衰老分子机制研究的某些进展
作者：谭敦勇 李楚杰
单位：(暨南大学医学院病理生理教研室，广东 广州 510632)
关键词：衰老 ；基因；端粒
中国病理生理杂志000123 [中图分类号] Q342+.3 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0079-05
Some recent advances in the molecular mechanisms underlying senescence
TAN Dun-yong, LI Chu-jie
(Department of Pathophysiology, Jinan University Medical College, Guangzhou 510632， China)
, http://www.100md.com
【A Review】 Aging or senescence is a process in which individuals undergo an exponential decline in vitality, leading to death. Recent years,much progress on the molecular mechanisms underlying senescence have been made. (1) Some senescence-related gene such as SEN6A,hic-5,din1 and MORF 4 have been clarified; (2) In 1997, through a set of experiments sponsered by scientists of Department of Biology Massachusetts Institute of Technology, it was found that the accommulation of extrachromosomal rDNA circles (ERC) in budding yeasts nucleolus is responsible for cell-senescence and the researchers propose that when enough of these circles accumulate, they clog the nucleus and prevent the cell from reading or replicating its genome, causing it to stop dividing and ultimately to die; (3) In another work finished by National Institute on Aging and the Geron biotech company of Melo, it was proved that a cells biological clock,which tells the cell how and how many times to divide, lies in its telomeres, little bits of DNA that coat the tips of the chromosome and it was clarified that a powerful enzyme,telomerase, with the potential to rejuvenate the human bodys aging tissues could effectively extend the shortened telomere . Although there is a long way to go, scientists still believe that it will be made reality in the future to greatly extend the life-span of human.
, 百拇医药
[MeSH] Aging; Genes; Telomere
有关衰老机制的研究，最近已取得了一些令人鼓舞的进展，本文拟对这些最新成果作一简要综述。
一、衰老基因的研究：
有关衰老机制的学说越来越多，但综合起来看，大体分为两类：1.差误说；2.程序说(包括细胞衰老程序说及机体整体衰老程序说)。程序说认为生物的寿命已由DNA编码，如认为在生物的基因组中存在着导致细胞或机体整体衰老的衰老基因。衰老基因在细胞或机体整体生活的一定阶段被激活并表达促进衰老的因子。体内是否存在主动导致细胞衰老的基因？
1972年Kerr发现多细胞生物体内存在一种不同于坏死的主动的细胞死亡，即程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),或称细胞凋亡(apoptosis)[1]。其后发现细胞凋亡的发生与一些特殊的基因有关，如max、 bcl-2、 p53、c-myc等。其中尤以max及bcl-2的研究引人注目，研究表明，max是一个典型的凋亡基因，max的表达增加导致细胞凋亡，而bcl-2则为凋亡抑制基因，bcl-2的表达有利于细胞的生存。有人将bcl-2基因置入表达载体，转入细胞株中过量表达bcl-2蛋白，结果发现bcl-2转基因细胞株在各种逆境下的生存时间明显延长[2]。OReilly等[3]用前B细胞及多种造血细胞均表明，bcl-2的过量表达能使这些细胞在除去生长因子后寿命延长。
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bcl-2转基因动物实验表明[4]，带bcl-2转基因而导致bcl-2产物在免疫系统中大量表达的小鼠，其B细胞及T细胞在体外的存活能力大大增强。Vaux等将带有人的bcl-2基因表达载体注入线虫(C.elegans)的生殖腺中，发现由此产生的转基因线虫细胞凋亡大大减少。由于bcl-2具有抑制细胞凋亡、延长细胞生存期的作用，因而被称之为长寿基因。细胞的存亡决定于凋亡基因及凋亡抑制基因的表达的孰多孰少。
细胞凋亡的研究虽然为探明衰老的细胞分子机制奠定了基础，有力地证明了某些基因参与了细胞的主动死亡。但严格地说，细胞凋亡与细胞衰老及因衰老而致的死亡又有很大的不同，表现在细胞凋亡是因调节细胞数量的平衡而出现的细胞主动死亡的过程，凋亡的发生与细胞的年龄关系不大，而衰老则与细胞的年龄或分裂次数密切相关。况目前尚没有凋亡相关基因与衰老联系的直接证据。因而自凋亡基因发现之后，多数从事衰老研究的研究人员越来越多地致力于与细胞衰老联系更密切的所谓衰老相关基因(senescence related gene, senescence associated gene)的研究。
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由于细胞衰老与细胞永生化(immortality)是细胞生命历程中既相互对立又相互联系的两个方面，因而研究人员常将永生化细胞(immortal cell)作为工具细胞来筛选、鉴别衰老相关基因。80年代初，Bunn、Goldstein等人开始尝试将永生化细胞与正常细胞融合(cell fusion)后，观察对永生化细胞的影响，结果表明，融合细胞(hybrids)丢失永生化特性而象正常细胞一样,在分裂一定次数后出现衰老死亡。这一结果说明控制衰老的基因属显性基因。其后，Pereira-Smith(1988)等用显微细胞融合技术(microcell fusion)进一步将单个染色体导入永生化细胞，证明在人的第4号染色体存在一个或数个衰老相关基因。
1997年12月，在全美细胞生物学学会的年会上，Michael Bertram[5]报道他的研究小组于人的第4号染色体克隆到一种基因，该基因若突变能导致某些类型的细胞永生化。虽然此前研究人员已发现了不少类似的基因突变后均能导致细胞生长的失控，但能直接与永生相联系的报道，此属首次。
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该基因能表达一种与细胞衰老死亡有关的转录因子，被称为“源于4号染色体的死亡因子”(mortality factor from chromosome 4，MORF4)。研究表明MORF4基因发生突变可导致细胞永生化。他们将各种由于MORF4基因缺失而导致永生化的细胞与正常的衰老细胞或它们之间进行融合后发现，该基因缺失所致的永生化能被导入正常基因所纠正，与衰老细胞融合后的所谓永生化细胞一样表现出细胞衰老的特征。此外，Pereia-Smith等将MORF4基因片断导入到上述缺失MORF4基因的永生化细胞后，可使永生化细胞发生衰老。这是MORF4基因作为衰老相关基因的最直接的证据。MORF4基因的表达在老化的及处于静止期的细胞中发生上调，而在分裂活泼的细胞中却下调。
随着研究的深入，有关衰老相关基因的报道也越来越多。如SEN6A、 Hic-5、 22 new ESTs、 SM22、 SGPO-2/APO J等。
二、细胞衰老与细胞分裂周期的分子记忆装置：
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生物为什么衰老？已知在多细胞生物体内，细胞进行活跃的新陈代谢，老的细胞在经过特定的生命历程后，会被新的从母细胞经有丝分裂而来的新细胞取代，因而，从细胞学水平上看似乎这一过程是无限的，多细胞生物作为整体不该出现死亡。然而事实是，古今中外尚未发现寿命无限的多细胞生物。问题的关键究竟在哪里？Hayflick[6]的工作为解开这一迷底奠定了一定的基础。他证明多细胞生物体细胞的分裂不是无限的，而是在分裂一定次数后便停止分裂。为什么体细胞在分裂一定次数后会自动停止分裂？而且同种属的多细胞生物具有基本相同的寿命？体细胞内是否存在某种记录细胞分裂周期的分子记忆装置？近几年来已有不少学者正致力于这方面的探讨并取得了一些可喜的重大发现。
(一)特异DNA的累积与细胞衰老：
人类遗传性早老症或称华纳氏综合症(Warners symdrome)患者，较正常人提前数十年出现衰老症状，十余岁时即会出现老态，一般死于50岁之前。 是研究衰老机制的重要模型。1996年有人自华纳氏患者基因组中发现WRN基因[7]，进一步发现在酵母基因组中亦存在与WRN基本相同的SGS1(slow growth suppressor)基因。酵母是目前研究衰老的一个极好的工具细胞，因而SGS1的发现为研究该病的分子机制开辟了新的途径。
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酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)除了可以以配对的方式进行有性生殖外，大多数情况下它会以出芽(budding)的方式生成所谓的女儿细胞(daughter cell)进行无性繁殖。正常酵母细胞一般能重复这一过程约25次，而后便慢慢肿胀，停止出芽、暴露老化征兆。Guarente等[8]发现，SGS1若突变后可以导致酵母细胞提前出现衰老。突变的酵母细胞在大约出芽9次后便停止出芽而成为不能生殖的细胞。在对相对年轻及衰老的酵母细胞的结构进行比较后，Guarente等发现酵母细胞核内核小体结构上的变化，核小体是RNAs帮助装配细胞蛋白的工厂。年轻的酵母或正常情况下核小体呈紧缩的新月形，而突变及衰老的细胞，其核小体明显变大。进一步研究证实，这种变大的核小体主要由一种环状DNA(extrachromosome rDNA circles, ERC)组成。当母细胞在出芽前对其DNA进行复制时，同时也对ERC进行复制。当此种周期达到一定数目后，它们会阻塞细胞核，妨碍细胞对其基因组的阅读和复制，致使细胞停止分裂并最终死亡。Guarente认为这是一种非常精细的时间机制，其对细胞的作用是非常缓慢的。在ERC DNA的累积过程中，第一个环也许是由于核糖体DNA的高度可复制性而偶然产生。这种DNA很象是细胞的DNA加工系统加工错了的产物。阻止这种环的形成很不容易，但若一旦形成，这些环便可用酵母细胞的其余的DNA进行复制。当给DNA合成的原料脱氧核苷酸加上标记后发现，随着出芽次数的增加，ERC的量会越来越多乃至最终其DNA几乎与整个酵母基因组相等。正是ERC的大量积累导致了核形态的改变。
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这种环状物在正常细胞及SGS1突变的细胞均存在，但在正常细胞其DNA的积累要较之突变细胞慢得多，这表明它很可能与老化的速度有关。另外，将衰老的酵母细胞的一部分ERC的DNA加入到其它酵母细胞株时，结果发现其寿命减少40%。而在其它一些酵母细胞株，以某种方法阻碍核糖体DNA环状物的形成后，其寿命延长25%。
Guarente等认为正常情况下某种蛋白质能控制环状物的形成并因此延缓老化。其中之一便是SGS1蛋白本身，而恰在核小体富含该蛋白。另一种则是一组称作SIR的蛋白分子，该蛋白无论何时与染色体结合均可使基因的所有区域失活或静止。Guarente研究组早期的工作表明，SIR蛋白随着酵母细胞的增龄而逐渐向核小体移动。此外还发现在一种SIR突变的细胞，这种移动速度较通常要快，提示该蛋白的提早移动延缓了老化的进程。但有关该类蛋白是如何控制环状物的形成的，尚不清楚。
此外有关这种环状物导致细胞老化及干扰正常的复制及转录的机理等，有待于进一步研究。虽然目前尚没有人在哺乳动物细胞中发现这种ERC DNA，但部分学者认为哺乳动物包括人的细胞可能存在着与此类似的过程，“所有细胞均会经历此种周期事件，有足够的理由认为这一机制与其它生物的老化也有关”。
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(二)特异DNA顺序-端粒的缩短与衰老：
1.端粒(telomere)的位置、结构、合成及作用：端粒是位于染色体末端的一种小的DNA片断，它象帽子一样罩在染色体的长臂上，包裹着染色体的头部，起着固定DNA双螺旋、防止DNA链被解开的作用。人的端粒由位于染色体末端的重复的TTAGGG/CCCTAA组成[9]；1986年，Howard Cooke[10]首次观察到体细胞性染色体上的端粒较生殖细胞性染色体上的端粒短并观察到端粒在每次细胞分裂后都会丢失。Cooke推测端粒可能正是控制细胞的有丝分裂钟(mitotic clock)。每次细胞分裂成两个时，其端粒就缩短一点，直至最后(大约分裂40～90次之后)其减少到数十个bp。此时若细胞进一步地分裂会导致染色体的磨损，因而细胞进入黄昏时期直到最终死亡。只有一种称作端粒酶(telomerase)的核蛋白酶(该酶于1984年首次被发现)能够合成端粒DNA(telomeric DNA)、修复被损伤了的端粒并使其延长。然而，除了生殖细胞外大多数人的细胞在胚胎发育期间均不再产生这种酶。在正常人的体细胞中，由于没有端粒酶活性，端粒随着细胞分裂进行性地缩短导致了细胞的衰老[11]。
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人端粒酶的催化亚基(hTRT)已被克隆[12]。最近，发现在正常人的二倍体细胞端粒酶酶的活性可被hTRT的短暂表达所重建。
此外1997年夏天，3个不同的研究小组几乎同时克隆到一种基因，该基因的表达产物能使人组织中的端粒酶得以重新激活。Geron及Texas 大学Dallas西南医学中心的研究人员用病毒载体(带有端粒酶)转染正常细胞，发现任何情况下，细胞的端粒均得以延长，而且细胞处于健康状态并持续保持分裂。该中心的科学家Jeery Shay指出，转染后，细胞的分裂次数至少比通常的分裂次数超过20次，有的超过40次，最终有望达到无限次分裂[13]。
2.Telomere作为细胞分裂的分子钟的实验证据：如上所述，端粒DNA缩短后可在端粒酶的作用下得以合成而使端粒延长，但正常体细胞并无端粒酶活性。给正常人体细胞导入端粒酶后是否能延长细胞寿命？Bordner等[14]利用端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)，构建出两种hTRT cDNA的表达载体，并将其转染给正常的hTRT阴性(hTRT-)细胞以观察其对端粒长度、细胞核型及寿命的影响。hTRT表达载体中一个由于将hTRT去除了5及3端的非翻译区,因而得以增加其翻译的效率，并将其组建到骨髓瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV)促进子的下游。另一个则组建到病毒载体pZeoSV促进子下游。结果表明，将具有端粒酶活性的MPSV-hTRT表达载体分别转染正常hTRT-视网膜色素上皮细胞(RPE340)及成纤维细胞BJ克隆后，RPE克隆中，端粒酶活性明显上升，在65%～360%之间(以自人肺癌分离出的细胞株H1299中的端粒酶活性为100%),而在BJ克隆中，其活性在86%～95%。此种端粒酶活性范围与在肿瘤细胞中观察到的相似。同时hTRT+细胞其端粒得到延长。他们检测了端粒长度以确定hTRT-重构的端粒酶是否对正常的染色体有作用。在hTRT-细胞，端粒的长度减少0.4到1.3 kb, 与在大量培养时在相应的PD(population doubling)上所见到的端粒缩短现象相比较，转染了MPSV-hTRT载体的hTRT+PRE及BJ克隆，端粒分别增加了(7.1±1.4)kb (n=26) 及(7.1±0.3)kb (n=3)。在转染pZeoSV-hTRT载体的6个hTRT+克隆，端粒增加了(0.4±0.3)kb (n=6)。此结果提示，在正常细胞，hTRT-细胞一旦转染端粒酶后，其内源性的端粒会得以延长。
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为探讨端粒酶表达对正常细胞寿命的影响，Cooke等对hTRT+及hTRT-克隆的生长情况进行了比较。hTRT- RPE克隆表现出预想的生长缓慢并伴有离体情况下的衰老现象，在33个衰老的克隆中有30个表现有大量RPE培养时的老化特征。与此相反，转染了MPSV-hTRT的hTRT+RPE克隆超过hTRT-平均寿命的约20倍。这些克隆已经超过了RPE最高寿命，而且能以年轻RPE的相同的速率进行分裂。类似的，大多数hTRT- BJ成纤维细胞克隆老化或接近老化，而转染了pZeoSV-hTRT载体的克隆，所有6个的寿命均超过BJ的最大寿命。6个快速分裂的hTRT+克隆的平均PD已经超出70个 hTRT-克隆平均寿命的36倍。在人的血管内皮细胞上，得到了类似的结果。因而可以肯定，正常细胞中hTRT的功能性表达确能延长其寿命。
衰老相关的β-galactosidase(SA-β-Gal)是公认的细胞老化的生物标志。用此对已经老化或接近老化的hTRT-RPE克隆进行染色并将其染色情况与hTRT+克隆(基本经历相同乃至更多次数的细胞分裂)的染色情况进行比较后发现，hTRT-克隆中的大部分细胞表现为强染色，而在hTRT+克隆(相当的或更多的PD)中，却很少有细胞被染色。停止分裂的hTRT-克隆的细胞其SA-β-Ga染色水平与在衰老大量培养物中观察到的差不多。其细胞体积的增大以及细胞浆/细胞核的比例增加提示细胞确已衰老。hTRT-克隆中其余的一些分裂速度很慢的克隆的SA-β-Gal染色表现为典型的接近衰老的细胞的特征。在培养的纤维母细胞中亦得到基本相同的结果：所有的6个hTRT+克隆都表现为年轻的纤维母细胞在培养时所表现的低水平染色。而所有的hTRT- 克隆则都呈现SA-β-Ga染色水平的提高。两个hTRT+RPE克隆及两个hTRT+ BJ克隆的详细的G-结合的情况表明，其所有的46条染色体均正常，未发现不正常的染色体。寿命得到延长的hTRT+细胞因而也呈现出与年轻的细胞相似的正常的表型及基因型[14]。
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3.端粒、端粒酶与癌症：由于端粒充当了细胞分裂的分子钟作用，因而在干细胞、生殖细胞及肿瘤细胞往往表现出很强的端粒酶活性。目前多数学者认为体细胞端粒酶活性的大幅度上升是正常细胞转化为癌细胞的关键环节。它对肿瘤的研究具有潜在的理论及实践意义。有资料表明，端粒酶的激活在使细胞避免老化的同时，又恰好满足了肿瘤生长的条件。因而探讨肿瘤细胞中端粒酶失调的分子基础对研究肿瘤的分子机制具有非常主要的理论及实践意义。在正常的人的细胞内可能存在一种或数种肿瘤抑制基因起着防止端粒酶激活的作用[10,15]。
三、困难与展望：
尽管上述某些发现令人鼓舞，如通过人为转入端粒酶可使培养的哺乳动物体细胞寿命大大延长以致于有望无限延长即达到所谓的永生化，但使单个细胞寿命延长，并不意味着多细胞生物作为整体的返老还童。众所周知，多细胞生物如人体由数万亿个细胞组成，要使如此众多细胞的基因组得以改善从而使其年轻化，看来并非易事。另外，如何把握细胞的永生化与癌化之间的界限，可能成为制约衰老及抗衰老研究的瓶颈。如上所述，已有证据表明，癌细胞中端粒酶活性明显升高，甚至高于分裂旺盛的干细胞以及生殖细胞。因而除非科学家能有效地控制细胞的分裂，否则，激活端粒酶非但不能使人长寿，反而会导致癌症的发生。有人认为多细胞生物中每一个细胞都有自己的生物钟，正是这一生物钟告知细胞何时停止生长及开始死亡。从而使得多细胞整体得以协调地生长。人为干预细胞内的生物钟可以拯救单个细胞，但却有可能妨碍整体的生存。
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端粒作为细胞分裂的计数器在生物界是否具有普遍性，也尚待进一步探讨。如Mus musculus小鼠，其端粒的长度是人类的3倍，但其寿命并非人类的3倍。此外，衰老的人的细胞并没有丢失所有端粒DNA而是仍留有残存的部分DNA，而此种残存的DNA实际上与许多其它真核细胞的端粒DNA的长度相当。为何仅仅是端粒 DNA的部分丢失却导致了细胞寿命之间的如此大的差异？
在衰老基因的研究中，我们还需要找到衰老基因表达产物导致细胞停止分裂的更直接的证据及其作用的分子机制。此外，衰老这一过程究竟牵涉到多少基因？是多个基因共同作用的结果还单个基因的作用？因而对衰老基因需要进行严格的理论及实践上的界定。
当然，上述这些发现可以说在人类最终认识衰老的机制方面前进了一大步。尽管尚无法控制多细胞生物的所有细胞，但我们认为利用这些成果去改善某些关键的细胞从而延缓人类的衰老似乎具有一定的实践意义。如某些终末分化细胞包括脑神经细胞及心肌细胞等。笔者相信，衰老作为一个过程，终究是可以认识的，因而也一定能按照人类的意愿进行控制。返老还童也未必就是天方夜谭。
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[参 考 文 献]
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[15] Sarkar G, Bolander ME. Telomeres, telomerase, and cancer [letter; comment] [J]. Science, 1995,268 (5214): 1115.
[收稿日期] 1998-12-29 [修回日期] 1999-06-02, 百拇医药
单位：(暨南大学医学院病理生理教研室，广东 广州 510632)
关键词：衰老 ；基因；端粒
中国病理生理杂志000123 [中图分类号] Q342+.3 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0079-05
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TAN Dun-yong, LI Chu-jie
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有关衰老机制的研究，最近已取得了一些令人鼓舞的进展，本文拟对这些最新成果作一简要综述。
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1972年Kerr发现多细胞生物体内存在一种不同于坏死的主动的细胞死亡，即程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),或称细胞凋亡(apoptosis)[1]。其后发现细胞凋亡的发生与一些特殊的基因有关，如max、 bcl-2、 p53、c-myc等。其中尤以max及bcl-2的研究引人注目，研究表明，max是一个典型的凋亡基因，max的表达增加导致细胞凋亡，而bcl-2则为凋亡抑制基因，bcl-2的表达有利于细胞的生存。有人将bcl-2基因置入表达载体，转入细胞株中过量表达bcl-2蛋白，结果发现bcl-2转基因细胞株在各种逆境下的生存时间明显延长[2]。OReilly等[3]用前B细胞及多种造血细胞均表明，bcl-2的过量表达能使这些细胞在除去生长因子后寿命延长。
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bcl-2转基因动物实验表明[4]，带bcl-2转基因而导致bcl-2产物在免疫系统中大量表达的小鼠，其B细胞及T细胞在体外的存活能力大大增强。Vaux等将带有人的bcl-2基因表达载体注入线虫(C.elegans)的生殖腺中，发现由此产生的转基因线虫细胞凋亡大大减少。由于bcl-2具有抑制细胞凋亡、延长细胞生存期的作用，因而被称之为长寿基因。细胞的存亡决定于凋亡基因及凋亡抑制基因的表达的孰多孰少。
细胞凋亡的研究虽然为探明衰老的细胞分子机制奠定了基础，有力地证明了某些基因参与了细胞的主动死亡。但严格地说，细胞凋亡与细胞衰老及因衰老而致的死亡又有很大的不同，表现在细胞凋亡是因调节细胞数量的平衡而出现的细胞主动死亡的过程，凋亡的发生与细胞的年龄关系不大，而衰老则与细胞的年龄或分裂次数密切相关。况目前尚没有凋亡相关基因与衰老联系的直接证据。因而自凋亡基因发现之后，多数从事衰老研究的研究人员越来越多地致力于与细胞衰老联系更密切的所谓衰老相关基因(senescence related gene, senescence associated gene)的研究。
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由于细胞衰老与细胞永生化(immortality)是细胞生命历程中既相互对立又相互联系的两个方面，因而研究人员常将永生化细胞(immortal cell)作为工具细胞来筛选、鉴别衰老相关基因。80年代初，Bunn、Goldstein等人开始尝试将永生化细胞与正常细胞融合(cell fusion)后，观察对永生化细胞的影响，结果表明，融合细胞(hybrids)丢失永生化特性而象正常细胞一样,在分裂一定次数后出现衰老死亡。这一结果说明控制衰老的基因属显性基因。其后，Pereira-Smith(1988)等用显微细胞融合技术(microcell fusion)进一步将单个染色体导入永生化细胞，证明在人的第4号染色体存在一个或数个衰老相关基因。
1997年12月，在全美细胞生物学学会的年会上，Michael Bertram[5]报道他的研究小组于人的第4号染色体克隆到一种基因，该基因若突变能导致某些类型的细胞永生化。虽然此前研究人员已发现了不少类似的基因突变后均能导致细胞生长的失控，但能直接与永生相联系的报道，此属首次。
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该基因能表达一种与细胞衰老死亡有关的转录因子，被称为“源于4号染色体的死亡因子”(mortality factor from chromosome 4，MORF4)。研究表明MORF4基因发生突变可导致细胞永生化。他们将各种由于MORF4基因缺失而导致永生化的细胞与正常的衰老细胞或它们之间进行融合后发现，该基因缺失所致的永生化能被导入正常基因所纠正，与衰老细胞融合后的所谓永生化细胞一样表现出细胞衰老的特征。此外，Pereia-Smith等将MORF4基因片断导入到上述缺失MORF4基因的永生化细胞后，可使永生化细胞发生衰老。这是MORF4基因作为衰老相关基因的最直接的证据。MORF4基因的表达在老化的及处于静止期的细胞中发生上调，而在分裂活泼的细胞中却下调。
随着研究的深入，有关衰老相关基因的报道也越来越多。如SEN6A、 Hic-5、 22 new ESTs、 SM22、 SGPO-2/APO J等。
二、细胞衰老与细胞分裂周期的分子记忆装置：
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生物为什么衰老？已知在多细胞生物体内，细胞进行活跃的新陈代谢，老的细胞在经过特定的生命历程后，会被新的从母细胞经有丝分裂而来的新细胞取代，因而，从细胞学水平上看似乎这一过程是无限的，多细胞生物作为整体不该出现死亡。然而事实是，古今中外尚未发现寿命无限的多细胞生物。问题的关键究竟在哪里？Hayflick[6]的工作为解开这一迷底奠定了一定的基础。他证明多细胞生物体细胞的分裂不是无限的，而是在分裂一定次数后便停止分裂。为什么体细胞在分裂一定次数后会自动停止分裂？而且同种属的多细胞生物具有基本相同的寿命？体细胞内是否存在某种记录细胞分裂周期的分子记忆装置？近几年来已有不少学者正致力于这方面的探讨并取得了一些可喜的重大发现。
(一)特异DNA的累积与细胞衰老：
人类遗传性早老症或称华纳氏综合症(Warners symdrome)患者，较正常人提前数十年出现衰老症状，十余岁时即会出现老态，一般死于50岁之前。 是研究衰老机制的重要模型。1996年有人自华纳氏患者基因组中发现WRN基因[7]，进一步发现在酵母基因组中亦存在与WRN基本相同的SGS1(slow growth suppressor)基因。酵母是目前研究衰老的一个极好的工具细胞，因而SGS1的发现为研究该病的分子机制开辟了新的途径。
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酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)除了可以以配对的方式进行有性生殖外，大多数情况下它会以出芽(budding)的方式生成所谓的女儿细胞(daughter cell)进行无性繁殖。正常酵母细胞一般能重复这一过程约25次，而后便慢慢肿胀，停止出芽、暴露老化征兆。Guarente等[8]发现，SGS1若突变后可以导致酵母细胞提前出现衰老。突变的酵母细胞在大约出芽9次后便停止出芽而成为不能生殖的细胞。在对相对年轻及衰老的酵母细胞的结构进行比较后，Guarente等发现酵母细胞核内核小体结构上的变化，核小体是RNAs帮助装配细胞蛋白的工厂。年轻的酵母或正常情况下核小体呈紧缩的新月形，而突变及衰老的细胞，其核小体明显变大。进一步研究证实，这种变大的核小体主要由一种环状DNA(extrachromosome rDNA circles, ERC)组成。当母细胞在出芽前对其DNA进行复制时，同时也对ERC进行复制。当此种周期达到一定数目后，它们会阻塞细胞核，妨碍细胞对其基因组的阅读和复制，致使细胞停止分裂并最终死亡。Guarente认为这是一种非常精细的时间机制，其对细胞的作用是非常缓慢的。在ERC DNA的累积过程中，第一个环也许是由于核糖体DNA的高度可复制性而偶然产生。这种DNA很象是细胞的DNA加工系统加工错了的产物。阻止这种环的形成很不容易，但若一旦形成，这些环便可用酵母细胞的其余的DNA进行复制。当给DNA合成的原料脱氧核苷酸加上标记后发现，随着出芽次数的增加，ERC的量会越来越多乃至最终其DNA几乎与整个酵母基因组相等。正是ERC的大量积累导致了核形态的改变。
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这种环状物在正常细胞及SGS1突变的细胞均存在，但在正常细胞其DNA的积累要较之突变细胞慢得多，这表明它很可能与老化的速度有关。另外，将衰老的酵母细胞的一部分ERC的DNA加入到其它酵母细胞株时，结果发现其寿命减少40%。而在其它一些酵母细胞株，以某种方法阻碍核糖体DNA环状物的形成后，其寿命延长25%。
Guarente等认为正常情况下某种蛋白质能控制环状物的形成并因此延缓老化。其中之一便是SGS1蛋白本身，而恰在核小体富含该蛋白。另一种则是一组称作SIR的蛋白分子，该蛋白无论何时与染色体结合均可使基因的所有区域失活或静止。Guarente研究组早期的工作表明，SIR蛋白随着酵母细胞的增龄而逐渐向核小体移动。此外还发现在一种SIR突变的细胞，这种移动速度较通常要快，提示该蛋白的提早移动延缓了老化的进程。但有关该类蛋白是如何控制环状物的形成的，尚不清楚。
此外有关这种环状物导致细胞老化及干扰正常的复制及转录的机理等，有待于进一步研究。虽然目前尚没有人在哺乳动物细胞中发现这种ERC DNA，但部分学者认为哺乳动物包括人的细胞可能存在着与此类似的过程，“所有细胞均会经历此种周期事件，有足够的理由认为这一机制与其它生物的老化也有关”。
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(二)特异DNA顺序-端粒的缩短与衰老：
1.端粒(telomere)的位置、结构、合成及作用：端粒是位于染色体末端的一种小的DNA片断，它象帽子一样罩在染色体的长臂上，包裹着染色体的头部，起着固定DNA双螺旋、防止DNA链被解开的作用。人的端粒由位于染色体末端的重复的TTAGGG/CCCTAA组成[9]；1986年，Howard Cooke[10]首次观察到体细胞性染色体上的端粒较生殖细胞性染色体上的端粒短并观察到端粒在每次细胞分裂后都会丢失。Cooke推测端粒可能正是控制细胞的有丝分裂钟(mitotic clock)。每次细胞分裂成两个时，其端粒就缩短一点，直至最后(大约分裂40～90次之后)其减少到数十个bp。此时若细胞进一步地分裂会导致染色体的磨损，因而细胞进入黄昏时期直到最终死亡。只有一种称作端粒酶(telomerase)的核蛋白酶(该酶于1984年首次被发现)能够合成端粒DNA(telomeric DNA)、修复被损伤了的端粒并使其延长。然而，除了生殖细胞外大多数人的细胞在胚胎发育期间均不再产生这种酶。在正常人的体细胞中，由于没有端粒酶活性，端粒随着细胞分裂进行性地缩短导致了细胞的衰老[11]。
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人端粒酶的催化亚基(hTRT)已被克隆[12]。最近，发现在正常人的二倍体细胞端粒酶酶的活性可被hTRT的短暂表达所重建。
此外1997年夏天，3个不同的研究小组几乎同时克隆到一种基因，该基因的表达产物能使人组织中的端粒酶得以重新激活。Geron及Texas 大学Dallas西南医学中心的研究人员用病毒载体(带有端粒酶)转染正常细胞，发现任何情况下，细胞的端粒均得以延长，而且细胞处于健康状态并持续保持分裂。该中心的科学家Jeery Shay指出，转染后，细胞的分裂次数至少比通常的分裂次数超过20次，有的超过40次，最终有望达到无限次分裂[13]。
2.Telomere作为细胞分裂的分子钟的实验证据：如上所述，端粒DNA缩短后可在端粒酶的作用下得以合成而使端粒延长，但正常体细胞并无端粒酶活性。给正常人体细胞导入端粒酶后是否能延长细胞寿命？Bordner等[14]利用端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)，构建出两种hTRT cDNA的表达载体，并将其转染给正常的hTRT阴性(hTRT-)细胞以观察其对端粒长度、细胞核型及寿命的影响。hTRT表达载体中一个由于将hTRT去除了5及3端的非翻译区,因而得以增加其翻译的效率，并将其组建到骨髓瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV)促进子的下游。另一个则组建到病毒载体pZeoSV促进子下游。结果表明，将具有端粒酶活性的MPSV-hTRT表达载体分别转染正常hTRT-视网膜色素上皮细胞(RPE340)及成纤维细胞BJ克隆后，RPE克隆中，端粒酶活性明显上升，在65%～360%之间(以自人肺癌分离出的细胞株H1299中的端粒酶活性为100%),而在BJ克隆中，其活性在86%～95%。此种端粒酶活性范围与在肿瘤细胞中观察到的相似。同时hTRT+细胞其端粒得到延长。他们检测了端粒长度以确定hTRT-重构的端粒酶是否对正常的染色体有作用。在hTRT-细胞，端粒的长度减少0.4到1.3 kb, 与在大量培养时在相应的PD(population doubling)上所见到的端粒缩短现象相比较，转染了MPSV-hTRT载体的hTRT+PRE及BJ克隆，端粒分别增加了(7.1±1.4)kb (n=26) 及(7.1±0.3)kb (n=3)。在转染pZeoSV-hTRT载体的6个hTRT+克隆，端粒增加了(0.4±0.3)kb (n=6)。此结果提示，在正常细胞，hTRT-细胞一旦转染端粒酶后，其内源性的端粒会得以延长。
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为探讨端粒酶表达对正常细胞寿命的影响，Cooke等对hTRT+及hTRT-克隆的生长情况进行了比较。hTRT- RPE克隆表现出预想的生长缓慢并伴有离体情况下的衰老现象，在33个衰老的克隆中有30个表现有大量RPE培养时的老化特征。与此相反，转染了MPSV-hTRT的hTRT+RPE克隆超过hTRT-平均寿命的约20倍。这些克隆已经超过了RPE最高寿命，而且能以年轻RPE的相同的速率进行分裂。类似的，大多数hTRT- BJ成纤维细胞克隆老化或接近老化，而转染了pZeoSV-hTRT载体的克隆，所有6个的寿命均超过BJ的最大寿命。6个快速分裂的hTRT+克隆的平均PD已经超出70个 hTRT-克隆平均寿命的36倍。在人的血管内皮细胞上，得到了类似的结果。因而可以肯定，正常细胞中hTRT的功能性表达确能延长其寿命。
衰老相关的β-galactosidase(SA-β-Gal)是公认的细胞老化的生物标志。用此对已经老化或接近老化的hTRT-RPE克隆进行染色并将其染色情况与hTRT+克隆(基本经历相同乃至更多次数的细胞分裂)的染色情况进行比较后发现，hTRT-克隆中的大部分细胞表现为强染色，而在hTRT+克隆(相当的或更多的PD)中，却很少有细胞被染色。停止分裂的hTRT-克隆的细胞其SA-β-Ga染色水平与在衰老大量培养物中观察到的差不多。其细胞体积的增大以及细胞浆/细胞核的比例增加提示细胞确已衰老。hTRT-克隆中其余的一些分裂速度很慢的克隆的SA-β-Gal染色表现为典型的接近衰老的细胞的特征。在培养的纤维母细胞中亦得到基本相同的结果：所有的6个hTRT+克隆都表现为年轻的纤维母细胞在培养时所表现的低水平染色。而所有的hTRT- 克隆则都呈现SA-β-Ga染色水平的提高。两个hTRT+RPE克隆及两个hTRT+ BJ克隆的详细的G-结合的情况表明，其所有的46条染色体均正常，未发现不正常的染色体。寿命得到延长的hTRT+细胞因而也呈现出与年轻的细胞相似的正常的表型及基因型[14]。
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3.端粒、端粒酶与癌症：由于端粒充当了细胞分裂的分子钟作用，因而在干细胞、生殖细胞及肿瘤细胞往往表现出很强的端粒酶活性。目前多数学者认为体细胞端粒酶活性的大幅度上升是正常细胞转化为癌细胞的关键环节。它对肿瘤的研究具有潜在的理论及实践意义。有资料表明，端粒酶的激活在使细胞避免老化的同时，又恰好满足了肿瘤生长的条件。因而探讨肿瘤细胞中端粒酶失调的分子基础对研究肿瘤的分子机制具有非常主要的理论及实践意义。在正常的人的细胞内可能存在一种或数种肿瘤抑制基因起着防止端粒酶激活的作用[10,15]。
三、困难与展望：
尽管上述某些发现令人鼓舞，如通过人为转入端粒酶可使培养的哺乳动物体细胞寿命大大延长以致于有望无限延长即达到所谓的永生化，但使单个细胞寿命延长，并不意味着多细胞生物作为整体的返老还童。众所周知，多细胞生物如人体由数万亿个细胞组成，要使如此众多细胞的基因组得以改善从而使其年轻化，看来并非易事。另外，如何把握细胞的永生化与癌化之间的界限，可能成为制约衰老及抗衰老研究的瓶颈。如上所述，已有证据表明，癌细胞中端粒酶活性明显升高，甚至高于分裂旺盛的干细胞以及生殖细胞。因而除非科学家能有效地控制细胞的分裂，否则，激活端粒酶非但不能使人长寿，反而会导致癌症的发生。有人认为多细胞生物中每一个细胞都有自己的生物钟，正是这一生物钟告知细胞何时停止生长及开始死亡。从而使得多细胞整体得以协调地生长。人为干预细胞内的生物钟可以拯救单个细胞，但却有可能妨碍整体的生存。
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端粒作为细胞分裂的计数器在生物界是否具有普遍性，也尚待进一步探讨。如Mus musculus小鼠，其端粒的长度是人类的3倍，但其寿命并非人类的3倍。此外，衰老的人的细胞并没有丢失所有端粒DNA而是仍留有残存的部分DNA，而此种残存的DNA实际上与许多其它真核细胞的端粒DNA的长度相当。为何仅仅是端粒 DNA的部分丢失却导致了细胞寿命之间的如此大的差异？
在衰老基因的研究中，我们还需要找到衰老基因表达产物导致细胞停止分裂的更直接的证据及其作用的分子机制。此外，衰老这一过程究竟牵涉到多少基因？是多个基因共同作用的结果还单个基因的作用？因而对衰老基因需要进行严格的理论及实践上的界定。
当然，上述这些发现可以说在人类最终认识衰老的机制方面前进了一大步。尽管尚无法控制多细胞生物的所有细胞，但我们认为利用这些成果去改善某些关键的细胞从而延缓人类的衰老似乎具有一定的实践意义。如某些终末分化细胞包括脑神经细胞及心肌细胞等。笔者相信，衰老作为一个过程，终究是可以认识的，因而也一定能按照人类的意愿进行控制。返老还童也未必就是天方夜谭。
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[收稿日期] 1998-12-29 [修回日期] 1999-06-02, 百拇医药