大鼠心肌顿抑时血浆及心肌组织中降钙素基因相关肽含量的变化
作者：吴宏超 钱学贤 李立平
单位：吴宏超 钱学贤(第一军医大学珠江医院心内科)；李立平(消化科，广东 广州 510282)
关键词：心肌；降钙素基因相关肽；大鼠
中国病理生理杂志000109
[摘 要] 目的：观察大鼠心肌顿抑时降钙素基因相关肽(CGRP)的变化规律。方法：采用大鼠在体心肌顿抑模型，用放射免疫分析法测定血浆及心肌组织中CGRP含量。结果：心肌顿抑时血浆CGRP水平较对照组显著升高(P<0.01)，而心肌组织中CGRP含量则较对照组显著降低(P<0.05)。结论：心肌组织与血浆中的CGRP含量呈负相关关系。
[中图分类号] R331.3+1 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号] 1000-4718(2000)01-0033-03
Changes of plasma and myocardial calcitonin gene-related peptide in myocardial stunning rats
WU Hong-chao, QIAN Xue-xian, LI Li-ping
(Department of Cardiology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282， China)
[Abstract] AIM: To investigate changes of calcitonin gene-related peptide(CGRP) in myocardial stunning rats. METHODS: Rat in vivo myocardial stunning model was used. CGRP content in plasma and myocardium were determined by radioimmunoassay. RESULTS: Plasma level of CGRP increased significantly (P<0.01), but in left ventricular myocardium CGRP decreased obviously (P<0.05) in myocardial stunning group compared with the control group. CONCLUSION: CGRP content in the left ventricular myocardium was negatively correlated with plasma CGRP.
, 百拇医药
[MeSH] Myocardium; Calcitonin gene-related peptide; Rats
心肌顿抑是指心肌短时间缺血后当冠脉血流恢复正常或接近正常时，心肌细胞未发生损害而心肌机械功能发生一过性异常的状态[1]。迄今为止，其确切的发生机理尚未阐明。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是一种内源性血管活性多肽，由37个氨基酸组成，具有强大的扩张血管，尤其是扩张冠脉血管、改善冠脉血流作用；对心脏具有正性变力作用[2～4]。有关心肌顿抑时体内CGRP变化规律的研究目前尚未见文献报道，因此作者设计了本实验。
材 料 和 方 法
一、动物模型：
采用大鼠在体心肌顿抑模型[5]。具体操作如下：以3%戊巴比妥钠(60 mg/kg,ip)将大鼠麻醉，气管插管行人工呼吸。左侧第四肋间开胸，剪开心包，暴露心脏及左室表面血管，以肺动脉圆锥及左心耳交界处的左冠状静脉的标志，用3/8 Cr 3×6不锈钢园针，3～0丝线穿过左心耳下缘的心肌浅层。稳定15 min，如出现明显心律失常或平均动脉压低于9.33 kPa持续5 min以上则弃之不用。对照组穿线但不收紧线，实验组将丝线两端一起穿入1管径2 mm的聚乙烯管中，稳定5 min后抽紧丝线，将塑料管压向冠状动脉并与丝线一并夹住，阻断冠脉前降支血流，15 min后放松塑料管与丝线行再灌注2 h。
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二、心肌收缩功能测定：
分离右侧颈总动脉，插入PE50管至左心室，导管末端接压力传感器，连接于生理记录仪上，输出LVP信号，经A/D转换输入计算机记录左心室压力曲线，经程序处理获得左心室峰压(LVP)、左心室压力最大上升与下降速率(±dp/dtmax)、心肌收缩成分速率最大值(Vpm)、零负荷时收缩成分最大速率(Vmax)、心肌收缩成分缩短速度(Vce)等心功能指标。
三、血清心肌酶含量测定：
实验完毕取颈动脉血，分离血清，用自动生化分析仪(Beckman)测定血清中肌酸激酶(creatine kinase, CK)及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)含量，单位IU/L。
四、组织学检查：
, 百拇医药
实验完毕，取缺血部位心肌作常规切片，HE染色，光镜检查，Olympus BH-2型倒置显微镜观察照像；取缺血区中央部位心肌，修成1 mm×1 mm×1 mm小块，浸入2%戊二醛0.1MPB(pH 7.4)内，4 ℃后固定过夜，常规脱水，Epon-812包埋，超薄切片，醋酸铅铀染色，JME-1200EX型透射电镜观察、照像。
五、血浆及心肌组织中CGRP含量测定：
(一)样品收集：
1.血浆：取血3mL，注入含10%EDTA Na2 30 μL和抑肽酶40 μL的试管中，混匀，4 ℃ 3?000 r/min离心10 min分离血浆，-20℃保存待测。
2.心肌组织：取出心脏，吸去血迹，称重。剪下100 mg左右的左室缺血区心肌尽快放入1mol/L HAC 1 mL略作研磨，然后在100 ℃水中煮沸10 min，匀浆。4 ℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清于-20℃保存。
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(二)测定方法：采用非平衡法。具体操作按试剂盒说明书进行，试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所。
六、统计处理:
所有实验数据均以均数±标准差(
±s)表示，用t检验判定均数差异显著性。
结 果
实验过程中出现室性心动过速或心室颤动≥2 min、动脉压低于9.33 kPa、出血过多(2 mL以上)或缺血面积过小者(<60 mg)弃之不用。
一、心功能的变化：
心肌缺血15min后心功能明显减低，与对照组相比P<0.01；再灌注后随着时间的延长，心功能有所恢复。但至再灌注2h时仍未达到对照组水平，其+dp/dtmax、-dp/dtmax、Vmax、LVSP、Vce和Vpm分别为对照组的68.81%、59.50%、53.95%、74.96%、47.07%和63.31%(P值均<0.01) 。实验组于再灌注后2 h,静脉注射异丙基肾上腺素(0.3 mg/kg)能明显改善心肌功能，使+dp/dtmax由380.05±61.58(kPa/s)增加至462.33 ±76.84(kPa/s)(P<0.01)。
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二、心肌酶学及组织学检查：
心肌顿抑组血清CK和LDH分别为215.92±55.57和97.75±23.37(IU/L)，与对照组CK(198.42±49.89 IU/L)和LDH(91.67±17.23 IU/L)比较无明显差异。
光镜下见顿抑心肌组织结构正常，心肌纤维排列整齐，未见坏死和出血点；电镜下见细胞无明显水肿，心肌肌原纤维、肌浆网结构正常；核膜完整，染色质核边聚。部分线粒体肿胀，基质明显变淡，嵴排列紊乱，或部分嵴消失。
三、血浆及心肌组织中CGRP水平的变化：
实验结果(见表1)显示心肌顿抑时血浆CGRP水平显著高于对照组(P<0.01)；而心肌组织中CGRP含量(0.231±0.172 pmol/g)则显著低于对照组(0.299±0.229 pmol/g)(P<0.05)。相关分析表明，心肌组织CGRP含量与血浆中的CGRP水平呈显著负相关(r＝-0.7952，P<0.01)。
, 百拇医药
表1 大鼠心肌顿抑时血浆及心肌组织中CGRP的变化
Tab 1 Changes of CGRP levels in blood and myocardium
in rats with myocardial stunning(±s，n=11) Group
Blood(pg/mL)
Myocardium(pmol/g)
Control
227.3±181.1
0.299±0.229
, 百拇医药
Myocardial stunning
520.4±480.6**
0.231±0.172*
*P<0.05，**P<0.01，vs control group讨 论
实验结果显示，大鼠冠脉结扎15 min再灌注2 h可引起心功能下降，而且即使恢复再灌注，2 h内心功能也不能完全恢复；注射异丙肾上腺素可显著改善再灌注2h时的心肌功能。心肌酶学及组织学检查证实，缺血心肌组织除线粒体轻度受损外，无不可逆心肌损害的证据。符合心肌顿抑条件，说明模型建立是成功的。
实验发现，心肌顿抑时血浆中CGRP水平明显增高，而心肌组织中CGRP含量却显著少于对照组；血浆与心肌组织中CGRP含量之间呈显著负相关。本实验室研究还发现顿抑心肌组织中CGRP免疫反应神经纤维数量显著减少[6]，因此作者推测可能由于缺血等刺激促使CGRP从外周神经释放，引起血浆CGRP浓度升高，而心肌组织中CGRP神经末梢释放CGRP增多，心肌组织CGRP含量降低。虽然心肌顿抑时血浆CGRP含量明显增高，但并未观察到CGRP的心血管效应。其原因可能是由于用免疫学方法检测CGRP时，不能区分α-CGRP和β-CGRP；同时，抗体还可与CGRP的其它形式发生交叉反应，如CGRP的前提，二聚体或其降解片段等。在大鼠实验中已证实[7]，血浆中的CGRP有两个来源：外周神经是其基本来源，甲状腺C细胞可能是另一个来源。体内CGRP主要分布于神经系统，尤以脊髓中含量最高。心肌顿抑时检测到的血浆CGRP升高可能主要来源于心血管以外的组织，其中可能还包含许多无活性形式；而且心肌组织本身CGRP含量减少，故不能观察到CGRP有益的心血管效应。
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有报道认为，大鼠缺血/再灌注损伤时，血浆及心肌组织内皮素-1(ET-1)含量明显增加。增加的内皮素可直接作用于心肌细胞，促进钙内流和胞内贮存钙释放，导致细胞内钙超载；抑制心肌能量代谢，诱发或加重细胞内钙超载；促进心肌、血管平滑肌合成、释放血管紧张素Ⅱ，而血管紧张素Ⅱ又可作用于血管或心内膜的内皮细胞，促进ET mRNA表达，增加ET释放；还可通过其血流动力学和(或)细胞机制促进组织细胞脂质过氧化损伤，而脂质过氧化又促进内皮素的大量释放，从而参与了心脏缺血/再灌注损伤的发病过程[8]。CGRP具有扩张冠状血管、改善心肌血流及正性肌力作用，抑制血管平滑肌细胞释放ET-1，并可拮抗内皮素的作用，对抗交感神经兴奋和RAAS激活所致的血管收缩效应，故作者认为心肌组织中CGRP含量减少可能在心肌顿抑的发生中有一定作用。
[基金项目] 军队九五科研基金资助
[参 考 文 献]
, http://www.100md.com [1] Braunwald E, Kloner RA. The stunned myocardium: prolonged, post ischemic ventricular dysfunction[J]. Circulation, 1983,66(6):1146～1149.
[2] Mulderry PK, Ghatei MA, Rodrigo J, et al. Calcitonin gene-related peptide in cardiovascular tissues of the rat[J]. Neuroscience ,1985,41(3):947～954.
[3] Lappe RW, Slivjak JA, Todt JA, et al. Hemodynamic effects of calcitonin gene-related peptide in conscious rats[J]. Regul Pept,1987,19:307～312.
, http://www.100md.com
[4] Saito A, Kimura S, Goto K. Calcitonin gene-related peptide as potential neurotransmitter in guinea-pig right atrium[J]. Am J Physiol, 1986,250:H693～H698.
[5] 陈金明，龚肖奇，陈思聪，等.大鼠可逆性心肌缺血后功能障碍致心肌顿抑的模型[J].中国病理生理杂志，1996,12(2):223～224.
[6] 吴宏超，钱学贤，刘宏.顿抑心肌组织CGRP的免疫组织化学研究[J]. 心功能杂志,1999,11(2):77～79.
[7] Emson PC, Zaidi M. Further evidence for the origin of circulating calcitonin gene-related peptide in the rat[J]. J Physiol (Lond),1989, 412:297～308.
[8] 汤 健，唐朝枢主编. 内皮素[M]. 第1版. 北京:北京医科大学北京协和医科大学联合出版社，1994.267～274.
[收稿日期]1998-10-23 [修回日期]1999-05-28, 百拇医药
单位：吴宏超 钱学贤(第一军医大学珠江医院心内科)；李立平(消化科，广东 广州 510282)
关键词：心肌；降钙素基因相关肽；大鼠
中国病理生理杂志000109
[摘 要] 目的：观察大鼠心肌顿抑时降钙素基因相关肽(CGRP)的变化规律。方法：采用大鼠在体心肌顿抑模型，用放射免疫分析法测定血浆及心肌组织中CGRP含量。结果：心肌顿抑时血浆CGRP水平较对照组显著升高(P<0.01)，而心肌组织中CGRP含量则较对照组显著降低(P<0.05)。结论：心肌组织与血浆中的CGRP含量呈负相关关系。
[中图分类号] R331.3+1 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号] 1000-4718(2000)01-0033-03
Changes of plasma and myocardial calcitonin gene-related peptide in myocardial stunning rats
WU Hong-chao, QIAN Xue-xian, LI Li-ping
(Department of Cardiology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282， China)
[Abstract] AIM: To investigate changes of calcitonin gene-related peptide(CGRP) in myocardial stunning rats. METHODS: Rat in vivo myocardial stunning model was used. CGRP content in plasma and myocardium were determined by radioimmunoassay. RESULTS: Plasma level of CGRP increased significantly (P<0.01), but in left ventricular myocardium CGRP decreased obviously (P<0.05) in myocardial stunning group compared with the control group. CONCLUSION: CGRP content in the left ventricular myocardium was negatively correlated with plasma CGRP.
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[MeSH] Myocardium; Calcitonin gene-related peptide; Rats
心肌顿抑是指心肌短时间缺血后当冠脉血流恢复正常或接近正常时，心肌细胞未发生损害而心肌机械功能发生一过性异常的状态[1]。迄今为止，其确切的发生机理尚未阐明。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是一种内源性血管活性多肽，由37个氨基酸组成，具有强大的扩张血管，尤其是扩张冠脉血管、改善冠脉血流作用；对心脏具有正性变力作用[2～4]。有关心肌顿抑时体内CGRP变化规律的研究目前尚未见文献报道，因此作者设计了本实验。
材 料 和 方 法
一、动物模型：
采用大鼠在体心肌顿抑模型[5]。具体操作如下：以3%戊巴比妥钠(60 mg/kg,ip)将大鼠麻醉，气管插管行人工呼吸。左侧第四肋间开胸，剪开心包，暴露心脏及左室表面血管，以肺动脉圆锥及左心耳交界处的左冠状静脉的标志，用3/8 Cr 3×6不锈钢园针，3～0丝线穿过左心耳下缘的心肌浅层。稳定15 min，如出现明显心律失常或平均动脉压低于9.33 kPa持续5 min以上则弃之不用。对照组穿线但不收紧线，实验组将丝线两端一起穿入1管径2 mm的聚乙烯管中，稳定5 min后抽紧丝线，将塑料管压向冠状动脉并与丝线一并夹住，阻断冠脉前降支血流，15 min后放松塑料管与丝线行再灌注2 h。
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二、心肌收缩功能测定：
分离右侧颈总动脉，插入PE50管至左心室，导管末端接压力传感器，连接于生理记录仪上，输出LVP信号，经A/D转换输入计算机记录左心室压力曲线，经程序处理获得左心室峰压(LVP)、左心室压力最大上升与下降速率(±dp/dtmax)、心肌收缩成分速率最大值(Vpm)、零负荷时收缩成分最大速率(Vmax)、心肌收缩成分缩短速度(Vce)等心功能指标。
三、血清心肌酶含量测定：
实验完毕取颈动脉血，分离血清，用自动生化分析仪(Beckman)测定血清中肌酸激酶(creatine kinase, CK)及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)含量，单位IU/L。
四、组织学检查：
, 百拇医药
实验完毕，取缺血部位心肌作常规切片，HE染色，光镜检查，Olympus BH-2型倒置显微镜观察照像；取缺血区中央部位心肌，修成1 mm×1 mm×1 mm小块，浸入2%戊二醛0.1MPB(pH 7.4)内，4 ℃后固定过夜，常规脱水，Epon-812包埋，超薄切片，醋酸铅铀染色，JME-1200EX型透射电镜观察、照像。
五、血浆及心肌组织中CGRP含量测定：
(一)样品收集：
1.血浆：取血3mL，注入含10%EDTA Na2 30 μL和抑肽酶40 μL的试管中，混匀，4 ℃ 3?000 r/min离心10 min分离血浆，-20℃保存待测。
2.心肌组织：取出心脏，吸去血迹，称重。剪下100 mg左右的左室缺血区心肌尽快放入1mol/L HAC 1 mL略作研磨，然后在100 ℃水中煮沸10 min，匀浆。4 ℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清于-20℃保存。
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(二)测定方法：采用非平衡法。具体操作按试剂盒说明书进行，试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所。
六、统计处理:
所有实验数据均以均数±标准差(
±s)表示，用t检验判定均数差异显著性。结 果
实验过程中出现室性心动过速或心室颤动≥2 min、动脉压低于9.33 kPa、出血过多(2 mL以上)或缺血面积过小者(<60 mg)弃之不用。
一、心功能的变化：
心肌缺血15min后心功能明显减低，与对照组相比P<0.01；再灌注后随着时间的延长，心功能有所恢复。但至再灌注2h时仍未达到对照组水平，其+dp/dtmax、-dp/dtmax、Vmax、LVSP、Vce和Vpm分别为对照组的68.81%、59.50%、53.95%、74.96%、47.07%和63.31%(P值均<0.01) 。实验组于再灌注后2 h,静脉注射异丙基肾上腺素(0.3 mg/kg)能明显改善心肌功能，使+dp/dtmax由380.05±61.58(kPa/s)增加至462.33 ±76.84(kPa/s)(P<0.01)。
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二、心肌酶学及组织学检查：
心肌顿抑组血清CK和LDH分别为215.92±55.57和97.75±23.37(IU/L)，与对照组CK(198.42±49.89 IU/L)和LDH(91.67±17.23 IU/L)比较无明显差异。
光镜下见顿抑心肌组织结构正常，心肌纤维排列整齐，未见坏死和出血点；电镜下见细胞无明显水肿，心肌肌原纤维、肌浆网结构正常；核膜完整，染色质核边聚。部分线粒体肿胀，基质明显变淡，嵴排列紊乱，或部分嵴消失。
三、血浆及心肌组织中CGRP水平的变化：
实验结果(见表1)显示心肌顿抑时血浆CGRP水平显著高于对照组(P<0.01)；而心肌组织中CGRP含量(0.231±0.172 pmol/g)则显著低于对照组(0.299±0.229 pmol/g)(P<0.05)。相关分析表明，心肌组织CGRP含量与血浆中的CGRP水平呈显著负相关(r＝-0.7952，P<0.01)。
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表1 大鼠心肌顿抑时血浆及心肌组织中CGRP的变化
Tab 1 Changes of CGRP levels in blood and myocardium
in rats with myocardial stunning(
±s，n=11) GroupBlood(pg/mL)
Myocardium(pmol/g)
Control
227.3±181.1
0.299±0.229
, 百拇医药
Myocardial stunning
520.4±480.6**
0.231±0.172*
*P<0.05，**P<0.01，vs control group讨 论
实验结果显示，大鼠冠脉结扎15 min再灌注2 h可引起心功能下降，而且即使恢复再灌注，2 h内心功能也不能完全恢复；注射异丙肾上腺素可显著改善再灌注2h时的心肌功能。心肌酶学及组织学检查证实，缺血心肌组织除线粒体轻度受损外，无不可逆心肌损害的证据。符合心肌顿抑条件，说明模型建立是成功的。
实验发现，心肌顿抑时血浆中CGRP水平明显增高，而心肌组织中CGRP含量却显著少于对照组；血浆与心肌组织中CGRP含量之间呈显著负相关。本实验室研究还发现顿抑心肌组织中CGRP免疫反应神经纤维数量显著减少[6]，因此作者推测可能由于缺血等刺激促使CGRP从外周神经释放，引起血浆CGRP浓度升高，而心肌组织中CGRP神经末梢释放CGRP增多，心肌组织CGRP含量降低。虽然心肌顿抑时血浆CGRP含量明显增高，但并未观察到CGRP的心血管效应。其原因可能是由于用免疫学方法检测CGRP时，不能区分α-CGRP和β-CGRP；同时，抗体还可与CGRP的其它形式发生交叉反应，如CGRP的前提，二聚体或其降解片段等。在大鼠实验中已证实[7]，血浆中的CGRP有两个来源：外周神经是其基本来源，甲状腺C细胞可能是另一个来源。体内CGRP主要分布于神经系统，尤以脊髓中含量最高。心肌顿抑时检测到的血浆CGRP升高可能主要来源于心血管以外的组织，其中可能还包含许多无活性形式；而且心肌组织本身CGRP含量减少，故不能观察到CGRP有益的心血管效应。
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有报道认为，大鼠缺血/再灌注损伤时，血浆及心肌组织内皮素-1(ET-1)含量明显增加。增加的内皮素可直接作用于心肌细胞，促进钙内流和胞内贮存钙释放，导致细胞内钙超载；抑制心肌能量代谢，诱发或加重细胞内钙超载；促进心肌、血管平滑肌合成、释放血管紧张素Ⅱ，而血管紧张素Ⅱ又可作用于血管或心内膜的内皮细胞，促进ET mRNA表达，增加ET释放；还可通过其血流动力学和(或)细胞机制促进组织细胞脂质过氧化损伤，而脂质过氧化又促进内皮素的大量释放，从而参与了心脏缺血/再灌注损伤的发病过程[8]。CGRP具有扩张冠状血管、改善心肌血流及正性肌力作用，抑制血管平滑肌细胞释放ET-1，并可拮抗内皮素的作用，对抗交感神经兴奋和RAAS激活所致的血管收缩效应，故作者认为心肌组织中CGRP含量减少可能在心肌顿抑的发生中有一定作用。
[基金项目] 军队九五科研基金资助
[参 考 文 献]
, http://www.100md.com [1] Braunwald E, Kloner RA. The stunned myocardium: prolonged, post ischemic ventricular dysfunction[J]. Circulation, 1983,66(6):1146～1149.
[2] Mulderry PK, Ghatei MA, Rodrigo J, et al. Calcitonin gene-related peptide in cardiovascular tissues of the rat[J]. Neuroscience ,1985,41(3):947～954.
[3] Lappe RW, Slivjak JA, Todt JA, et al. Hemodynamic effects of calcitonin gene-related peptide in conscious rats[J]. Regul Pept,1987,19:307～312.
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[4] Saito A, Kimura S, Goto K. Calcitonin gene-related peptide as potential neurotransmitter in guinea-pig right atrium[J]. Am J Physiol, 1986,250:H693～H698.
[5] 陈金明，龚肖奇，陈思聪，等.大鼠可逆性心肌缺血后功能障碍致心肌顿抑的模型[J].中国病理生理杂志，1996,12(2):223～224.
[6] 吴宏超，钱学贤，刘宏.顿抑心肌组织CGRP的免疫组织化学研究[J]. 心功能杂志,1999,11(2):77～79.
[7] Emson PC, Zaidi M. Further evidence for the origin of circulating calcitonin gene-related peptide in the rat[J]. J Physiol (Lond),1989, 412:297～308.
[8] 汤 健，唐朝枢主编. 内皮素[M]. 第1版. 北京:北京医科大学北京协和医科大学联合出版社，1994.267～274.
[收稿日期]1998-10-23 [修回日期]1999-05-28, 百拇医药