TNFα对血管内皮细胞的损伤作用及其分子机制
作者：金惠铭 刘清行 张国平 曹翔 孙建
单位：上海医科大学病理生理学教研室(上海200032)
关键词：
TNFα对血管内皮细胞的损伤作用及其分子机制 TNFα是一种重要的炎症介质。血管内皮细胞是TNFα作用的靶细胞之一。由TNFα引起的血管内皮细胞损伤在很多炎症性疾病的发病中具有重要意义。本工作主要研究不同浓度的rhTNFα(简称TNF)引起大血管内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)和微血管内皮细胞(大鼠肺微血管内皮细胞)形态、功能、代谢的损伤以及其与内皮细胞中原癌基因表达的关系，试图从中说明TNF引起血管内皮细胞早期损伤的部分分子机制。
1.细胞增殖动力学：在体外培养的大血管内皮细胞(HVEC，第3～4代)中发现，加入TNF(20～40 ng/mL)后，细胞形态从圆形、多角形变成梭形，细胞的纵轴拉长，横轴缩小，此种变化从培养6 h开始，72 h最显。光镜下未见明显细胞损伤表现，电镜下(透射电镜及扫描电镜)细胞器无明显改变，但见内皮细胞表面微绒毛减少。当TNF(浓度为40 ng/mL)与HVEC共同孵育培养72 h后，TNF组内皮细胞总数比对照组(PBS组)显著减少(5.23±0.50减到4.30±0.34，P<0.01)，用流式细胞仪分析细胞增殖周期发现，TNF组处于G1期的细胞明显增多，S期和M期的细胞明显减少(P<0.05)。结果提示，该浓度TNF能抑制内皮细胞增生，使细胞分裂延缓 。
, 百拇医药
2.PGI2和t-PA：前列腺素与纤溶酶原激活剂是内皮细胞合成、分泌的重要物质，也是反映内皮细胞代谢功能的重要指标。我们的实验发现，TNF浓度为20 ng/mL，培养72 h后内皮细胞培养上清液中6-酮-PGF1α(放免法)浓度明显低于对照组(P<0.01)，两者间比值达1∶3.7，但两组间的TXB2含量无显著差异，同时测定上清液中t-PA和PAI活性(发色底物法)，结果发现，在0～30 ng/mLTNF浓度下，培养48 h内t-PA浓度变化不显，但PAI活性逐渐下降，且呈时间-效应和剂量-效应依赖关系，差异显著(P<0.05)。结果说明较高浓度TNF有促凝作用，此作用与PGI2的减少、PAI活性抑制有关。大血管和微血管内皮细胞的结果一致。
3.粘附蛋白：细胞型纤维连接蛋白(Fn)是内皮细胞间、内皮细胞和基底膜间的一种粘连分子，它对保持微血管的完整性和正常通透性有重要作用。本工作用免疫荧光法观察发现TNF组(30 ng/mL)HVEC表面Fn免疫荧光较对照组弱，经流式细胞仪对荧光强度进行定量测定，结果表明TFN组(668.0±53.6)较对照组(820.8±27.9)明显减弱(P<0.05)。而培养液中Fn含量却明显升高(P<0.05)，但无剂量-效应依赖关系。用放免碘标法研究Fn合成率发现，TNF组Fn合成明显抑制。由此可见，经TNF作用后内皮细胞表面Fn减少，其原因与合成抑制及表面脱落有关，此种脱落究竟是因Fn经TNF作用后分子结构和功能异常，还是内皮细胞表面Fn受体结合活性抑制，目前尚不清楚，需进一步研究。
, 百拇医药
TNF对血管内皮细胞表面和中性白细胞表面的粘附蛋白也有明显的作用。体外实验发现，低浓度的TNF(<20 ng/mL)短时间培养对大血管、微血管内皮细胞与白细胞间粘附影响不显，但浓度达40 ng/mL以上时可使内皮细胞对中性白细胞的粘附率增加(人脐静脉内皮增加26.56%±6.70%，大鼠肺微血管内皮增加30.8%±4.5%)，如在培养液中先加ICAM-1或CD11单抗，然后再加白细胞，则可明显地部分抑制白细胞的粘附，抑制幅度在31.2%～63.4%之间。由此可见，一定浓度的TNF能激活白细胞与/或血管内皮细胞表面的粘附分子ICAM-1与/或CD11表达，从而促进内皮细胞与白细胞之间的粘附。
4.信息分子NO和NOS mRNA：以大鼠肺微血管内皮细胞为材料，测定细胞培养上清液中NO2水平，并用RT/PCR技术检测内皮细胞NOS mRNA表达水平，结果发现TNF(100 ng/mL)作用6 h后，培养上清液中NO2水平较对照组显著升高(P<0.05)，预先应用L-NMMA地塞米松、放线菌酮均可阻断TNF诱导的NO2升高，应用L-Arg可进一步升高NO2。定量RT-PCR发现，TNF(100 ng/mL)作用24 h后内皮细胞iNOS mRNA水平明显升高，而预先应用地塞米松或放线菌酮后，iNOS mRNA水平与对照组无明显差异(P>0.05)。同时eNOS mRNA较对照组显著降低，这种下降作用可被放线菌酮阻断，但不受地塞米松影响。由此可见，TNF可诱导肺微血管内皮细胞iNOS mRNA表达，但抑制eNOS mRNA表达，此过程有新合成的蛋白质因子参与，调节过程发生于转录或转录后水平。TNF时间依赖性地诱导内皮细胞NO的生成，说明较高剂量TNF(100 ng/mL)作用后内皮细胞中iNOS活性增高占主要地位。
, 百拇医药
5.原癌基因：为了在分子水平上进一步探讨引起上述变化的基因机制，我们应用免疫组化(ABC法)法和原位杂交法结合图象灰度定量处理观察了c-fos、c-jun等早期反应原癌基因表达的变化，结果发现(ABC法)TNF(20 ng/mL)作用12 h后c-jun和c-fos表达明显增强，24 h时达高峰，以后逐渐回落。用DIG标记的寡核苷酸c-fos探针(5’TTCTCGGGCTTCAACGCAACGCAGAC3’)对上述细胞做原位杂交，结果发现经TNF作用4 h开始c-fos表达已明显增强，12～24 h持续高表达，24 h后逐渐回落。c-fos的表达与细胞表面的Fn表达间呈显著的负相关(Y=-9.0127X+942.64，r=-0.748，P<0.05)。由此可见，此类基因在大剂量TNF引起体外培养的血管内皮细胞的早期损伤的发生上有重要意义，它可能对其它各种决定细胞损伤表现的特异性基因的调控起着一个“开关”的作用。
*国家自然科学基金及美国中华医学基金资助, 百拇医药
单位：上海医科大学病理生理学教研室(上海200032)
关键词：
TNFα对血管内皮细胞的损伤作用及其分子机制 TNFα是一种重要的炎症介质。血管内皮细胞是TNFα作用的靶细胞之一。由TNFα引起的血管内皮细胞损伤在很多炎症性疾病的发病中具有重要意义。本工作主要研究不同浓度的rhTNFα(简称TNF)引起大血管内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)和微血管内皮细胞(大鼠肺微血管内皮细胞)形态、功能、代谢的损伤以及其与内皮细胞中原癌基因表达的关系，试图从中说明TNF引起血管内皮细胞早期损伤的部分分子机制。
1.细胞增殖动力学：在体外培养的大血管内皮细胞(HVEC，第3～4代)中发现，加入TNF(20～40 ng/mL)后，细胞形态从圆形、多角形变成梭形，细胞的纵轴拉长，横轴缩小，此种变化从培养6 h开始，72 h最显。光镜下未见明显细胞损伤表现，电镜下(透射电镜及扫描电镜)细胞器无明显改变，但见内皮细胞表面微绒毛减少。当TNF(浓度为40 ng/mL)与HVEC共同孵育培养72 h后，TNF组内皮细胞总数比对照组(PBS组)显著减少(5.23±0.50减到4.30±0.34，P<0.01)，用流式细胞仪分析细胞增殖周期发现，TNF组处于G1期的细胞明显增多，S期和M期的细胞明显减少(P<0.05)。结果提示，该浓度TNF能抑制内皮细胞增生，使细胞分裂延缓 。
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2.PGI2和t-PA：前列腺素与纤溶酶原激活剂是内皮细胞合成、分泌的重要物质，也是反映内皮细胞代谢功能的重要指标。我们的实验发现，TNF浓度为20 ng/mL，培养72 h后内皮细胞培养上清液中6-酮-PGF1α(放免法)浓度明显低于对照组(P<0.01)，两者间比值达1∶3.7，但两组间的TXB2含量无显著差异，同时测定上清液中t-PA和PAI活性(发色底物法)，结果发现，在0～30 ng/mLTNF浓度下，培养48 h内t-PA浓度变化不显，但PAI活性逐渐下降，且呈时间-效应和剂量-效应依赖关系，差异显著(P<0.05)。结果说明较高浓度TNF有促凝作用，此作用与PGI2的减少、PAI活性抑制有关。大血管和微血管内皮细胞的结果一致。
3.粘附蛋白：细胞型纤维连接蛋白(Fn)是内皮细胞间、内皮细胞和基底膜间的一种粘连分子，它对保持微血管的完整性和正常通透性有重要作用。本工作用免疫荧光法观察发现TNF组(30 ng/mL)HVEC表面Fn免疫荧光较对照组弱，经流式细胞仪对荧光强度进行定量测定，结果表明TFN组(668.0±53.6)较对照组(820.8±27.9)明显减弱(P<0.05)。而培养液中Fn含量却明显升高(P<0.05)，但无剂量-效应依赖关系。用放免碘标法研究Fn合成率发现，TNF组Fn合成明显抑制。由此可见，经TNF作用后内皮细胞表面Fn减少，其原因与合成抑制及表面脱落有关，此种脱落究竟是因Fn经TNF作用后分子结构和功能异常，还是内皮细胞表面Fn受体结合活性抑制，目前尚不清楚，需进一步研究。
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TNF对血管内皮细胞表面和中性白细胞表面的粘附蛋白也有明显的作用。体外实验发现，低浓度的TNF(<20 ng/mL)短时间培养对大血管、微血管内皮细胞与白细胞间粘附影响不显，但浓度达40 ng/mL以上时可使内皮细胞对中性白细胞的粘附率增加(人脐静脉内皮增加26.56%±6.70%，大鼠肺微血管内皮增加30.8%±4.5%)，如在培养液中先加ICAM-1或CD11单抗，然后再加白细胞，则可明显地部分抑制白细胞的粘附，抑制幅度在31.2%～63.4%之间。由此可见，一定浓度的TNF能激活白细胞与/或血管内皮细胞表面的粘附分子ICAM-1与/或CD11表达，从而促进内皮细胞与白细胞之间的粘附。
4.信息分子NO和NOS mRNA：以大鼠肺微血管内皮细胞为材料，测定细胞培养上清液中NO2水平，并用RT/PCR技术检测内皮细胞NOS mRNA表达水平，结果发现TNF(100 ng/mL)作用6 h后，培养上清液中NO2水平较对照组显著升高(P<0.05)，预先应用L-NMMA地塞米松、放线菌酮均可阻断TNF诱导的NO2升高，应用L-Arg可进一步升高NO2。定量RT-PCR发现，TNF(100 ng/mL)作用24 h后内皮细胞iNOS mRNA水平明显升高，而预先应用地塞米松或放线菌酮后，iNOS mRNA水平与对照组无明显差异(P>0.05)。同时eNOS mRNA较对照组显著降低，这种下降作用可被放线菌酮阻断，但不受地塞米松影响。由此可见，TNF可诱导肺微血管内皮细胞iNOS mRNA表达，但抑制eNOS mRNA表达，此过程有新合成的蛋白质因子参与，调节过程发生于转录或转录后水平。TNF时间依赖性地诱导内皮细胞NO的生成，说明较高剂量TNF(100 ng/mL)作用后内皮细胞中iNOS活性增高占主要地位。
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5.原癌基因：为了在分子水平上进一步探讨引起上述变化的基因机制，我们应用免疫组化(ABC法)法和原位杂交法结合图象灰度定量处理观察了c-fos、c-jun等早期反应原癌基因表达的变化，结果发现(ABC法)TNF(20 ng/mL)作用12 h后c-jun和c-fos表达明显增强，24 h时达高峰，以后逐渐回落。用DIG标记的寡核苷酸c-fos探针(5’TTCTCGGGCTTCAACGCAACGCAGAC3’)对上述细胞做原位杂交，结果发现经TNF作用4 h开始c-fos表达已明显增强，12～24 h持续高表达，24 h后逐渐回落。c-fos的表达与细胞表面的Fn表达间呈显著的负相关(Y=-9.0127X+942.64，r=-0.748，P<0.05)。由此可见，此类基因在大剂量TNF引起体外培养的血管内皮细胞的早期损伤的发生上有重要意义，它可能对其它各种决定细胞损伤表现的特异性基因的调控起着一个“开关”的作用。
*国家自然科学基金及美国中华医学基金资助, 百拇医药