigma公司)，溶于ACSF 15 μL,SCI+ACSF组注射等量的ACSF(含131.8 mmol/L NaCl,24.6 mmol/L NaHCO3,2 mmol/L CaCl2, 3 mmol/L KCl, 0.65 mmol/L MgCl2, 6.7 mmol/L 尿素， 3.7 mmol/L glucose; pH 7.1，渗透压为302 nmol/L);SCI+BN52021组于受伤后2 h向右股静脉注射BN52021 10 mg/kg。
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(三)PAF含量测定：每组各取6只动物，伤后或术后6 h迅速切取C6,7段脊髓组织，称重后立即放入冷终止反应液(氯仿∶甲醇∶冰醋酸1∶2∶0.04 mL)3 mL中，采用改良的Bligh-Dyer方法和薄层分析分离技术[2]提取PAF。采用PAF定量生物分析技术[3]计算出样品中PAF含量。
(四)颈髓细胞线粒体提取方法：按改良的Koide法[4]，各组于术后或伤后相应时间切取C6，7颈髓组织，称重后迅速放入冷缓冲A液中(含0.32 mol/L蔗糖、10 mmol/L EGTA\, 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4),1 000 g离心10 min，取上清液17 000×g离心20 min，沉淀置于缓冲液B中(含0.32 mol/L 蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4)，在7.5%、12% Ficoll组成的不连续密度梯度上，以68 000×g离心1 h，其沉淀物即为线粒体，置于缓冲B液中低温保存待测。
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(五)线粒体ATP酶活性测定：按Faden法[5]测定Na+-K+-ATP酶活性，反应液成分(mmol/L):NaCl 68,KCl 28,MgCl2 4.5， ATP 30，L-组氨酸69，EGTA18，Tris-HCl 50,pH7.4，有或无oubain条件下释放磷之差值即为该酶之活性。根据改良的Chan法[6]测定Ca2++Mg2+-ATP酶活性，反应液成分(mmol/L):MgCl2 4.5，NaCl 68,KCl 28, Tris-HCl 50, pH 7.4, L-组氨酸69，ATP30，ouabain 1.0，有或无CaCl2 2.0。测定方法同上。在有或无CaCl2条件下释放磷之差值即为该酶活性。ATP酶单位表示：mol Pi/mg pro.h-1。
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(六)线粒体呼吸功能测定：用测氧仪连接台式自动平衡记录仪和恒温水，通过氧电极在30℃测定密闭连接搅拌的反应体系中的线粒体耗氧量，并根据线粒体耗氧量(nmo1O/min.mg-1pro)换算出线粒体体呼吸控制率、磷氧比值、氧化磷酸化效率nmol ATP/min.mg-1pro。
(七)统计学处理：所有数据以
±s表示，作双侧t检验。结 果
(一)颈髓组织PAF含量的变化：各损伤组伤后6 h颈髓组织PAF含量均不同程度高于对照组(P<0.01)。其中以SCI+PAF组最为显著；明显高于SSCI(P<0.05)，SCI+BN52021组颈髓PAF含量明显低于单纯颈髓损伤组(P<0.01，见表1)。
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表1 颈髓损伤后颈髓组织PAF含量变化
Tab 1 Alteration of PAF levels in cervical cord tissue
after cervical cord injury(pg/g,
±s,n=6)Group
PAF
Control
294.61±91.07
SSCI
, 百拇医药
2461.33±316.42**
SCI+ACSF
2495.28±362.04**
SCI+PAF
2986.47±379.72**△
SCI+BN52021
947.82±121.93**△△
**P<0.01, vs control; △P<0.01, △△P<0.01, vs SSCI
(二)颈髓线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性的变化：颈髓损伤各组伤后6 h颈髓线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性均有不同程度低于对照组，尤以SCI+PAF组为甚，与SCI比较有显著差异(P<0.05)。而SCI+BN52021组Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性高于SSCI组，与SSCI组也有显著差异(P<0.05)。SCI+ACSF组与SSCI之间无明显差异(P>0.05)。见表2。
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表2 颈髓损伤后颈髓线粒体ATP酶活性的变化
Tab 2 Alteration of cervical cord mitochondrial ATPase activity
after cervical cord injury (μmolPi.h-1/mg protein,
±s, n=8)Group
Na+-K+-ATPase
Ca2+-Mg2+-ATPase
, 百拇医药
Control
43.06±2.73
29.27±2.59
SSCI
24.32±2.95**
16.84±2.42**
SCI+ACSF
25.11±2.37**
17.02±2.31**
SCI+PAF
18.34±2.76**△
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10.29±2.28**△
SCI+BN52021
32.57±2.96**△
22.81±2.62**△
**P<0.01, vs control; △P<0.05,vs SSCI
(三)颈髓线粒体呼吸功能变化：颈髓损伤各组伤后6 h线粒体OUR、RCR、P/O值、OPR均不同程度低于对照组；其中以SCI+PAF组最为明显，与SSCI组比较有显著差异(P<0.05)。而SCI+BN52021组上述线粒体呼吸功能指标均显著高于SSCI组，与SSCI组比较也有显著差异(P>0.05)；其中，OUR、RCR接近对照组(P>0.05)。SCI+ACSF与SSCI之间无明显差异(P>0.05)。
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表3 颈髓损伤后颈髓线粒体功能的变化
Tab 3 Alteration of cervical cord mitochondral function after cervical cord injury(
±s, n=8)Group
OUR
RCR
P/O
OPR
Control
, 百拇医药
189.63±32.71
6.08±0.78
2.64±0.41
383.63±46.01
SSCI
143.02±19.21*
4.68±0.63*
1.43±0.21**
240.94±57.26**
SCI+ACSF
, 百拇医药
150.12±2109.86±
4.65±0.67*
1.46±0.27**
253.41±62.03**
SCI+PAF
18.54**△4.01*
3.71±0.59**△
0.94±0.18**△
173.52±41.34**△
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SCI+BN52021
165.17±24.06△
5.49±0.61△
1.95±0.27*△
313.36±50.12*△
*P<0.05,**P<0.01, vs control; △P<0.05, vs SSCI; OUR=oxygen uptake rate; RCR=respiratory control rate; P/O=phosphonium/oxgen; OPR=oxidative phosphorylation rate
讨 论
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颈髓损伤后颈髓组织继发性水肿、坏死是导致脊髓神经功能难以逆转及死亡的主要因素，其发生机制颇为复杂。本实验结果显示，颈髓损伤后颈髓组织PAF含量均明显增高，尤以SCI+PAF组为甚，而SCI+BN52021组颈髓组织PAF含量均较单纯颈髓损伤组明显降低。说明PAF对颈髓损伤后继发性损害的发生、发展具有重大影响。伤后脊髓组织PAF含量增高，可能系颈髓损伤后PAF合成的关键酶(PLA2和乙酰基转移酶)活性、浓度增高，刺激膜磷脂代谢，PLA2加速磷脂酰胆碱水解为溶血PAF，乙酰基转移酶促使溶血PAF乙酰化为PAF有关[1]。在创伤等应激条件下，血小板、血管内皮细胞、神经细胞均能产生大量PAF，PAF产生生物效应需要与靶细胞膜上的PAF特异性受体结合。作者在另一组实验中发现脊髓神经细胞膜存在PAF受体，PAF与其受体结合激活G蛋白、磷脂酶C，其信息转导机制是属于二酰甘油三磷酸肌醇和钙信使体系，分别引起细胞外Na+、 Ca2+内流、细胞内K+外流，造成细胞内Na+、 Ca2+浓度增加，K+浓度降低[7]。
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随着对脊髓损伤后继发性损害发生、发展机理认识的深入，线粒体等亚细胞器在继发性损伤中的作用受到重视。线粒体是氧自由基产生的场所，线粒体结构上特殊的脂质是氧自由基损伤的易感部位，而线粒体在细胞内环境稳定中起重要作用。本实验结果发现，颈髓损伤早期线粒体Na+-K+-ATP酶(钠泵)活性降低，PAF可明显抑制线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，Na+-K+-ATP酶活性对维持线粒体膜内外Na+、水平衡起重要作用，Na+-K+-ATP酶活性的明显降低，势必导致线粒体发生肿胀。同时，线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶活性亦明显降低，这样，线粒体内发生钙超载，触发一系列病理反应包括自由基反应，导致线粒体的呼吸功能障碍，从而加重颈髓组织缺氧、缺血，促进颈髓水肿的发生、发展和不可逆性的神经元损伤[8]。PAF受体拮抗剂BN52021能够调节Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，维持细胞内外Na+、K+、Ca2+、Mg2+浓度的相对平衡稳定。本实验结果还发现，颈髓线粒体在颈髓损伤后出现线粒体呼吸功能损害，PAF能加重线粒体呼吸功能损害，PAF受体拮抗剂BN52021能减轻线粒体呼吸功能损害。颈髓损伤后颈髓组织PAF、自由基的大量增加及PAF对自由基的介导作用，造成线粒体膜脂质的过氧化，损害线粒体的功能。颈髓损伤时，由于线粒体呼吸链电子传递发生障碍，还原型辅酶Ⅰ(NADH)得不到氧化而堆积，NADH是有效的电子供体，可使溶解在膜脂中的氧分子单价还原，即所谓线粒体单价泄漏，而导致的氧自由基不断生成。同时，PAF和自由基是一种活性很强的炎性介质，主要破坏膜脂质，使其上的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性下降，造成恶性循环。然而，PAF受体拮抗剂保护线粒体功能的机制可能与阻断PAF受体，抑制PAF的合成和生物效应，稳定线粒体系列酶的活性有关。
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* 国家自然科学基金资助(39870759)
参考文献
1 Lindsberg PG, Yue TL, Frerichs KU, et al. Evidence for platelet activating factor as a nervel mediator in experimental stroke in rabbit. Stroke, 1990, 21:1452.
2 Bligh EG, Dyer WJ. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol, 1959, 37:911.
3 Lalau KC, Coeffer E, Tence M, et al. Production and effect of PAF induced in vitro aggregation of rabbit and human platelet. Thromb Res, 1984, 34:346.
, 百拇医药
4 Koide T, Asano T, Matsuhita H, et al. Enhancement of ATPase activity by a lipid peroxide of AA in rat brain microvessels. J Neurochem, 1986, 46:235.
5 Faden AI, Chan Ph, Longar S. Alteration in lipid metabolism, Na+, K+ATPase activity, and tissue water content of spinal cord follwing experimental traumatic injury. J Neurochem, 1987, 48:1809.
6 Chan KM, Delfert D, Junger KD, et al. A direct colorimetric assay for Ca stimulated ATPase activity. Anal Biochem, 1986, 157:375.
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7 肖建如，赵定麟，贾连顺，等.血小板活化因子受体对脊髓损伤后继发性损害的影响.中华医学杂志，1996，76：120.
8 Anderson DK. Lipid hydrolysis and peroxidation in injuried spinal cord: Partial protection with methylprednisolone or vitamin E and selenium. Cent methylprednisolone or vitamin E and selenium. Cent Nerv Syst Trauma, 1985, 2:257.
(1997年3月12日收稿，1998年3月3日修回), 百拇医药