一氧化碳对大鼠血管平滑肌细胞低氧性增殖反应的作用
作者：王关嵩 钱桂生 杨晓静 陈维中
单位：(第三军医大学新桥医院呼吸病研究所，重庆 400037)
关键词：一氧化碳；低氧；肌，平滑，血管； 生长
中国病理生理杂志000206
[摘 要] 目的：观察低氧时大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)受血管舒张因子一氧化碳的作用。方法：随机分为常氧组、低氧组(1% O2+5% CO2+94% N2)、一氧化碳组(3% CO+5% CO2+92% N2)，采用流式细胞仪、增殖细胞核抗原(PCNA)、[3H]-胸腺嘧啶([3H]-TdR)摄取量，检测PASMC增生的情况。结果：(1)流式细胞仪检测低氧组PASMC G2/M期细胞比例明显增多(P<0.01)，G0/G1期细胞比例明显减少(P<0.01)，CO组与常氧组的PASMC各期细胞数差异不显著(P>0.05)。(2)PCNA免疫组化染色，低氧组PASMC细胞核阳性反应颗粒明显增加，而CO组为弱阳性。(3)[3H]-TdR的摄取量，低氧组可明显促进PASMC摄取[3H]-TdR(P<0.05),CO组与常氧组比没有明显差异(P>0.05)。结论：低氧可以促进PASMC的增殖，而CO可以部分抑制低氧对PASMC的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] Q253 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)02-0117-03
Effect of carbon monoxide on hypoxic proliferation of rat pulmonary arterial smooth muscle cell
WANG Guan-song， QIAN Gui-sheng， YANG Xiao-jing, CHEN Wei-zhong
(Institute of Respiratory Disease, Xingiao Hosptial, Third Military Medical University, Chongqing 400037，China)
, 百拇医药 [Abstract] AIM：To explore the effect of carbon monoxide (CO) on hypoxic proliferation of rat pulmonary arterial smooth muscle cell(PASMC). METHODS:Rats were randomly divided into four groups, including: (1)N:Normoxia group (21% O2); (2)H:Hypoxia group (1% O2); (3)CO+H：CO+hypoxia group (3% CO+1% O2),tested by immunocytochemical analysis,[3H]-TdR incorporation and flow cytometry (FCM). RESULTS: (1)Flow cytometric DNA analysis revealed that hypoxia induced significantly enhancement of G2/M phase and decreased G0/G1 phase of PASMC (P<0.01).The quantities of G2/M phase or G0/G1 phase in CO+H was about equal to that in N. (2) Immunocytochemical reaction of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in H of PASMC was more stronger than that in N or CO+H. The reaction of PASMC in CO+H was similar to that in N. (3)[3H]-TdR incorporation was increased gradually at the end of 12 h in hypoxia and then significanlty promoted at the end of 24 h in hypoxia.But [3H]-TdR incorporation in CO+H was not much enhancedt. (4)α-actin and muscle fiber was decreased in H, but wasn't changed in CO+H. CONCLUSION: Hypoxia may stimulate PASMC and promote proliferation of PASMC indirectly, and low density(3%) carbon monoxide can partly offset the action of hypoxia effectively.
, http://www.100md.com
[MeSH] Carbon monoxide； Anoxia; Muscle,smooth,vascular; Growth
慢性低氧肺动脉高压经过多年的研究，已知低氧导致肺动脉中膜的平滑肌细胞的异常增生，从而使中膜变厚，管腔狭窄。临床上慢性阻塞性肺病发展过程中常常出现慢性低氧性肺动脉高压，血管舒张因子一氧化氮(nitric oxide,NO)经过多年的基础研究一直认为其有舒张血管平滑肌细胞的作用，目前国内外已有把NO应用于临床治疗肺动脉高压、支气管哮喘等疾病的报告[1～3]。实际上，另一种血管舒张因子-小分子一氧化碳(carbon monoxide,CO)虽然早为人们作为“煤气中毒”的元凶而熟知，但近几年来的研究表明[4]，CO可能是一种新的神经递质，也可能是血管平滑肌的舒张剂。本实验通过培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell, PASMC)，观察持续低浓度CO对低氧条件下PASMC的作用。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、主要试剂
DEME培养基(Gibco,USA)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)单克隆抗体、SM-α actin和S-P免疫组织化学染色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，[3H]-TdR(中国原子能科学研究同位素研究所)，1% O2+5% CO2+94% N2气体及3% CO+5% CO2+92% N2气体(重庆仪表九厂)，CO自动监测报警仪(中国煤碳科学院重庆分院)。
二、PASMC培养
采用贴块法培养PASMC[5]。
, 百拇医药
三、PCNA和α-actin的测定
用S-P试剂盒进行免疫组织化学常规操作，结果用真彩色医学图像分析系统(空军总医院CMIA*S007)测定其积分光密度值(IOD)，作为PCNA的相对含量。
四、[3H]-胸苷嘧啶([3H]-TdR)摄取量的检测
按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，长成层后换为1%小牛血清的M199培养液再培养12 h，分常氧、低氧组(12 h,24 h)和CO组，n=8，最后6 h加入[3H]-TdR(3.7×104 Bq/mL)用β-液体闪烁计数仪(Back β LKB-1217，芬兰)测dpm，间接推定[3H]-TdR量。
五、细胞周期和细胞总蛋白的测定
, http://www.100md.com
用流式细胞仪(FACstar,Becton Dickinson公司，USA)480 nm的红色荧光测定常氧、低氧24 h和CO组的细胞周期DNA含量。用FITC染色后用绿色荧光测蛋白质含量。
六、统计处理
所得数据以
±s表示，并作单因素方差分析，FLSD显著性检验。流式细胞仪的数据采用总体率假设检验。
结 果
一、CO对PASMC的PCNA的作用
低浓度CO组PASMC的PCNA染色为弱阳性，可见较弱的反应颗粒，光密度值为常氧组的1.6倍。缺氧组为常氧组的3.5倍，见图1。
, http://www.100md.com
Fig 1 Immunohistochemical analysis of PCNA content in PASMC(A：Normal group，B：hypoxia group，C：CO group)
A：No detectable positive granules was found on the nucleus in normal condition (S-P×400 hematoxylin staining;
B:Intensive positive granules was found on the nucleus in hypoxia condition (S-P×200)；
C：Week positive granules was found on the nucleus after treated by CO(S-P×200)
, http://www.100md.com
图1 常氧(A)、低氧(B)和CO(C)作用于PASMC的PCNA含量变化
二、CO对RASMC细胞周期及细胞总蛋白的影响
CO+hypoxia组的PASMC中，G2/M期、G0/G1期细胞以及PASMC总蛋白含量，均与常氧组无明显差异，见表1。
表1 CO对PASMC细胞周期和蛋白含量的影响
Tab 1 Effects of CO on PASMC cell cycle
and protein contents(%) Group
G0/G1
, http://www.100md.com
S
G2/M
Protein content
Normal
67.35
18.37
14.28
93.71
Hypoxia
43.33▲▲
13.35▲▲
43.32▲▲
, 百拇医药
52.51
CO+hypoxia
62.17
17.82
20.01
90.52
▲▲P<0.01， vs normal group
三、CO对PASMC的[3H]-TdR摄取量的影响
低氧状态下PASMC [3H]-TdR摄取量的增加(P<0.01)，但CO+Hypoxia组的PASMC [3H]-TdR摄取量没有明显改变。见表2。
, http://www.100md.com
四、PASMC的SM-α actin免疫组织化学染色
常氧组PASMC的SM-α actin染色可见密集阳性反应颗粒，呈棕黄色，低氧组PASMC的反应比较弱，阳性颗粒数很少，但CO+Hypoxia组的PASMC的反应又较强，也有较多的阳性反应颗粒。图象分析表明，常氧24 h的PASMC的SM-α actin染色积分光密度值为低氧组的2.5倍(P<0.01)，为CO+Hypoxia组的1.2倍(P>0.05)。
表2 CO对PASMC [3H]-TdR 掺入量的影响
Tab 2 Effects of hypoxia on PASMC [3H]-TdR
incorporation(dpm/104cells)
, 百拇医药
Normal
Hypoxia
CO+Hypoxia
12 h
9200±256
9350±429
9275±371
24 h
9960±378
11850±1129▲▲
10032±1025
▲▲P<0.01， vs normal group表3 CO对PASMC SM-α actin 含量的影响
, 百拇医药
Tab 3 Immunohistochemical analysis of PASMC
SM-α actin contents(±s) Group
Cell number
IOD
Normal
202±27
88.32±23.35
Hypoxia
375±32
42.29±14.32▲▲
, 百拇医药
CO+Hypoxia
242±41
88.37±35.12
▲▲P<0.01， vs normal group讨 论
CO原是一种简单的两原子有毒气体，近年来的研究表明，外源性CO可以抑制血小板聚集，使离体血管松弛[6]。目前对内源性CO的作用研究较多，认为低氧可能促进PASMC释放内源性CO，而内源性CO又可以抑制PASMC的增生，形成反馈机制。少见外源性CO对PASMC作用的研究。
本实验的结果表明，在低氧的同时再加入低浓度的CO可以使PASMC PCNA的表达减弱，但与常氧情况下比较无差异。G0/M期、G0/G1期的细胞比例接近正常。低氧状态下，PASMC [3H]-TdR的摄取量明显升高，而同时加入低浓度的CO则升高趋势不明显，而且SM-α actin的阳性反应也较弱。显示出低浓度CO可以有效地对抗低氧对PASMC的作用。其可能机制包括，外源性CO可以起到内源性CO的作用，且浓度远大于内源性，故作用比较明显。内源性CO在低氧状态下虽有所表达，但量少不足以对抗低氧的作用，但是由于外源性CO可能抑制了内源性CO的作用，即使低氧的浓度与低浓度CO的浓度相匹配，也难以完全抵销低氧的作用。说明还存在其它机制，如有研究指出CO还可以通过一氧化氮来介导它在生物体内的效应[7]，还能激活可溶性乌苷酸环化酶来调节PASMC[8]。具体作用机制尚需进一步探讨。
, http://www.100md.com
[基金项目] 国家自然科学基金资助(39700057)
[参 考 文 献]
[1] Robert Jr JD,Roberts CT,Jones RC,et al.Continuous nitric oxide inhalation reduces pulmonary arterial structural changes,right ventricular hypertrophy and growth retardation in the hypoxic newborn rat [J].Circ Res,1995,76:215～222.
[2] 张洪玉，庞宝森，郭胜祥，等. 一氧化氮在慢性肺心病治疗中的作用 [J]. 中华医学杂志，1998,78:347～349.
[3] Kharitonov SA,Yates D,Robbins RA,et al.Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients [J].Lancet,1994，343:133～141.
, 百拇医药
[4] Verma A,Hirsch DJ,Glatt CE, et al.Carbon monoxide:a putative neural messenger [J].Science,1993,259:381～389.
[5] 王关嵩，杨晓静，钱桂生，等. 大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨 [J]. 第三军医大学学报，1998,20:348～350.
[6] Brune E,Ullrich V. Inhibition of platelet aggregation by carbon monoxide is mediated by activation of guanylate cyclase [J].Mol Pharmacol,1987,32,497～506.
[7] Ingi T,Cheng J,Ronnett GV. Carbon monoxide: an endogenous modulator of the nitric oxide-cyclic GMP signaling system [J]. Neuron,1996,16:835～842.
[8] Morita T,Perrella MA,Lee ME,et al. Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP [J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:1475～1479.
[收稿日期]1999-02-10 [修回日期]1999-08-26
, 百拇医药
单位：(第三军医大学新桥医院呼吸病研究所，重庆 400037)
关键词：一氧化碳；低氧；肌，平滑，血管； 生长
中国病理生理杂志000206
[摘 要] 目的：观察低氧时大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)受血管舒张因子一氧化碳的作用。方法：随机分为常氧组、低氧组(1% O2+5% CO2+94% N2)、一氧化碳组(3% CO+5% CO2+92% N2)，采用流式细胞仪、增殖细胞核抗原(PCNA)、[3H]-胸腺嘧啶([3H]-TdR)摄取量，检测PASMC增生的情况。结果：(1)流式细胞仪检测低氧组PASMC G2/M期细胞比例明显增多(P<0.01)，G0/G1期细胞比例明显减少(P<0.01)，CO组与常氧组的PASMC各期细胞数差异不显著(P>0.05)。(2)PCNA免疫组化染色，低氧组PASMC细胞核阳性反应颗粒明显增加，而CO组为弱阳性。(3)[3H]-TdR的摄取量，低氧组可明显促进PASMC摄取[3H]-TdR(P<0.05),CO组与常氧组比没有明显差异(P>0.05)。结论：低氧可以促进PASMC的增殖，而CO可以部分抑制低氧对PASMC的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] Q253 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)02-0117-03
Effect of carbon monoxide on hypoxic proliferation of rat pulmonary arterial smooth muscle cell
WANG Guan-song， QIAN Gui-sheng， YANG Xiao-jing, CHEN Wei-zhong
(Institute of Respiratory Disease, Xingiao Hosptial, Third Military Medical University, Chongqing 400037，China)
, 百拇医药 [Abstract] AIM：To explore the effect of carbon monoxide (CO) on hypoxic proliferation of rat pulmonary arterial smooth muscle cell(PASMC). METHODS:Rats were randomly divided into four groups, including: (1)N:Normoxia group (21% O2); (2)H:Hypoxia group (1% O2); (3)CO+H：CO+hypoxia group (3% CO+1% O2),tested by immunocytochemical analysis,[3H]-TdR incorporation and flow cytometry (FCM). RESULTS: (1)Flow cytometric DNA analysis revealed that hypoxia induced significantly enhancement of G2/M phase and decreased G0/G1 phase of PASMC (P<0.01).The quantities of G2/M phase or G0/G1 phase in CO+H was about equal to that in N. (2) Immunocytochemical reaction of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in H of PASMC was more stronger than that in N or CO+H. The reaction of PASMC in CO+H was similar to that in N. (3)[3H]-TdR incorporation was increased gradually at the end of 12 h in hypoxia and then significanlty promoted at the end of 24 h in hypoxia.But [3H]-TdR incorporation in CO+H was not much enhancedt. (4)α-actin and muscle fiber was decreased in H, but wasn't changed in CO+H. CONCLUSION: Hypoxia may stimulate PASMC and promote proliferation of PASMC indirectly, and low density(3%) carbon monoxide can partly offset the action of hypoxia effectively.
, http://www.100md.com
[MeSH] Carbon monoxide； Anoxia; Muscle,smooth,vascular; Growth
慢性低氧肺动脉高压经过多年的研究，已知低氧导致肺动脉中膜的平滑肌细胞的异常增生，从而使中膜变厚，管腔狭窄。临床上慢性阻塞性肺病发展过程中常常出现慢性低氧性肺动脉高压，血管舒张因子一氧化氮(nitric oxide,NO)经过多年的基础研究一直认为其有舒张血管平滑肌细胞的作用，目前国内外已有把NO应用于临床治疗肺动脉高压、支气管哮喘等疾病的报告[1～3]。实际上，另一种血管舒张因子-小分子一氧化碳(carbon monoxide,CO)虽然早为人们作为“煤气中毒”的元凶而熟知，但近几年来的研究表明[4]，CO可能是一种新的神经递质，也可能是血管平滑肌的舒张剂。本实验通过培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell, PASMC)，观察持续低浓度CO对低氧条件下PASMC的作用。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、主要试剂
DEME培养基(Gibco,USA)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)单克隆抗体、SM-α actin和S-P免疫组织化学染色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，[3H]-TdR(中国原子能科学研究同位素研究所)，1% O2+5% CO2+94% N2气体及3% CO+5% CO2+92% N2气体(重庆仪表九厂)，CO自动监测报警仪(中国煤碳科学院重庆分院)。
二、PASMC培养
采用贴块法培养PASMC[5]。
, 百拇医药
三、PCNA和α-actin的测定
用S-P试剂盒进行免疫组织化学常规操作，结果用真彩色医学图像分析系统(空军总医院CMIA*S007)测定其积分光密度值(IOD)，作为PCNA的相对含量。
四、[3H]-胸苷嘧啶([3H]-TdR)摄取量的检测
按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，长成层后换为1%小牛血清的M199培养液再培养12 h，分常氧、低氧组(12 h,24 h)和CO组，n=8，最后6 h加入[3H]-TdR(3.7×104 Bq/mL)用β-液体闪烁计数仪(Back β LKB-1217，芬兰)测dpm，间接推定[3H]-TdR量。
五、细胞周期和细胞总蛋白的测定
, http://www.100md.com
用流式细胞仪(FACstar,Becton Dickinson公司，USA)480 nm的红色荧光测定常氧、低氧24 h和CO组的细胞周期DNA含量。用FITC染色后用绿色荧光测蛋白质含量。
六、统计处理
所得数据以
±s表示，并作单因素方差分析，FLSD显著性检验。流式细胞仪的数据采用总体率假设检验。结 果
一、CO对PASMC的PCNA的作用
低浓度CO组PASMC的PCNA染色为弱阳性，可见较弱的反应颗粒，光密度值为常氧组的1.6倍。缺氧组为常氧组的3.5倍，见图1。
, http://www.100md.com
Fig 1 Immunohistochemical analysis of PCNA content in PASMC(A：Normal group，B：hypoxia group，C：CO group)
A：No detectable positive granules was found on the nucleus in normal condition (S-P×400 hematoxylin staining;
B:Intensive positive granules was found on the nucleus in hypoxia condition (S-P×200)；
C：Week positive granules was found on the nucleus after treated by CO(S-P×200)
, http://www.100md.com
图1 常氧(A)、低氧(B)和CO(C)作用于PASMC的PCNA含量变化
二、CO对RASMC细胞周期及细胞总蛋白的影响
CO+hypoxia组的PASMC中，G2/M期、G0/G1期细胞以及PASMC总蛋白含量，均与常氧组无明显差异，见表1。
表1 CO对PASMC细胞周期和蛋白含量的影响
Tab 1 Effects of CO on PASMC cell cycle
and protein contents(%) Group
G0/G1
, http://www.100md.com
S
G2/M
Protein content
Normal
67.35
18.37
14.28
93.71
Hypoxia
43.33▲▲
13.35▲▲
43.32▲▲
, 百拇医药
52.51
CO+hypoxia
62.17
17.82
20.01
90.52
▲▲P<0.01， vs normal group
三、CO对PASMC的[3H]-TdR摄取量的影响
低氧状态下PASMC [3H]-TdR摄取量的增加(P<0.01)，但CO+Hypoxia组的PASMC [3H]-TdR摄取量没有明显改变。见表2。
, http://www.100md.com
四、PASMC的SM-α actin免疫组织化学染色
常氧组PASMC的SM-α actin染色可见密集阳性反应颗粒，呈棕黄色，低氧组PASMC的反应比较弱，阳性颗粒数很少，但CO+Hypoxia组的PASMC的反应又较强，也有较多的阳性反应颗粒。图象分析表明，常氧24 h的PASMC的SM-α actin染色积分光密度值为低氧组的2.5倍(P<0.01)，为CO+Hypoxia组的1.2倍(P>0.05)。
表2 CO对PASMC [3H]-TdR 掺入量的影响
Tab 2 Effects of hypoxia on PASMC [3H]-TdR
incorporation(dpm/104cells)
, 百拇医药
Normal
Hypoxia
CO+Hypoxia
12 h
9200±256
9350±429
9275±371
24 h
9960±378
11850±1129▲▲
10032±1025
▲▲P<0.01， vs normal group表3 CO对PASMC SM-α actin 含量的影响
, 百拇医药
Tab 3 Immunohistochemical analysis of PASMC
SM-α actin contents(
±s) GroupCell number
IOD
Normal
202±27
88.32±23.35
Hypoxia
375±32
42.29±14.32▲▲
, 百拇医药
CO+Hypoxia
242±41
88.37±35.12
▲▲P<0.01， vs normal group讨 论
CO原是一种简单的两原子有毒气体，近年来的研究表明，外源性CO可以抑制血小板聚集，使离体血管松弛[6]。目前对内源性CO的作用研究较多，认为低氧可能促进PASMC释放内源性CO，而内源性CO又可以抑制PASMC的增生，形成反馈机制。少见外源性CO对PASMC作用的研究。
本实验的结果表明，在低氧的同时再加入低浓度的CO可以使PASMC PCNA的表达减弱，但与常氧情况下比较无差异。G0/M期、G0/G1期的细胞比例接近正常。低氧状态下，PASMC [3H]-TdR的摄取量明显升高，而同时加入低浓度的CO则升高趋势不明显，而且SM-α actin的阳性反应也较弱。显示出低浓度CO可以有效地对抗低氧对PASMC的作用。其可能机制包括，外源性CO可以起到内源性CO的作用，且浓度远大于内源性，故作用比较明显。内源性CO在低氧状态下虽有所表达，但量少不足以对抗低氧的作用，但是由于外源性CO可能抑制了内源性CO的作用，即使低氧的浓度与低浓度CO的浓度相匹配，也难以完全抵销低氧的作用。说明还存在其它机制，如有研究指出CO还可以通过一氧化氮来介导它在生物体内的效应[7]，还能激活可溶性乌苷酸环化酶来调节PASMC[8]。具体作用机制尚需进一步探讨。
, http://www.100md.com
[基金项目] 国家自然科学基金资助(39700057)
[参 考 文 献]
[1] Robert Jr JD,Roberts CT,Jones RC,et al.Continuous nitric oxide inhalation reduces pulmonary arterial structural changes,right ventricular hypertrophy and growth retardation in the hypoxic newborn rat [J].Circ Res,1995,76:215～222.
[2] 张洪玉，庞宝森，郭胜祥，等. 一氧化氮在慢性肺心病治疗中的作用 [J]. 中华医学杂志，1998,78:347～349.
[3] Kharitonov SA,Yates D,Robbins RA,et al.Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients [J].Lancet,1994，343:133～141.
, 百拇医药
[4] Verma A,Hirsch DJ,Glatt CE, et al.Carbon monoxide:a putative neural messenger [J].Science,1993,259:381～389.
[5] 王关嵩，杨晓静，钱桂生，等. 大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨 [J]. 第三军医大学学报，1998,20:348～350.
[6] Brune E,Ullrich V. Inhibition of platelet aggregation by carbon monoxide is mediated by activation of guanylate cyclase [J].Mol Pharmacol,1987,32,497～506.
[7] Ingi T,Cheng J,Ronnett GV. Carbon monoxide: an endogenous modulator of the nitric oxide-cyclic GMP signaling system [J]. Neuron,1996,16:835～842.
[8] Morita T,Perrella MA,Lee ME,et al. Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP [J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:1475～1479.
[收稿日期]1999-02-10 [修回日期]1999-08-26
, 百拇医药