急性心肌梗死大鼠血清血管内皮生长因子含量的变化
作者：尹瑞兴 冯建章 姚震
单位：尹瑞兴(广西医科大学附一院心血管病研究所，广西 南宁 530021)；冯建章 姚震(广东省心血管病研究所心内科，广东 广州 510100)
关键词：心肌梗塞；内皮；生长物质；酶连接免疫吸附测定
中国病理生理杂志000108
[摘 要] 目的和方法：探讨急性心肌梗死大鼠模型血清血管内皮生长因子(VEGF)含量的变化及其意义。88只雄性SD大鼠，其中80只结扎左冠状动脉导致心肌梗死，8只开胸但不结扎冠状动脉作对照组。于心肌梗死后1 h，3 h，6 h，12 h，24 h和2 d，3 d， 5 d，7 d，14 d分别从右心房抽取血样品(n=8)。用敏感、特异的酶连接免疫吸附测定法测定血清样品中的VEGF含量。结果：8只假手术对照鼠的血清VEGF浓度为(66.99±17.83) pg/mL。心肌梗死后6 h组血清VEGF水平达到(125.68±28.07) pg/mL(与对照组比P<0.01)，结扎后24 h组达高峰( 240.61±70.63 pg/mL，与对照组比P<0.01)，然后逐渐下降，但术后14 d组仍显著高于对照组(107.64±30.13 pg/mL ，P<0.01)。结论：心肌梗死大鼠血清VEGF水平持续显著升高，可能对心肌梗死后的血管生成起重要作用。
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[中图分类号] R 541 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0030-03
Changes of serum vascular endothelial growth factor levels in a rat model of acute myocardial infarction
YIN Rui-xing， FENG Jian-zhang， YAO Zhen
(Department of Cardiology, Guangdong Provincial Cardiovascular Institute, Guangzhou 510100, China)
[Abstract] AIM and METHODS: To study the changes of serum vascular endothelial growth factor (VEGF) levels in a rat model of acute myocardial infarction (MI) and its significance. Eighty-eight male Sprague-Dawley rats were used in this study. MI was produced by left coronary arterial ligation in 80 animals, and eight rats undergoing thoracotomy but not coronary ligation served as controls (sham).Blood samples were drawn from the right atrium before (sham animals) and 1, 3, 6, 12, 24 hours and 2, 3, 5, 7, 14 days after MI(n=8,respectively). Serum VEGF concentrations were measured by a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay with a rabbit polyclonal antibody specific for VEGF. RESULTS: In 8 sham animals, the concentration of serum VEGF was (66.99±17.83) pg/mL. Six hours after MI, the level of serum VEGF significantly increased to (125.68±28.07)pg/mL (P<0.01 vs sham control), and reached a peak (240.61±70.63 pg/mL, P<0.01 vs sham control) at 24 hours after ligation and then decreased gradually over the remaining 2 weeks. But the level remained significantly elevated for 14 days (107.64±30.31 pg/mL, P<0.01 vs sham control).CONCLUSION: Serum VEGF levels markedly and permanently increase in the rat model of acute MI may play an important role in the angiogenesis associated with MI.
, 百拇医药
[MeSH] Myocardial infarction; Endothelium; Growth substances;Enzyme-linked immunosorbent assay
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),又称血管通透因子(vascular permeability factor, VPF)或促血管素(vasculotropin, VAS)，是分子量为34～46 kDa的糖蛋白, 能特异作用于血管内皮细胞，是一种血管内皮细胞的促有丝分裂剂，对生理和病理性血管生成都有强烈的促进作用。已有资料表明，实验性心肌缺血缺氧和心肌梗死大鼠心肌的VEGF mRNA表达增加[1～4],但心肌梗死大鼠血清VEGF水平的变化及其意义尚未清楚。本文主要观察实验性心肌梗死大鼠血清VEGF含量的变化。
材 料 和 方 法
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一、心肌梗死动物模型的复制：
雄性SD大鼠(中山医科大学实验动物中心提供), 体重250～300 g。用盐酸氯胺酮(80 mg/kg体重, ip)麻醉。在无菌条件下切开气管插管行人工呼吸，取左胸纵切口开胸，暴露心脏，用5～0号缝线缝扎左冠状动脉近端，分层关闭胸腔。抽出胸腔内的气体以恢复负压, 待动物复苏后，除去气管插管，动物继续喂养到实验终点，并肌注青霉素预防感染。假手术对照动物按同样方法进行麻醉及开胸，但不结扎左冠状动脉。
二、样品采集及血清VEGF测定：
大鼠心肌梗死后1 h，3 h，6 h，12 h，24 h和2 d，3 d，5 d，7 d，14 d重新麻醉，记录体表心电图，排除去无ST段弓背往上抬高和(或)异常Q波的动物，然后开胸，迅速从右心房抽取血样品2～3 mL，不抗凝，待血凝后，以3 000 r/min离心10 min，分离血清，置-70℃冰箱内保存待测。每1时点8只动物，共88只(不包括不成功或不符合条件的动物)。血清VEGF水平的测定采用酶连接免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。第一抗体用特异的兔抗VEGF多克隆抗体，其与小鼠，大鼠和人VEGF均有免疫反应。先将酶标板孔依次编号，每孔加入100 μL的样品分析液，然后加入100 μL的标准品或样品，混匀加盖封口，室温下孵育2 h后弃液。用冲洗液冲洗3次(400 μL/次)，各孔加入200 μL的辣根过氧化物酶标记的第二抗体，混匀封口，室温下静置2 h后弃液，再用冲洗液冲洗3次，在各孔中加入底物显色液(200 μL/孔), 混匀，室温下静置25 min后，各孔加入50 μL的反应终止液，混匀。在30 min内用英国DENLEY DRAGON型酶联(标)仪在波长450 nm的条件下，测定各孔的吸光度(A)，即A值。根据所测出的样品孔及平行孔的A值，求出A的均数。依此均数在绘好的标准曲线上，用间插法求出各孔中的VEGF含量，然后再换算出各样品中的VEGF含量(pg/mL)。
, 百拇医药
三、统计处理：
数据以
±s表示，经对数变换后进行方差分析，多组样本均数间的两两比较用q检验法(Newman-Keuls法)。
结 果
假手术对照组的血清VEGF水平为(66.99±17.83) pg/mL。心肌梗死后1 h组血清VEGF水平稍高，但结扎后6 h组才明显高于对照组(125.68±28.07 pg/mL, P<0.01)，24 h组达高峰(240.61±70.63 pg/mL,，与假手术对照组比P<0.01)，以后各时点转低，但心肌梗死后14 d组其含量仍明显高于对照组(107.64±30.13 pg/mL, P<0.01)(图1)。
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Fig 1 Comparison of serum VEGF concentrations in the rat model of acute myocardial infarction with different time courses from 1 hour to 14 days (±s，n=8)
*P<0.01, vs sham, 1, 3 h groups; ▲P<0.05, 12 h vs 2 d, 6 h vs 3 d, 3 h vs 14 d groups
图1 大鼠急性心肌梗塞死后1 h～14 d血清VEGF浓度比较
讨 论
上述结果显示，实验性急性心肌梗死大鼠的血清VEGF水平持续显著升高，于心肌梗死后1 h开始，6 h组显著高于假手术对照组，24 h组达高峰，然后转低，但梗死后14 d组仍显著高于对照组。心肌梗死大鼠血清VEGF水平升高的确切机制尚未清楚，可能与急性冠状动脉闭塞后，心肌细胞广泛严重的缺血缺氧，使心脏的VEGF代偿性合成和分泌增加[1～4]，以及广泛心肌梗死时左室舒张末压升高，室壁张力增加和(或)某些细胞因子如转化生长因子-β等释放并刺激VEGF的表达增加有关[5，6]。此外，VEGFmRNA的表达具有细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞)、组织和器官(心、肾、脑、肺等)广泛分布的特点[7]，因此，心肌梗死时这些组织器官的VEGF表达增加，也可能是其血清浓度升高的原因之一。
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VEGF是迄今所发现的唯一作用于血管内皮细胞的生长因子，它能增加微血管的通透性，刺激血管内皮细胞的增殖，促进血管的生成。此外，VEGF还具有舒张冠状动脉和减轻心肌的缺血再灌注损伤等作用[8]。因此，心肌梗死大鼠血清VEGF水平升高可能具有重要作用，已有资料表明，给心肌缺血或梗死动物模型应用VEGF后，可使缺血区的侧支循环血管数量和血流量显著增加[9]。给肢体缺血的患者导入VEGF基因后，也可以改善局部的血液循环和减轻症状[10]。因此，VEGF可能成为一种有效治疗冠心病的细胞因子。
[基金项目] 广东省医学(卫生厅)科研基金资助(No.A1999048)
[参 考 文 献]
[1] Li J, Brown LF, Hibberd MG, et al. VEGF, flk-1, and flt-1 expression in a rat myocardial infarction model of angiogenesis [J].Am J Physiol, 1996, 270:H1811～H1830.
, 百拇医药
[2] Hashimoto E, Ogita T, Nakaoka T, et al. Rapid induction of vascular endothelial growth factor expresstion by transient ischemia in rat heart [J]. Am J Physiol, 1994, 267:H1948～H1954.
[3] Banai S, Shweiki D, Pinson A, et al. Upregulation of vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischaemia: implications for coronary angiogenesis [J]. Cardiovasc Res, 1994, 28: 1176～1179.
[4] Ladoux A, Frelin C. Hypoxia is a strong inducer of vascular endothelial growth factor mRNA expression in the heart [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1993, 195:1005～1010.
, http://www.100md.com
[5] Li J, Hampton T, Morgan JP, et al. Stretch-induced VEGF expression in the heart [J]. J Clin Invest, 1997, 100: 18～24.
[6] Levy AP, Levy NS, Loscalzo J, et al. Regulation of vascular endothelial growth factor in cardiac myocytes [J]. Circ Res, 1995, 76: 758～766.
[7] Berse B, Brown LF, Van de Water L, et al. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages, and tumors [J]. Mol Biol Cell, 1992, 3: 211～220.
, 百拇医药
[8] Sellke FW, Wang SY, Stamler A, et al. Enhanced microvascular relaxations to VEGF and bFGF in chronically ischemic porcine myocardium [J]. Am J Physiol, 1996, 271: H713～H720.
[9] Banai S, Jaklitsch MT, Shou M, et al. Angiogenic-induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs [J]. Circulation, 1994,89: 2183～2189.
[10] Isner JM, Pieczek A, Schainfeld R, et al. Clinical evidence of angiogenesis following arterial gene transfer of phVEGF165 in patients with ischaemic limb [J]. Lancet, 1996, 348:370～374.
[收稿日期]1998-11-09 [修回日期]1999-04-20, http://www.100md.com
单位：尹瑞兴(广西医科大学附一院心血管病研究所，广西 南宁 530021)；冯建章 姚震(广东省心血管病研究所心内科，广东 广州 510100)
关键词：心肌梗塞；内皮；生长物质；酶连接免疫吸附测定
中国病理生理杂志000108
[摘 要] 目的和方法：探讨急性心肌梗死大鼠模型血清血管内皮生长因子(VEGF)含量的变化及其意义。88只雄性SD大鼠，其中80只结扎左冠状动脉导致心肌梗死，8只开胸但不结扎冠状动脉作对照组。于心肌梗死后1 h，3 h，6 h，12 h，24 h和2 d，3 d， 5 d，7 d，14 d分别从右心房抽取血样品(n=8)。用敏感、特异的酶连接免疫吸附测定法测定血清样品中的VEGF含量。结果：8只假手术对照鼠的血清VEGF浓度为(66.99±17.83) pg/mL。心肌梗死后6 h组血清VEGF水平达到(125.68±28.07) pg/mL(与对照组比P<0.01)，结扎后24 h组达高峰( 240.61±70.63 pg/mL，与对照组比P<0.01)，然后逐渐下降，但术后14 d组仍显著高于对照组(107.64±30.13 pg/mL ，P<0.01)。结论：心肌梗死大鼠血清VEGF水平持续显著升高，可能对心肌梗死后的血管生成起重要作用。
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[中图分类号] R 541 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0030-03
Changes of serum vascular endothelial growth factor levels in a rat model of acute myocardial infarction
YIN Rui-xing， FENG Jian-zhang， YAO Zhen
(Department of Cardiology, Guangdong Provincial Cardiovascular Institute, Guangzhou 510100, China)
[Abstract] AIM and METHODS: To study the changes of serum vascular endothelial growth factor (VEGF) levels in a rat model of acute myocardial infarction (MI) and its significance. Eighty-eight male Sprague-Dawley rats were used in this study. MI was produced by left coronary arterial ligation in 80 animals, and eight rats undergoing thoracotomy but not coronary ligation served as controls (sham).Blood samples were drawn from the right atrium before (sham animals) and 1, 3, 6, 12, 24 hours and 2, 3, 5, 7, 14 days after MI(n=8,respectively). Serum VEGF concentrations were measured by a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay with a rabbit polyclonal antibody specific for VEGF. RESULTS: In 8 sham animals, the concentration of serum VEGF was (66.99±17.83) pg/mL. Six hours after MI, the level of serum VEGF significantly increased to (125.68±28.07)pg/mL (P<0.01 vs sham control), and reached a peak (240.61±70.63 pg/mL, P<0.01 vs sham control) at 24 hours after ligation and then decreased gradually over the remaining 2 weeks. But the level remained significantly elevated for 14 days (107.64±30.31 pg/mL, P<0.01 vs sham control).CONCLUSION: Serum VEGF levels markedly and permanently increase in the rat model of acute MI may play an important role in the angiogenesis associated with MI.
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[MeSH] Myocardial infarction; Endothelium; Growth substances;Enzyme-linked immunosorbent assay
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),又称血管通透因子(vascular permeability factor, VPF)或促血管素(vasculotropin, VAS)，是分子量为34～46 kDa的糖蛋白, 能特异作用于血管内皮细胞，是一种血管内皮细胞的促有丝分裂剂，对生理和病理性血管生成都有强烈的促进作用。已有资料表明，实验性心肌缺血缺氧和心肌梗死大鼠心肌的VEGF mRNA表达增加[1～4],但心肌梗死大鼠血清VEGF水平的变化及其意义尚未清楚。本文主要观察实验性心肌梗死大鼠血清VEGF含量的变化。
材 料 和 方 法
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一、心肌梗死动物模型的复制：
雄性SD大鼠(中山医科大学实验动物中心提供), 体重250～300 g。用盐酸氯胺酮(80 mg/kg体重, ip)麻醉。在无菌条件下切开气管插管行人工呼吸，取左胸纵切口开胸，暴露心脏，用5～0号缝线缝扎左冠状动脉近端，分层关闭胸腔。抽出胸腔内的气体以恢复负压, 待动物复苏后，除去气管插管，动物继续喂养到实验终点，并肌注青霉素预防感染。假手术对照动物按同样方法进行麻醉及开胸，但不结扎左冠状动脉。
二、样品采集及血清VEGF测定：
大鼠心肌梗死后1 h，3 h，6 h，12 h，24 h和2 d，3 d，5 d，7 d，14 d重新麻醉，记录体表心电图，排除去无ST段弓背往上抬高和(或)异常Q波的动物，然后开胸，迅速从右心房抽取血样品2～3 mL，不抗凝，待血凝后，以3 000 r/min离心10 min，分离血清，置-70℃冰箱内保存待测。每1时点8只动物，共88只(不包括不成功或不符合条件的动物)。血清VEGF水平的测定采用酶连接免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。第一抗体用特异的兔抗VEGF多克隆抗体，其与小鼠，大鼠和人VEGF均有免疫反应。先将酶标板孔依次编号，每孔加入100 μL的样品分析液，然后加入100 μL的标准品或样品，混匀加盖封口，室温下孵育2 h后弃液。用冲洗液冲洗3次(400 μL/次)，各孔加入200 μL的辣根过氧化物酶标记的第二抗体，混匀封口，室温下静置2 h后弃液，再用冲洗液冲洗3次，在各孔中加入底物显色液(200 μL/孔), 混匀，室温下静置25 min后，各孔加入50 μL的反应终止液，混匀。在30 min内用英国DENLEY DRAGON型酶联(标)仪在波长450 nm的条件下，测定各孔的吸光度(A)，即A值。根据所测出的样品孔及平行孔的A值，求出A的均数。依此均数在绘好的标准曲线上，用间插法求出各孔中的VEGF含量，然后再换算出各样品中的VEGF含量(pg/mL)。
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三、统计处理：
数据以
±s表示，经对数变换后进行方差分析，多组样本均数间的两两比较用q检验法(Newman-Keuls法)。结 果
假手术对照组的血清VEGF水平为(66.99±17.83) pg/mL。心肌梗死后1 h组血清VEGF水平稍高，但结扎后6 h组才明显高于对照组(125.68±28.07 pg/mL, P<0.01)，24 h组达高峰(240.61±70.63 pg/mL,，与假手术对照组比P<0.01)，以后各时点转低，但心肌梗死后14 d组其含量仍明显高于对照组(107.64±30.13 pg/mL, P<0.01)(图1)。
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Fig 1 Comparison of serum VEGF concentrations in the rat model of acute myocardial infarction with different time courses from 1 hour to 14 days (
±s，n=8)*P<0.01, vs sham, 1, 3 h groups; ▲P<0.05, 12 h vs 2 d, 6 h vs 3 d, 3 h vs 14 d groups
图1 大鼠急性心肌梗塞死后1 h～14 d血清VEGF浓度比较
讨 论
上述结果显示，实验性急性心肌梗死大鼠的血清VEGF水平持续显著升高，于心肌梗死后1 h开始，6 h组显著高于假手术对照组，24 h组达高峰，然后转低，但梗死后14 d组仍显著高于对照组。心肌梗死大鼠血清VEGF水平升高的确切机制尚未清楚，可能与急性冠状动脉闭塞后，心肌细胞广泛严重的缺血缺氧，使心脏的VEGF代偿性合成和分泌增加[1～4]，以及广泛心肌梗死时左室舒张末压升高，室壁张力增加和(或)某些细胞因子如转化生长因子-β等释放并刺激VEGF的表达增加有关[5，6]。此外，VEGFmRNA的表达具有细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞)、组织和器官(心、肾、脑、肺等)广泛分布的特点[7]，因此，心肌梗死时这些组织器官的VEGF表达增加，也可能是其血清浓度升高的原因之一。
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VEGF是迄今所发现的唯一作用于血管内皮细胞的生长因子，它能增加微血管的通透性，刺激血管内皮细胞的增殖，促进血管的生成。此外，VEGF还具有舒张冠状动脉和减轻心肌的缺血再灌注损伤等作用[8]。因此，心肌梗死大鼠血清VEGF水平升高可能具有重要作用，已有资料表明，给心肌缺血或梗死动物模型应用VEGF后，可使缺血区的侧支循环血管数量和血流量显著增加[9]。给肢体缺血的患者导入VEGF基因后，也可以改善局部的血液循环和减轻症状[10]。因此，VEGF可能成为一种有效治疗冠心病的细胞因子。
[基金项目] 广东省医学(卫生厅)科研基金资助(No.A1999048)
[参 考 文 献]
[1] Li J, Brown LF, Hibberd MG, et al. VEGF, flk-1, and flt-1 expression in a rat myocardial infarction model of angiogenesis [J].Am J Physiol, 1996, 270:H1811～H1830.
, 百拇医药
[2] Hashimoto E, Ogita T, Nakaoka T, et al. Rapid induction of vascular endothelial growth factor expresstion by transient ischemia in rat heart [J]. Am J Physiol, 1994, 267:H1948～H1954.
[3] Banai S, Shweiki D, Pinson A, et al. Upregulation of vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischaemia: implications for coronary angiogenesis [J]. Cardiovasc Res, 1994, 28: 1176～1179.
[4] Ladoux A, Frelin C. Hypoxia is a strong inducer of vascular endothelial growth factor mRNA expression in the heart [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1993, 195:1005～1010.
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[5] Li J, Hampton T, Morgan JP, et al. Stretch-induced VEGF expression in the heart [J]. J Clin Invest, 1997, 100: 18～24.
[6] Levy AP, Levy NS, Loscalzo J, et al. Regulation of vascular endothelial growth factor in cardiac myocytes [J]. Circ Res, 1995, 76: 758～766.
[7] Berse B, Brown LF, Van de Water L, et al. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages, and tumors [J]. Mol Biol Cell, 1992, 3: 211～220.
, 百拇医药
[8] Sellke FW, Wang SY, Stamler A, et al. Enhanced microvascular relaxations to VEGF and bFGF in chronically ischemic porcine myocardium [J]. Am J Physiol, 1996, 271: H713～H720.
[9] Banai S, Jaklitsch MT, Shou M, et al. Angiogenic-induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs [J]. Circulation, 1994,89: 2183～2189.
[10] Isner JM, Pieczek A, Schainfeld R, et al. Clinical evidence of angiogenesis following arterial gene transfer of phVEGF165 in patients with ischaemic limb [J]. Lancet, 1996, 348:370～374.
[收稿日期]1998-11-09 [修回日期]1999-04-20, http://www.100md.com