肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ对心肌细胞的细胞间粘附分子-1表达的影响
作者：李祥平 许顶立 贾满盈
单位：(第一军医大学附属南方医院心内科, 广东 广州 510515)
关键词：肿瘤坏死因子；血管紧张素Ⅱ；心肌
中国病理生理杂志000122 [摘 要] 目的：研究肿瘤坏死因子α(TNFα)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对心肌细胞的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的不同影响。方法：运用免疫组化技术和流式细胞仪观察TNFα和AngⅡ对培养的乳鼠心肌细胞ICAM-1表达量的影响。结果：TNFα明显增加心肌细胞ICAM-1表达量，以刺激6 h最明显，随时间作用延长表达量减少。AngⅡ对培养的心肌细胞ICAM-1表达量无显著作用。结论： TNFα是调节心肌细胞ICAM-1表达的重要细胞因子。AngⅡ并没有调节心肌细胞ICAM-1表达的作用。
[中图分类号] Q 786 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号]1000-4718(2000)01-0077-03
[MeSH] Tumor necrosis factor; Angiotensin Ⅱ; Myocardium
细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)在炎症发生及免疫反应中起重要作用，参与中性粒细胞粘附心肌细胞，释放细胞毒的过程，可能是心力衰竭产生和/或恶化主要的病理基础之一[1,2]。研究体内影响ICAM-1表达的因素有重要的临床意义。已有多种研究证实慢性心力衰竭(CHF)时存在着许多细胞因子如TNF-α和肾素-血管紧张素系统的激活，提示细胞因子在心力衰竭产生和/或恶化中可能起重要作用[3]。本研究运用培养的乳鼠心肌细胞观察了肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)对心肌细胞ICAM-1表达的影响。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
(一)材料：DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)购于美国GIBCO公司；TNF-α、Ang Ⅱ购自Sigma公司；ICAM-1单抗(鼠抗人)由本校免疫学教研室车小燕副教授惠赠；荧光标记羊抗鼠抗体(二抗)购于军科院；生物素标记兔抗鼠抗体，过氧化物酶链霉菌抗生物素蛋白购自Dako公司；二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)购自Oncor公司；流式细胞仪(美国Coulter公司)。
(二)心肌细胞原代培养：参照文献介绍的方法进行[4]。新生1～3 d Sprague-Dawley(SD)大鼠(由本院动物所提供)，雌雄兼用，活杀取心室，放入Hanks液中，剪成1～2 mm组织碎块，置组织于0.06%胰蛋白酶溶液中，在37℃水浴中振荡消化20 min，将上层细胞悬液，吸入含10%胎牛血清(FBS)的DME培养基的消毒离心管中混匀，800～1000 r/min离心10 min。离心后吸去上清液，加2 mL培养液混匀，在37℃孵箱中静置3 h，吸出细胞悬液(细胞悬液中心肌细胞比例大于95%)，调整细胞浓度为5×108/L，转入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基的培养瓶中培养。
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(三)免疫组织化学：心肌细胞在含10%FBS的DMEM培养液置37℃孵箱中培养于盖玻片上。48 h后换液备用。分别加入TNF-α(100 U/mL)或血管紧张素Ⅱ(10-6 mol/L)培养12 h。将盖玻片用PBS冲洗干净，放入冷丙酮中固定15 min，PBS冲洗干净。盖玻片用中性树胶固定于载玻片上。而后进行免疫组化鉴定。3%过氧化氢作用5 min，水冲洗，PBS洗5 min×2次。加抗-ICAM-1(一抗1∶200)，4℃冰箱过夜，PBS冲洗5 min×3次。加生物素标记兔抗鼠抗体(二抗1∶400)，37 ℃水浴箱30 min，PBS冲洗5 min×3次。加过氧化物酶链霉菌抗生物素蛋白(三抗1∶400)，37 ℃水浴箱30 min，PBS冲洗5 min×3次。加DAB液显色2～10 min。水冲洗，1%盐酸酒精脱色，脱水透明，中性树胶封片。
(四)应用流式细胞仪进行ICAM-1的检测：心肌细胞生长于培养瓶中，37℃孵箱中培养。48 h后换液备用。在DMEM中分别加入不同浓度的TNF-α(10 U/mL、100 U/mL)或血管紧张素Ⅱ(10-6 mol/L 、10-8 mol/L )刺激6 h、12 h和、24 h。超过12 h者进行补充原浓度刺激剂。 然后，加入0.02 mol/L EDTA 2 mL消化细胞，用含10% FBS的DMEM培养液4 mL中止消化，将消化下来的细胞过适当孔径的筛网除去杂物后，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入抗ICAM-1(鼠抗人)单克隆抗体(20μg/mL)25 μL，混匀细胞，在室温下孵育2 h，用含1% FBS的DMEM培养液洗涤3次后，加入荧光标记的二抗50 μL(羊抗鼠FITC)，在室温下孵育1 h，细胞洗涤3次后加入到0.5 mL的PBS中。立即进行流式细胞仪测定。用流式细胞仪检测ICAM-1的荧光强度反映心肌细胞ICAM-1的表达量。实验重复4次。
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(五)统计处理：计量资料用均数±标准差表示，统计学处理采用未配对t检验。
结 果
(一)免疫组化结果：应用免疫组化技术显示，AngⅡ对培养心肌细胞ICAM-1表达无明显促进作用，而应用TNFα(100 U/mL)则明显刺激培养心肌细胞ICAM-1的表达(图1)，但用此方法进行半定量分析比较困难，干扰因素较大。
(二)流式细胞仪检测结果：应用流式细胞仪荧光强度检测发现TNF-α无论是10 U/mL或是100 U/mL浓度均可明显增加心肌细胞ICAM-1的表达，随剂量增加ICAM-1表达量成倍增加。剂量从10 U/mL增加到100 U/mL，当作用时间为6 h、12 h、24 h时，ICAM-1表达量分别增加21.7%、16.0%和12.7%；从时间变化看，以刺激6 h表达最明显，随作用时间延长表达量减少(表1)。而AngⅡ对ICAM-1表达量无显著影响。
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讨 论
细胞间粘附分子-1(ICAM-1)是一种分子量为76?000～114?000的细胞表面粘附分子，为单链跨膜糖蛋白。属于免疫球蛋白超基因家族。其在血管内皮表达最强。ICAM-1可与多种细胞表面成分结合，包括LFA-1(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)及P150/95(CD11c/CD18)。ICAM-1分布十分广泛，包括各种上皮细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞、单核细胞和淋巴细胞等[1]。在细胞因子等的作用下，通过ICAM-1与LFA-1结合，可召募中性粒细胞至炎症或免疫反应部位，促进中性粒细胞的粘附。在炎症发生及免疫反应中起重要作用[2,4]。
Fig 1 Immunohistochemistry of ICAM-1 in cardiac myocytes
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by TNF-α and Ang Ⅱ stimulation (×400)
A: Base control, B: Ang II, C: TNFα
图1 心肌细胞的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的免疫组化结果(×400)
表1 肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ对心肌细胞的细胞间粘附分子-1表达的不同影响
Tab 1 Effect of TNF-α and Ang Ⅱ on ICAM-1 expression in cardiac myocytes (
±s,n=4) Treatment
6 h
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12 h
24 h
Base control
3.50±0.22
2.03±0.10
2.15±0.13
AngⅡ (10-8 mol/L)
4.40±0.32
3.28±0.27
3.30±0.19
AngⅡ (10-6 mol/L)
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5.10±0.66
3.35±0.25
3.42±0.26
TNF-α(10 U/mL)
22.30±2.83**
16.45±1.91**
9.83±1.08**
TNF-α(100 U/mL)
27.13±2.92**
19.08±2.10**
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11.08±1.37**
*P<0.05,* *P<0.01,vs base control; Data are the fluorescence intensity values
文献报道，多种因素可以影响ICAM-1的表达。一些细胞因子尤其是TNF-α，IFN-γ，IGF-1，IL-1,IL-6，LPS和PMA等可促进上皮细胞和血管平滑肌细胞等细胞ICAM-1的表达[1,5]。其中TNF-α的作用尤其引人注目。在体外条件下，TNF-α可诱导人冠状动脉平滑肌细胞、主动脉平滑肌细胞、肺动脉平滑肌细胞和主动脉内皮细胞ICAM-1的表达[6]。本实验的结果表明，在培养的心肌细胞ICAM-1呈低表达，TNF-α可诱导心肌细胞表达ICAM-1增加，和文献报道的结果相一致[2，4]。已有多种研究证实CHF时存在着肾素-血管紧张素系统和许多细胞因子的激活[3]。有学者报告，血管紧张素Ⅱ可诱导人冠状动脉内皮细胞E-选择素的表达轻度增加，并不影响ICAM-1及VCAM-1的表达[5]。但血管紧张素Ⅱ对心肌细胞ICAM-1表达的影响尚不清楚，本实验证实AngⅡ并不刺激心肌细胞ICAM-1表达的增加。提示心肌细胞ICAM-1表达的刺激因素主要是炎性细胞因子如TNF-α的激活，AngⅡ对心肌细胞ICAM-1的表达并不直接起调节作用。
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心脏是一个产生TNF-α的器官，CHF时心肌组织TNF-α升高，可溶性TNF-α及TNF-α受体升高[6]。提示TNF-α在CHF的进程中可能起重要作用，尽管机制有许多方面，但TNF-α刺激心肌细胞ICAM-1表达可能是其中重要的一环。本实验结果提示阻断TNF-α刺激的心肌细胞ICAM-1蛋白的表达可能为防止心力衰竭进程的重要靶目标，有着重要临床指导意义，有必要进一步深入研究。
参 考 文 献
[1] Dustin ML, Rothlein R, Bahn AK, et al. Induction by IL-1 and IFN-γ. Tissue distribution, biochemistry and function of a natural adherence molecule (ICAM-1) [J]. J Immunol , 1986, 137: 245～254.
, 百拇医药
[2] Smith CW, Entman ML, Lane CL, et al. Adherence of neutrophils to canine cardiac myocytes in vitro is dependent on intercellular adhesion molecule-1 [J]. J Clin Invest , 1991, 88:1216～1223.
[3] Levine B, Kalan J, Mayer L, et al. Elevated circulating levels of tumour necrosis factor in severe chronic heart failure [J]. N Engl J Med, 1990, 323:236～241.
[4] Ikeda U, Ikeda M, Kano S, Shimada K. Neutrophil adherence to rat cardiac myocyte by proinflammatory cytokines [J]. J Cardiovasc Pharmacol, 1994;23:647～652.
, 百拇医药
[5] Grafe M, Auch-Schwelk W, Zakrzewicz A, et al. Angiotensin II-induced leukocyte adhesion on humancoronary endothelial cells is mediated by E-selectin [J]. Circ Res, 1997, 81:804～811.
[6] Torre-Amione G, Kapadia S, Lee J, et al. Tumor necrosis factor-alpha and tumor necrosis factor receptors in the failing human heart [J]. Circulation, 1996, 93:704～711.
[收稿日期] 1999-07-21 [修回日期] 1999-10-07, http://www.100md.com
单位：(第一军医大学附属南方医院心内科, 广东 广州 510515)
关键词：肿瘤坏死因子；血管紧张素Ⅱ；心肌
中国病理生理杂志000122 [摘 要] 目的：研究肿瘤坏死因子α(TNFα)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对心肌细胞的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的不同影响。方法：运用免疫组化技术和流式细胞仪观察TNFα和AngⅡ对培养的乳鼠心肌细胞ICAM-1表达量的影响。结果：TNFα明显增加心肌细胞ICAM-1表达量，以刺激6 h最明显，随时间作用延长表达量减少。AngⅡ对培养的心肌细胞ICAM-1表达量无显著作用。结论： TNFα是调节心肌细胞ICAM-1表达的重要细胞因子。AngⅡ并没有调节心肌细胞ICAM-1表达的作用。
[中图分类号] Q 786 [文献标识码] A
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[文章编号]1000-4718(2000)01-0077-03
[MeSH] Tumor necrosis factor; Angiotensin Ⅱ; Myocardium
细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)在炎症发生及免疫反应中起重要作用，参与中性粒细胞粘附心肌细胞，释放细胞毒的过程，可能是心力衰竭产生和/或恶化主要的病理基础之一[1,2]。研究体内影响ICAM-1表达的因素有重要的临床意义。已有多种研究证实慢性心力衰竭(CHF)时存在着许多细胞因子如TNF-α和肾素-血管紧张素系统的激活，提示细胞因子在心力衰竭产生和/或恶化中可能起重要作用[3]。本研究运用培养的乳鼠心肌细胞观察了肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)对心肌细胞ICAM-1表达的影响。
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材 料 和 方 法
(一)材料：DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)购于美国GIBCO公司；TNF-α、Ang Ⅱ购自Sigma公司；ICAM-1单抗(鼠抗人)由本校免疫学教研室车小燕副教授惠赠；荧光标记羊抗鼠抗体(二抗)购于军科院；生物素标记兔抗鼠抗体，过氧化物酶链霉菌抗生物素蛋白购自Dako公司；二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)购自Oncor公司；流式细胞仪(美国Coulter公司)。
(二)心肌细胞原代培养：参照文献介绍的方法进行[4]。新生1～3 d Sprague-Dawley(SD)大鼠(由本院动物所提供)，雌雄兼用，活杀取心室，放入Hanks液中，剪成1～2 mm组织碎块，置组织于0.06%胰蛋白酶溶液中，在37℃水浴中振荡消化20 min，将上层细胞悬液，吸入含10%胎牛血清(FBS)的DME培养基的消毒离心管中混匀，800～1000 r/min离心10 min。离心后吸去上清液，加2 mL培养液混匀，在37℃孵箱中静置3 h，吸出细胞悬液(细胞悬液中心肌细胞比例大于95%)，调整细胞浓度为5×108/L，转入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基的培养瓶中培养。
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(三)免疫组织化学：心肌细胞在含10%FBS的DMEM培养液置37℃孵箱中培养于盖玻片上。48 h后换液备用。分别加入TNF-α(100 U/mL)或血管紧张素Ⅱ(10-6 mol/L)培养12 h。将盖玻片用PBS冲洗干净，放入冷丙酮中固定15 min，PBS冲洗干净。盖玻片用中性树胶固定于载玻片上。而后进行免疫组化鉴定。3%过氧化氢作用5 min，水冲洗，PBS洗5 min×2次。加抗-ICAM-1(一抗1∶200)，4℃冰箱过夜，PBS冲洗5 min×3次。加生物素标记兔抗鼠抗体(二抗1∶400)，37 ℃水浴箱30 min，PBS冲洗5 min×3次。加过氧化物酶链霉菌抗生物素蛋白(三抗1∶400)，37 ℃水浴箱30 min，PBS冲洗5 min×3次。加DAB液显色2～10 min。水冲洗，1%盐酸酒精脱色，脱水透明，中性树胶封片。
(四)应用流式细胞仪进行ICAM-1的检测：心肌细胞生长于培养瓶中，37℃孵箱中培养。48 h后换液备用。在DMEM中分别加入不同浓度的TNF-α(10 U/mL、100 U/mL)或血管紧张素Ⅱ(10-6 mol/L 、10-8 mol/L )刺激6 h、12 h和、24 h。超过12 h者进行补充原浓度刺激剂。 然后，加入0.02 mol/L EDTA 2 mL消化细胞，用含10% FBS的DMEM培养液4 mL中止消化，将消化下来的细胞过适当孔径的筛网除去杂物后，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入抗ICAM-1(鼠抗人)单克隆抗体(20μg/mL)25 μL，混匀细胞，在室温下孵育2 h，用含1% FBS的DMEM培养液洗涤3次后，加入荧光标记的二抗50 μL(羊抗鼠FITC)，在室温下孵育1 h，细胞洗涤3次后加入到0.5 mL的PBS中。立即进行流式细胞仪测定。用流式细胞仪检测ICAM-1的荧光强度反映心肌细胞ICAM-1的表达量。实验重复4次。
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(五)统计处理：计量资料用均数±标准差表示，统计学处理采用未配对t检验。
结 果
(一)免疫组化结果：应用免疫组化技术显示，AngⅡ对培养心肌细胞ICAM-1表达无明显促进作用，而应用TNFα(100 U/mL)则明显刺激培养心肌细胞ICAM-1的表达(图1)，但用此方法进行半定量分析比较困难，干扰因素较大。
(二)流式细胞仪检测结果：应用流式细胞仪荧光强度检测发现TNF-α无论是10 U/mL或是100 U/mL浓度均可明显增加心肌细胞ICAM-1的表达，随剂量增加ICAM-1表达量成倍增加。剂量从10 U/mL增加到100 U/mL，当作用时间为6 h、12 h、24 h时，ICAM-1表达量分别增加21.7%、16.0%和12.7%；从时间变化看，以刺激6 h表达最明显，随作用时间延长表达量减少(表1)。而AngⅡ对ICAM-1表达量无显著影响。
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讨 论
细胞间粘附分子-1(ICAM-1)是一种分子量为76?000～114?000的细胞表面粘附分子，为单链跨膜糖蛋白。属于免疫球蛋白超基因家族。其在血管内皮表达最强。ICAM-1可与多种细胞表面成分结合，包括LFA-1(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)及P150/95(CD11c/CD18)。ICAM-1分布十分广泛，包括各种上皮细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞、单核细胞和淋巴细胞等[1]。在细胞因子等的作用下，通过ICAM-1与LFA-1结合，可召募中性粒细胞至炎症或免疫反应部位，促进中性粒细胞的粘附。在炎症发生及免疫反应中起重要作用[2,4]。
Fig 1 Immunohistochemistry of ICAM-1 in cardiac myocytes
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by TNF-α and Ang Ⅱ stimulation (×400)
A: Base control, B: Ang II, C: TNFα
图1 心肌细胞的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的免疫组化结果(×400)
表1 肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ对心肌细胞的细胞间粘附分子-1表达的不同影响
Tab 1 Effect of TNF-α and Ang Ⅱ on ICAM-1 expression in cardiac myocytes (
±s,n=4) Treatment6 h
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12 h
24 h
Base control
3.50±0.22
2.03±0.10
2.15±0.13
AngⅡ (10-8 mol/L)
4.40±0.32
3.28±0.27
3.30±0.19
AngⅡ (10-6 mol/L)
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5.10±0.66
3.35±0.25
3.42±0.26
TNF-α(10 U/mL)
22.30±2.83**
16.45±1.91**
9.83±1.08**
TNF-α(100 U/mL)
27.13±2.92**
19.08±2.10**
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11.08±1.37**
*P<0.05,* *P<0.01,vs base control; Data are the fluorescence intensity values
文献报道，多种因素可以影响ICAM-1的表达。一些细胞因子尤其是TNF-α，IFN-γ，IGF-1，IL-1,IL-6，LPS和PMA等可促进上皮细胞和血管平滑肌细胞等细胞ICAM-1的表达[1,5]。其中TNF-α的作用尤其引人注目。在体外条件下，TNF-α可诱导人冠状动脉平滑肌细胞、主动脉平滑肌细胞、肺动脉平滑肌细胞和主动脉内皮细胞ICAM-1的表达[6]。本实验的结果表明，在培养的心肌细胞ICAM-1呈低表达，TNF-α可诱导心肌细胞表达ICAM-1增加，和文献报道的结果相一致[2，4]。已有多种研究证实CHF时存在着肾素-血管紧张素系统和许多细胞因子的激活[3]。有学者报告，血管紧张素Ⅱ可诱导人冠状动脉内皮细胞E-选择素的表达轻度增加，并不影响ICAM-1及VCAM-1的表达[5]。但血管紧张素Ⅱ对心肌细胞ICAM-1表达的影响尚不清楚，本实验证实AngⅡ并不刺激心肌细胞ICAM-1表达的增加。提示心肌细胞ICAM-1表达的刺激因素主要是炎性细胞因子如TNF-α的激活，AngⅡ对心肌细胞ICAM-1的表达并不直接起调节作用。
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心脏是一个产生TNF-α的器官，CHF时心肌组织TNF-α升高，可溶性TNF-α及TNF-α受体升高[6]。提示TNF-α在CHF的进程中可能起重要作用，尽管机制有许多方面，但TNF-α刺激心肌细胞ICAM-1表达可能是其中重要的一环。本实验结果提示阻断TNF-α刺激的心肌细胞ICAM-1蛋白的表达可能为防止心力衰竭进程的重要靶目标，有着重要临床指导意义，有必要进一步深入研究。
参 考 文 献
[1] Dustin ML, Rothlein R, Bahn AK, et al. Induction by IL-1 and IFN-γ. Tissue distribution, biochemistry and function of a natural adherence molecule (ICAM-1) [J]. J Immunol , 1986, 137: 245～254.
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[2] Smith CW, Entman ML, Lane CL, et al. Adherence of neutrophils to canine cardiac myocytes in vitro is dependent on intercellular adhesion molecule-1 [J]. J Clin Invest , 1991, 88:1216～1223.
[3] Levine B, Kalan J, Mayer L, et al. Elevated circulating levels of tumour necrosis factor in severe chronic heart failure [J]. N Engl J Med, 1990, 323:236～241.
[4] Ikeda U, Ikeda M, Kano S, Shimada K. Neutrophil adherence to rat cardiac myocyte by proinflammatory cytokines [J]. J Cardiovasc Pharmacol, 1994;23:647～652.
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[5] Grafe M, Auch-Schwelk W, Zakrzewicz A, et al. Angiotensin II-induced leukocyte adhesion on humancoronary endothelial cells is mediated by E-selectin [J]. Circ Res, 1997, 81:804～811.
[6] Torre-Amione G, Kapadia S, Lee J, et al. Tumor necrosis factor-alpha and tumor necrosis factor receptors in the failing human heart [J]. Circulation, 1996, 93:704～711.
[收稿日期] 1999-07-21 [修回日期] 1999-10-07, http://www.100md.com