乳腺癌组织中金属硫蛋白表达的意义
作者：张瑞芬 罗贤懋 张宏图 魏慧娟
单位：张瑞芬(北京医科大学微生物系，北京 100083)；罗贤懋 张宏图 魏慧娟(中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所,北京 100021)
关键词：金属硫蛋白；乳腺肿瘤；预后
中国病理生理杂志000121
[摘 要] 目的： 探讨金属硫蛋白(MT)在浸润性乳腺导管癌中的表达及其临床意义。方法： 常规免疫组化LAB法检测了96例浸润性乳腺导管癌术后标本中MT的表达情况。结果： 浸润性乳腺导管癌标本的MT表达率为52.1%(50/96)，在大多数阳性病例中胞浆、胞核均着色。MT表达与乳腺癌的核分级有关(P<0.01)；MT表达阳性者和阴性者相比预后大多较差(P<0.01)。结论： MT表达可预测乳腺癌的预后，MT有可能作为又一个增殖旺盛、侵袭性强的肿瘤标志物。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R 737.9 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0074-03
Significance of metallothionein expression in invasive ductal breast cancer
ZHANG Rui-fen，LUO Xian-mao，ZHANG Hong-tu，WEI Hui-juan
(Cancer Institute，Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College，Beijing 100021, China)
[Abstract] AIM：To asses the presence and clinical significance of metallothionein,(MT) in primary invasive ductal carcinoma of the breast. METHOD： 96 cases of routinely fixed and paraffin-embedded primary breast carcinomas were investigated with the labelled avidin biotin immunohistochemical method. RESULTS： The positive staining for MT observed was 52.1% (50/96). In most cases both nuclear and cytoplasmic staining was seen. A statistically association was found between MT positive staining and nuclear grade(P<0.01).MT positive cases had a significantly poorer prognosis when compared with the MT negative cases (P<0.01). CONCLUSION：These results indicated that overexpression of MT may be of some prognostic value for primary invasive ductal carcinoma of the breast and is possibly a biomarker of more aggressive and proliferating carcinoma cells.
, 百拇医药
[MeSH] Metallothionein； Breast neoplasms； Prognosis
乳腺癌是女性高发肿瘤，多年来研究表明：其预后与患者的年龄、病程早晚、淋巴结转移和治疗方式等有关[1]。金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类广泛存在、富含半胱氨酸、与金属离子具有高度亲和性的低分子量蛋白。已知MT的功能包括：调节体内Zn、Cu等金属含量，对Cd、Hg等有毒金属进行解毒，保护细胞不受放射线和烷化剂的损伤等[2]。近来，在许多肿瘤组织如乳腺癌、胰腺癌中都证实有MT存在，并发现MT高表达与肿瘤患者的不佳预后有关[3，4] 。鉴于乳腺癌中浸润性导管癌占很大部分，我们选取了96例浸润性乳腺导管癌术后标本，对MT表达进行了检测，探讨MT表达对浸润性乳腺导管癌预后的影响及其可能的机制。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、标本来源：
1988年7月至1992年7月中国医科院肿瘤医院腹部外科乳腺癌病人96例，均有术后病理报告证实为浸润性乳腺导管癌。所有病例都为女性，无术前放化疗史，并已随诊5年以上，平均年龄为(49±5)岁。
二、实验方法：
试剂：MT多抗(自制)，生物素标记IgG，亲和素化辣根过氧物酶(北京挚诚公司), DAB(Sigma)。
福尔马林固定、石蜡包埋的病理组织块切成5 μm厚，免疫组化LAB 法(labelled avidin biotin method)检测MT的步骤为：(1)切片经二甲苯脱蜡20min和梯度乙醇水化6 min；(2)3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶30 min；(3)10%羊血清封闭1 h；(4)加MT多抗，湿盒4℃过夜；(5)加生物素标记羊抗兔IgG，37 ℃ 1 h；(6)加亲和素化辣根过氧化物酶，37℃ 1 h；(7)以二氨基联苯胺(3'3-diaminobenzidine,DAB)和过氧化氢混合液显色10 min；(8)苏木素复染，二甲苯透明，树胶封片。上述4～6步骤间用缓冲液(0.05 mol/L PBS，pH7.4)洗涤3次。ZnSO4诱导(10 mg/kg体重腹腔注射，每日1次，连续3 d)后的小鼠肾脏组织切片作为阳性对照，阴性对照不加MT多抗，余同上。
, 百拇医药
三、结果判定：
光镜下观片，双盲法计数阳性细胞。随机选5个高倍视野(×400)，计数300个肿瘤细胞，根据着色细胞的数目，判定MT的染色结果。棕黄色细胞数<20%判为阴性，棕黄色细胞数>20%判为阳性。
参照Elston和Ellis改良的Scarff Bloom Richardson 分级法[5]，高倍镜下选取肿瘤组织周围10个视野。根据核分裂细胞的数目，将结果分为3级：10个视野中有0～9个核分裂为1级；10～20个核分裂为2级；20个或更多核分裂为3级。
四、统计方法：
不同组间比较用χ2检验，累积生存率用Kaplan-Meier方法统计并用Log-rank进行显著性检验。
结 果
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一、 MT表达的特征和检测阳性率：
阴性对照在镜下未发现染色颗粒着色，MT阳性表达者在肿瘤细胞浆和/或胞核内呈现棕色颗粒。MT染色阳性的细胞成团或个别分散在癌组织中，在同一张切片上，MT深染、浅染和未染色细胞可同时存在。96例标本中，50例观察到MT的阳性染色，阳性率为52.1%。
二、MT染色与一些和预后相关的病理参数之间的关系：
MT在浸润性乳腺导管癌组织中的阳性表达与淋巴结转移状态有关，发生淋巴结转移的患者MT表达率高于无淋巴结转移者(P<0.05)；随着乳腺癌细胞核分级的增高，MT的表达率增高，1级与2、3级相比均有显著差异(P<0.01)；MT表达与乳腺肿瘤大小之间无显著差异(见表1)。
表1 MT染色与一些病理参数间的关系
Tab 1 Association between MT immunostaining and morphological parameters
, http://www.100md.com
n
MT expression
Lymph-node status
No metastasis
36
14(38.90%)
Metastasis
60
36(60.00%)*
Nuclear grade
1
, 百拇医药 18
5(0.28%)
2
40
18(0.45%)△△
3
38
27(0.71%)△△
Tumor size
<2cm
25
12(0.48%)
, http://www.100md.com
between 2～5 cm
57
32(0.56%)
>5cm
14
6(0.43%)
MT expression values represent number with the percentage in parentheses
*P<0.05, vs no metastasis；△△ P<0.01, vs nuclear grade 1
三、乳腺癌组织中MT的表达与患者的预后的关系：
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乳腺癌患者中MT表达阴性和阳性组的累计生存率曲线见附图。标本中MT蛋白的表达对患者的5年生存率有明显影响，MT 表达阳性患者的5年生存率明显低于MT表达阴性患者(P<0.01)。
Fig 1 Kaplan-Meier curve showing overall survival in regard to MT expression
图1 Kaplan-Meier曲线： MT表达与累积生存率
讨 论
金属硫蛋白是一类和重金属具有高度亲和性并富含半胱氨酸的低分子量蛋白。在体内金属的代谢和重金属解毒方面有重要意义。除了肌上皮和甲状腺上皮等特殊细胞类型外，利用通常免疫组化方法在其他细胞中一般检测不到MT 的表达。但是，许多因素如金属、糖皮质激素和细胞因子都能诱导MT 表达增加。免疫组化方法检测到许多肿瘤组织如乳腺癌和胰腺癌MT 表达很高而且可能和病人的不佳预后有关。本文结果表明MT表达与否和乳腺癌病人的不良预后密切相关。我们检测了96例浸润性乳腺导管癌组织的MT表达情况，阳性率是52.1%，比国外报道稍微偏高，Schmid等为40%(24/60)[3]，Fresno等为44%(35/79)[6]；比国内蒋树娟等报道的81%(95/118)的阳性率偏低[7]。其中的差别也许和MT染色的判定标准不尽相同有关，值得深入探讨。MT表达对患者术后5年生存率有明显影响，MT 表达阳性患者的5年生存率明显低于MT表达阴性患者。这与Schmid等的结论相近。我们认为这与MT调节细胞周期的功能有联系。在人结肠癌细胞中MT具有调节细胞周期的功能[8] , 提示MT可作为细胞增殖的标志物。我们发现随着乳腺癌组织核分裂数的增多，MT阳性的表达率增高。在大鼠的睾丸细胞也观察到MT表达与细胞的增殖和分化相关[9]。因而有可能增殖旺盛、侵袭性强的肿瘤组织需要合成更多的MT。MT的生物学作用可能不是仅仅局限于重金属解毒，在调控肿瘤细胞的生长和增殖方面也有重要作用。降低MT表达水平的制剂可阻止MT的活性进而抑制肿瘤细胞生长。已有一些利用MT反义寡核苷酸降低肿瘤细胞MT水平达到抑制肿瘤细胞生长的报道[10]。
, 百拇医药
(感谢罗贤懋导师的热情指导和李泰生教授的大力协助)
[参 考 文 献]
[1] 刘复生，李晓，张询. 乳腺癌的组织学分级和预后[J]. 中华病理学杂志, 1993，22(1)：36～39.
[2] Karin M. Metallothioneins: Proteins in search of function [J]. Cell, 1985,41：9～10.
[3] Schmid KW , Ellis IO, Gee JMW, et al. Presence and possible significance of immunocytochemically demonstratable metallothionein over expression in primary invasive ductal carcinoma of the breast [J]. Virchows Archiv A Pathol Anat, 1993,422：153～159.
, 百拇医药
[4] Ohshio G ,Imamura T, Okada N, et al. Immunohistochemical study of metallothonein in pancreatic carcinomas [J]. J Cancer Res Clin Oncol ,1996 ,122：351～356.
[5] Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast cancer. Ⅰ.the value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up [J]. Histopathology ,1991,19:411～417.
[6] Fresno M , Wu W , Rodriguez JM , et al . Localization of metallothionein in breast carcinomas. An immunohistochemical study [J]. Virchows Archiv A Pathol Anat, 1993,423：215～219.
, 百拇医药
[7] 蒋树娟，仲兰荪，魏 英， 等. 金属硫蛋白在乳腺癌中的表达及其与预后的关系 [J]. 中国癌症杂志, 1997，7：109～111.
[8] Nagel WW, Vallee BL. Cell cycle regulation of metallothionein in human colonic cancer cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA , 1995, 92：579～583.
[9] Nishimura H, Nishimura N,Tohyama C , et al. Localization of matallothionein in the genital organs of the rat [J]. J Histochem Cytochem 1990,38：927～933.
[10] Abdel-Mageed AB, Agrawal KC. Antisense down-regulation of metallothionein induces growth arrest and apoptosis in human breast carcinoma cells [J].Cancer Gene Therapy, 1997,4：199～207.
[收稿日期] 1998-12-07 [修回日期] 1999-04-04, http://www.100md.com
单位：张瑞芬(北京医科大学微生物系，北京 100083)；罗贤懋 张宏图 魏慧娟(中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所,北京 100021)
关键词：金属硫蛋白；乳腺肿瘤；预后
中国病理生理杂志000121
[摘 要] 目的： 探讨金属硫蛋白(MT)在浸润性乳腺导管癌中的表达及其临床意义。方法： 常规免疫组化LAB法检测了96例浸润性乳腺导管癌术后标本中MT的表达情况。结果： 浸润性乳腺导管癌标本的MT表达率为52.1%(50/96)，在大多数阳性病例中胞浆、胞核均着色。MT表达与乳腺癌的核分级有关(P<0.01)；MT表达阳性者和阴性者相比预后大多较差(P<0.01)。结论： MT表达可预测乳腺癌的预后，MT有可能作为又一个增殖旺盛、侵袭性强的肿瘤标志物。
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[中图分类号] R 737.9 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0074-03
Significance of metallothionein expression in invasive ductal breast cancer
ZHANG Rui-fen，LUO Xian-mao，ZHANG Hong-tu，WEI Hui-juan
(Cancer Institute，Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College，Beijing 100021, China)
[Abstract] AIM：To asses the presence and clinical significance of metallothionein,(MT) in primary invasive ductal carcinoma of the breast. METHOD： 96 cases of routinely fixed and paraffin-embedded primary breast carcinomas were investigated with the labelled avidin biotin immunohistochemical method. RESULTS： The positive staining for MT observed was 52.1% (50/96). In most cases both nuclear and cytoplasmic staining was seen. A statistically association was found between MT positive staining and nuclear grade(P<0.01).MT positive cases had a significantly poorer prognosis when compared with the MT negative cases (P<0.01). CONCLUSION：These results indicated that overexpression of MT may be of some prognostic value for primary invasive ductal carcinoma of the breast and is possibly a biomarker of more aggressive and proliferating carcinoma cells.
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[MeSH] Metallothionein； Breast neoplasms； Prognosis
乳腺癌是女性高发肿瘤，多年来研究表明：其预后与患者的年龄、病程早晚、淋巴结转移和治疗方式等有关[1]。金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类广泛存在、富含半胱氨酸、与金属离子具有高度亲和性的低分子量蛋白。已知MT的功能包括：调节体内Zn、Cu等金属含量，对Cd、Hg等有毒金属进行解毒，保护细胞不受放射线和烷化剂的损伤等[2]。近来，在许多肿瘤组织如乳腺癌、胰腺癌中都证实有MT存在，并发现MT高表达与肿瘤患者的不佳预后有关[3，4] 。鉴于乳腺癌中浸润性导管癌占很大部分，我们选取了96例浸润性乳腺导管癌术后标本，对MT表达进行了检测，探讨MT表达对浸润性乳腺导管癌预后的影响及其可能的机制。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、标本来源：
1988年7月至1992年7月中国医科院肿瘤医院腹部外科乳腺癌病人96例，均有术后病理报告证实为浸润性乳腺导管癌。所有病例都为女性，无术前放化疗史，并已随诊5年以上，平均年龄为(49±5)岁。
二、实验方法：
试剂：MT多抗(自制)，生物素标记IgG，亲和素化辣根过氧物酶(北京挚诚公司), DAB(Sigma)。
福尔马林固定、石蜡包埋的病理组织块切成5 μm厚，免疫组化LAB 法(labelled avidin biotin method)检测MT的步骤为：(1)切片经二甲苯脱蜡20min和梯度乙醇水化6 min；(2)3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶30 min；(3)10%羊血清封闭1 h；(4)加MT多抗，湿盒4℃过夜；(5)加生物素标记羊抗兔IgG，37 ℃ 1 h；(6)加亲和素化辣根过氧化物酶，37℃ 1 h；(7)以二氨基联苯胺(3'3-diaminobenzidine,DAB)和过氧化氢混合液显色10 min；(8)苏木素复染，二甲苯透明，树胶封片。上述4～6步骤间用缓冲液(0.05 mol/L PBS，pH7.4)洗涤3次。ZnSO4诱导(10 mg/kg体重腹腔注射，每日1次，连续3 d)后的小鼠肾脏组织切片作为阳性对照，阴性对照不加MT多抗，余同上。
, 百拇医药
三、结果判定：
光镜下观片，双盲法计数阳性细胞。随机选5个高倍视野(×400)，计数300个肿瘤细胞，根据着色细胞的数目，判定MT的染色结果。棕黄色细胞数<20%判为阴性，棕黄色细胞数>20%判为阳性。
参照Elston和Ellis改良的Scarff Bloom Richardson 分级法[5]，高倍镜下选取肿瘤组织周围10个视野。根据核分裂细胞的数目，将结果分为3级：10个视野中有0～9个核分裂为1级；10～20个核分裂为2级；20个或更多核分裂为3级。
四、统计方法：
不同组间比较用χ2检验，累积生存率用Kaplan-Meier方法统计并用Log-rank进行显著性检验。
结 果
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一、 MT表达的特征和检测阳性率：
阴性对照在镜下未发现染色颗粒着色，MT阳性表达者在肿瘤细胞浆和/或胞核内呈现棕色颗粒。MT染色阳性的细胞成团或个别分散在癌组织中，在同一张切片上，MT深染、浅染和未染色细胞可同时存在。96例标本中，50例观察到MT的阳性染色，阳性率为52.1%。
二、MT染色与一些和预后相关的病理参数之间的关系：
MT在浸润性乳腺导管癌组织中的阳性表达与淋巴结转移状态有关，发生淋巴结转移的患者MT表达率高于无淋巴结转移者(P<0.05)；随着乳腺癌细胞核分级的增高，MT的表达率增高，1级与2、3级相比均有显著差异(P<0.01)；MT表达与乳腺肿瘤大小之间无显著差异(见表1)。
表1 MT染色与一些病理参数间的关系
Tab 1 Association between MT immunostaining and morphological parameters
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n
MT expression
Lymph-node status
No metastasis
36
14(38.90%)
Metastasis
60
36(60.00%)*
Nuclear grade
1
, 百拇医药 18
5(0.28%)
2
40
18(0.45%)△△
3
38
27(0.71%)△△
Tumor size
<2cm
25
12(0.48%)
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between 2～5 cm
57
32(0.56%)
>5cm
14
6(0.43%)
MT expression values represent number with the percentage in parentheses
*P<0.05, vs no metastasis；△△ P<0.01, vs nuclear grade 1
三、乳腺癌组织中MT的表达与患者的预后的关系：
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乳腺癌患者中MT表达阴性和阳性组的累计生存率曲线见附图。标本中MT蛋白的表达对患者的5年生存率有明显影响，MT 表达阳性患者的5年生存率明显低于MT表达阴性患者(P<0.01)。
Fig 1 Kaplan-Meier curve showing overall survival in regard to MT expression
图1 Kaplan-Meier曲线： MT表达与累积生存率
讨 论
金属硫蛋白是一类和重金属具有高度亲和性并富含半胱氨酸的低分子量蛋白。在体内金属的代谢和重金属解毒方面有重要意义。除了肌上皮和甲状腺上皮等特殊细胞类型外，利用通常免疫组化方法在其他细胞中一般检测不到MT 的表达。但是，许多因素如金属、糖皮质激素和细胞因子都能诱导MT 表达增加。免疫组化方法检测到许多肿瘤组织如乳腺癌和胰腺癌MT 表达很高而且可能和病人的不佳预后有关。本文结果表明MT表达与否和乳腺癌病人的不良预后密切相关。我们检测了96例浸润性乳腺导管癌组织的MT表达情况，阳性率是52.1%，比国外报道稍微偏高，Schmid等为40%(24/60)[3]，Fresno等为44%(35/79)[6]；比国内蒋树娟等报道的81%(95/118)的阳性率偏低[7]。其中的差别也许和MT染色的判定标准不尽相同有关，值得深入探讨。MT表达对患者术后5年生存率有明显影响，MT 表达阳性患者的5年生存率明显低于MT表达阴性患者。这与Schmid等的结论相近。我们认为这与MT调节细胞周期的功能有联系。在人结肠癌细胞中MT具有调节细胞周期的功能[8] , 提示MT可作为细胞增殖的标志物。我们发现随着乳腺癌组织核分裂数的增多，MT阳性的表达率增高。在大鼠的睾丸细胞也观察到MT表达与细胞的增殖和分化相关[9]。因而有可能增殖旺盛、侵袭性强的肿瘤组织需要合成更多的MT。MT的生物学作用可能不是仅仅局限于重金属解毒，在调控肿瘤细胞的生长和增殖方面也有重要作用。降低MT表达水平的制剂可阻止MT的活性进而抑制肿瘤细胞生长。已有一些利用MT反义寡核苷酸降低肿瘤细胞MT水平达到抑制肿瘤细胞生长的报道[10]。
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(感谢罗贤懋导师的热情指导和李泰生教授的大力协助)
[参 考 文 献]
[1] 刘复生，李晓，张询. 乳腺癌的组织学分级和预后[J]. 中华病理学杂志, 1993，22(1)：36～39.
[2] Karin M. Metallothioneins: Proteins in search of function [J]. Cell, 1985,41：9～10.
[3] Schmid KW , Ellis IO, Gee JMW, et al. Presence and possible significance of immunocytochemically demonstratable metallothionein over expression in primary invasive ductal carcinoma of the breast [J]. Virchows Archiv A Pathol Anat, 1993,422：153～159.
, 百拇医药
[4] Ohshio G ,Imamura T, Okada N, et al. Immunohistochemical study of metallothonein in pancreatic carcinomas [J]. J Cancer Res Clin Oncol ,1996 ,122：351～356.
[5] Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast cancer. Ⅰ.the value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up [J]. Histopathology ,1991,19:411～417.
[6] Fresno M , Wu W , Rodriguez JM , et al . Localization of metallothionein in breast carcinomas. An immunohistochemical study [J]. Virchows Archiv A Pathol Anat, 1993,423：215～219.
, 百拇医药
[7] 蒋树娟，仲兰荪，魏 英， 等. 金属硫蛋白在乳腺癌中的表达及其与预后的关系 [J]. 中国癌症杂志, 1997，7：109～111.
[8] Nagel WW, Vallee BL. Cell cycle regulation of metallothionein in human colonic cancer cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA , 1995, 92：579～583.
[9] Nishimura H, Nishimura N,Tohyama C , et al. Localization of matallothionein in the genital organs of the rat [J]. J Histochem Cytochem 1990,38：927～933.
[10] Abdel-Mageed AB, Agrawal KC. Antisense down-regulation of metallothionein induces growth arrest and apoptosis in human breast carcinoma cells [J].Cancer Gene Therapy, 1997,4：199～207.
[收稿日期] 1998-12-07 [修回日期] 1999-04-04, http://www.100md.com