人防御素cDNA重组真核表达质粒的构建
作者：唐彬 黄宁 吴琦 王伯瑶
单位：华西医科大学感染免疫研究室 病理生理教研室(成都 610041)
关键词：
中国病理生理杂志990871 哺乳动物防御素(defensin)是分子量为3.5～4.5 kD的抗菌肽，具有广谱抗微生物活性，包括抗革兰氏阳性和阴性菌、霉菌、包膜病毒等。依据其分子结构，分为α-和β-防御素两个亚家族。在人类已发现6种α-防御素，即从中性粒细胞胞浆颗粒中发现的HNP-1到HNP-4，以及小肠Paneth细胞产生的HD5和HD6。β-防御素最早分别在牛白细胞和小牛气管、舌上皮细胞中发现，在人类发现有两种，即hBD-1和hBD-2。为了开展防御素基因转染上皮细胞以增强粘膜抗感染能力的实验研究，本文构建了HNP-1和hBD-1这两种人防御素cDNA的重组真核表达质粒pBK CMV-HNP-1及pBK CMV-hBD-1。根据人HNP-1和hBD-1的cDNA序列设计两对引物。为了使扩增的DNA片段能定向克隆，比较pBK CMV质粒及HNP-1和hBD-1 cDNA限制性酶谱(后二者无BamH I和Sal I酶切位点)，在引物序列的5′端插入BamH I和Sal I的内切酶位点，即构成HNP-1 5′端引物TAGAGTCGACGTGACCCCAG和3′端引物TTTGGATCCAAGCTCAGCAG，以及hBD-1 5′端引物TCAGCCGTCGACGG AGCCAGCCTC和3′端引物ACTTCGGATCCAATTTTCCTTTATT。上述引物由Gibco公司合成。采用常规PCR法分别从两种重组质粒pBabe-Neo-HNP-1和pCR-Script(SK)-hBD-1中扩增出两种人防御素hBD-1和HNP-1的cDNA全序列，通过双酶切，得到含有BamH I和Sal I两种限制酶粘性末端的全cDNA片段，然后定向克隆到真核表达质粒pBK CMV BamH I和Sal I两种限制酶间。经酶谱分析和核酸序列测定，证明成功地重组了真核表达质粒pBK CMV-HNP-1及pBK CMV-hBD-1。, http://www.100md.com
单位：华西医科大学感染免疫研究室 病理生理教研室(成都 610041)
关键词：
中国病理生理杂志990871 哺乳动物防御素(defensin)是分子量为3.5～4.5 kD的抗菌肽，具有广谱抗微生物活性，包括抗革兰氏阳性和阴性菌、霉菌、包膜病毒等。依据其分子结构，分为α-和β-防御素两个亚家族。在人类已发现6种α-防御素，即从中性粒细胞胞浆颗粒中发现的HNP-1到HNP-4，以及小肠Paneth细胞产生的HD5和HD6。β-防御素最早分别在牛白细胞和小牛气管、舌上皮细胞中发现，在人类发现有两种，即hBD-1和hBD-2。为了开展防御素基因转染上皮细胞以增强粘膜抗感染能力的实验研究，本文构建了HNP-1和hBD-1这两种人防御素cDNA的重组真核表达质粒pBK CMV-HNP-1及pBK CMV-hBD-1。根据人HNP-1和hBD-1的cDNA序列设计两对引物。为了使扩增的DNA片段能定向克隆，比较pBK CMV质粒及HNP-1和hBD-1 cDNA限制性酶谱(后二者无BamH I和Sal I酶切位点)，在引物序列的5′端插入BamH I和Sal I的内切酶位点，即构成HNP-1 5′端引物TAGAGTCGACGTGACCCCAG和3′端引物TTTGGATCCAAGCTCAGCAG，以及hBD-1 5′端引物TCAGCCGTCGACGG AGCCAGCCTC和3′端引物ACTTCGGATCCAATTTTCCTTTATT。上述引物由Gibco公司合成。采用常规PCR法分别从两种重组质粒pBabe-Neo-HNP-1和pCR-Script(SK)-hBD-1中扩增出两种人防御素hBD-1和HNP-1的cDNA全序列，通过双酶切，得到含有BamH I和Sal I两种限制酶粘性末端的全cDNA片段，然后定向克隆到真核表达质粒pBK CMV BamH I和Sal I两种限制酶间。经酶谱分析和核酸序列测定，证明成功地重组了真核表达质粒pBK CMV-HNP-1及pBK CMV-hBD-1。, http://www.100md.com