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编号:10271679
内源性接触激活系统对单核细胞粘附的影响
http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 2000年第3期
     作者:刘建夏 左剑玲 秦磊 钱海鑫 LIU Jian-ning

    单位:刘建夏 左剑玲 秦磊 钱海鑫(苏州医学院附属第一医院,江苏 苏州 215006);LIU Jian-ning(Vascular Reserch Laboratory, Deaconess Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02215, USA)

    关键词:尿激酶;单核细胞;细胞粘附

    中国病理生理杂志000312

    [摘 要] 目的:研究接触激活系统对尿激酶型纤溶酶原激活物(U-PA)引起单核细胞粘附的影响及它们之间的相互关系。方法:[3H]-TdR标记的U937细胞培养于24孔板,在高分子激肽原(HK/HKa),激肽释放酶(kallikrein,KK),因子Ⅻ(factor Ⅻ)和纤溶酶原(plasminogen)的作用下,观察U937细胞的粘附情况。结果:Hka、KK抑制U-PA引起的单核细胞粘附,因子XⅡ和Plasminogen促进单核细胞粘附。结论:接触激活系统是单核细胞粘附的重要调节因素。
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    [中图分类号] Q461 [文献标识码] A

    [文章编号] 1000-4718(2000)03-0233-04

    Effect of contact system in monocyte adhesion induced by urokinase-type plasminogen activator

    LIU Jian-xia, ZUO Jian-ling, QIN Lei, QIAN Hai-xin

    (The First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006, China)

    LIU Jian-ning
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    (Vascular ReserchLaboratory, Deaconess Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02215, USA)

    [Abstract] AIM:To study the effect of contact system in monocyte adhesion induced by urokinase-type plasminogen activator (U-PA). METHODS:U937 cells were labeled with [3H] thymidine in the culture medium, test reagents were added into the cell suspension in 24-well plates. The counts*min-1 were counted in a liquid scintillation counter. RESULTS:U-PA-induced monocyte adhesion was inhibited by high-molecular-weight kininogen and kallikrein, and promoted by factor Ⅻ and plasminogen. CONCLUSION:these contact system proteins may be important modulators of U-PA-induced monocyte adhesion, a process which is involved in many pathophysiological events.
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    [MeSH] Urokinase; Monocytes; Cell adhesion

    单核细胞粘附参与许多病理生理过程如创口愈合、感染、肿瘤浸润和转移等。尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,U-PA)在单核细胞粘附中起着重要作用,它和U-PA受体结合后,通过cAMP介导的信号传递,引起细胞粘附,从而引发一系列病理生理反应。由于U-PA和内源性接触激活系统中的3种因子激肽释放酶(kallikrein,KK)、高分子量激肽原(high-molecular-weight kininogen,HK/HKa)、十二因子(Ⅻ)及纤溶酶原(plasminogen)与U-PA在功能上密切相关,故本文探讨4种因子对U-PA引起单核细胞粘附的影响。

    材 料 和 方 法

    一、试剂和细胞株
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    人激肽释放酶、HK(HKa)和Ⅻ(Ⅻa)购于Enzyme Research Laboratories(美国);U-PA(MW 54 KDa)购于Green cross(日本);RPMI 1640购于Gibco BRL(美国);氟磷酸二异丙酯(diisopropyl fluorophosphate,DFP)及胎牛血清(fetal calf serum,FCS)购于Sigma(美国),单核细胞株U937购于Type Culture Collection(美国)。酶的底物S2444和S2302购于Kabi(美国)。

    二、U-PA、激肽释放酶、Ⅻa活性灭活

    在室温下,U-PA、激肽释放酶、Ⅻa分别在DFP(5 mmol/L)中孵育2 h,充分透析后用S2444检测U-PA的酶活性,S2302检测激肽释放酶和Ⅻa的酶活性,经DFP处理后,它们的酶活性均消失。

    三、细胞培养和细胞粘附测定
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    单核细胞株U937细胞生长于RPMI 1640培养基中,含10% FCS;青霉素(100 U/mL),链霉素(100μg/mL),二性霉素B(0.25μg/mL),在37℃,5% CO2培养。

    细胞粘附测定按WALTG[1]方法略加改进。U937细胞(1×106/mL)和[3H]-TdR(3.7×104Bq/mL)共同培养24 h,离心收集细胞(350×g,4 min,4℃),用无血清RPMI 1640洗涤3次,用含10% FCS的RPMI 1640重悬细胞(1×106/mL),加入被测试剂后,在24孔板中(300μL/孔)37℃,5% CO2,培养17 h,去上清,用PBS洗涤3次,残留的细胞即为粘附在24孔板上的单核细胞。每孔加入1 mL裂解液(10% glycerol,0.2% sodium dodecyl sulfate,0.2% tritonX-100),每1 mL裂解物加入10 mL液闪液(formula-989 high flash-point cocktail),用液闪仪测定Counts.min-1,单核细胞粘附的程度用每1000个细胞所对应的Counts.min-1值表示。
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    结 果

    一、U-PA增强U937细胞的粘附作用

    按方法所述,U-PA的浓度选择0~5 nmol/L和U937细胞共同培养,发现细胞的粘附作用随U-PA的浓度增高而增强。未发现对照组细胞粘附现象发生(见图1)。用DFP预处理灭活U-PA的酶活性后,U-PA的这种促粘附作用不受影响(见图2B)。

    二、HK抑制U-PA引起的细胞粘附

    HK和HKa是血清中的抗粘附蛋白,其中HKa的作用更强。U937细胞培养在含10% FCS和10 nmol/L U-PA的培养基中,再加人HK(含10% Hka),HK的浓度由0 nmol/L递增至10 nmol/L。图1显示:HKa可抑制U-PA引起的细胞粘附,HKa对细胞的抗粘附作用随着HKa浓度的增高而加强(见图1)。

, 百拇医药     三、激肽释放酶对U-PA引起细胞粘附的影响

    由于HKa的抗粘附作用明显强于HK,而激肽释放酶催化HK转化为HKa,因此我们也探讨激肽释放酶在细胞粘附中的作用。U937细胞培养在含2 nmol/L的U-PA的培养基中,激肽释放酶的浓度范围0~640 nmol/L,结果显示:低浓度的激肽释放酶(200 nmol/L)能轻度增强细胞粘附作用。而高浓度激肽释放酶(400 nmol/L),则起抑制作用(见图2A)。用DFP预处理使激肽释放酶的酶活性被灭活,激肽释放酶抑制作用即消失(见图2B)。

    Fig1 U-PA induced monocyte U937 adhesion and the anti-adhesion effect of Hka

    [3H]-labeld U937 cells at 1×106/mL were incubated with U-PA (0~10 nmol/L) in the absence or the presence of Hka in 24-well plates. The quantity of the adherent cells were measured and expressed in counts.min-1 as ±s,n=3
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    图1 U-PA诱导的单核细胞U937粘附及Hka的抑制作用

    Fig 2 Effect of KK on U-PA-induced monocyte U937 adhesion

    A.[3H]-labeled U937 cells were cultured in a medium containing 2 nmol/L U-PA and KK(0~640 nmol/L). B.[3H]-labeled U937 cells were incubated with (a) control , (b)1nmol/L U-PA, (c)1 nmol/L DFP-U-PA, (d)1 nmol/L U-PA and 400 nmol/L KK, (e)1 nmol/L U-PA and 400 nmol/L DFP-KK. The quantity of the adherent cells were expressed in counts.min-1 as ±s, n=3
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    图2 KK对U-PA诱导的单核细胞U937粘附的影响

    四、因子Ⅻ和纤溶酶原在细胞粘附中的作用

    因子Ⅻ和纤溶酶原具有促单核细胞粘附作用,当因子Ⅻ和纤溶酶原存在时,U-PA促进单核细胞粘附作用明显加强,预先用DFP处理Ⅻ,将其酶活性灭活,不影响其调节作用(见图3)。

    Fig 3 Effects of Ⅻ and plasminogen on U-PA induced monocyte U937 cell adhesion

    [3H]-labeled U937 cells were incubated with (a),(b),(c) 370 nmol/L Ⅻa/Ⅻ/DFP-Ⅻa, (d)1.5 μmol/L plasminogen, (e)2 nmol/L U-PA, (f),(g),(h) 2 nmol/L U-PA and 370 nmol/L Ⅻa/Ⅻ/DFP-Ⅻa , (i)2 nmol/L U-PA and 1.5 μmol/L plasminogen . The quantity of the adherent cells were expressed in cpm as ±s, n=3
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    图3 因子Ⅻ及纤溶酶原对U-PA诱导的单核细胞U937粘附的影响

    讨 论

    已知纤溶和凝血系统之间有密切的关系,U-PA和内源性接触激活系统各因子(Ⅻa,HKa,KK)相互作用,调节凝血和纤溶反应。近年的研究表明,U-PA可诱导单核细胞粘附,该反应参与多种病理生理反应。内源性接触激活系统对U-PA的这种作用有何影响,尚未见报道。我们的实验表明,在体外实验中,内源性接触激活系统3因子(高分子激肽原HK/HKa、激肽释放酶KK、十二因子Ⅻ)和纤溶酶原是调节U-PA诱导的单核细胞粘附的重要因素。HK/HKa及激肽释放酶可下调U-PA诱导的单核细胞粘附,Ⅻ及纤溶酶原可上调U-PA诱导的单核细胞粘附。

    Waltz等[1]报道,U-PA和U-PA受体结合后,通过cAMP介导的信号传导,引起单核细胞粘附,从而触发人体一系列生理和病理反应。在实验中,U-PA经DFP预处理去除酶活性后,其作用不受影响,由此推测,U-PA的作用与酶活性无关。有学者报导,U-PA存在EFG区域,该区域与U-PA受体结合,激发一系列反应[2]
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    在我们实验中,U-PA的浓度1 nmol/L,比人体血浆的浓度高10倍以上,因为在某些病理状态下,如肿瘤转移,炎症,风湿病,细胞表面U-PA和U-PA受体过表达,产生很高的局部浓度[3,4]

    HK/HKa、激肽释放酶与U-PA及其受体之间存在着复杂的相互作用,Colman等[5]报道,U-PA受体有3个结合位点,HKa和其中2个结合,影响U-PA和其受体的结合,从而抑制了U-PA的促粘附作用。激肽释放酶可以激活单链U-PA转变为双链U-PA[6],后者活性更强(约100倍),它和PAI-1快速结合,被细胞吞饮而灭活[7]。高浓度激肽释放酶促进HK→HKa,抑制细胞粘附。在实验中,激肽释放酶的调节作用较为复杂,在低浓度时,表现为轻度的促细胞粘附作用,我们认为可能与其将单链U-PA转变为双链有关。在高浓度时(400 nmol/L以上),它表现为抑制作用为主。我们推测激肽释放酶下调U-PA的粘附作用通过以下2个途径:①KK促进牛血清HK→HKa;②促进单链U-PA→双链U-PA,后者和PAI-1结合而灭活。由于血浆中激肽释放酶的浓度为500~600 nmol/L,因此,激肽释放酶在体内主要表现为抑制作用。用DFP预处理激肽释放酶,其酶活性消失后,对U-PA的调节作用也随之消失,所以激肽释放酶的作用和酶活性有关。
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    Ⅻ、纤溶酶原和U-PA之间也有着复杂的相互作用,Ⅻa可以促使激肽释放酶前体转变为激肽释放酶,后者可使HK→HKa,单链U-PA→双链U-PA,双链U-PA可激活纤溶酶原,从而引发一系列瀑布反应。我们用DFP灭活Ⅻa的活性,并不影响Ⅻa的调节作用。可见,Ⅻa的作用和酶活性无关。Ⅻa和纤溶酶原上调U-PA诱导单核细胞粘附,其作用机制尚不清楚,有待进一步研究。

    总之,接触激活系统和U-PA在体内广泛存在,并且相互影响,在U-PA引起单核细胞粘附过程中,接触激活系统是重要的调节因素。

    [参 考 文 献]

    [1] Waltz DA, Sailor LZ, Chapman HA, et al. Cytokines induce urokinase-depend adhesion of human myeloid cells. A regulatory role for plasminogen activator inhibitors [J]. J Clin Invest, 1993, 91: 1541~1552.
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    [2] Wei Y,Waltz DA, Rao N, et al. Identification of the urokinase receptor as an adhesion receptor for vitronectin [J]. J Biol Chem, 1994, 269: 32380~32388.

    [3] Blasi F. Urokinase and urokinase receptor: a paracrine/autocrine system regulating cell migration and invasiveness [J]. Bioessays,1993, 15: 105~111.

    [4] Jankun J, Merrick HW,Goldblatt PJ. Expression and localization of elements of the plasminogen activation system in benign breast disease and breast cancer [J]. J Cell Biochem, 1993,53:135~144.
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    [5] Colman RW, Schmaier AH. Contact system: A vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes [J]. Blood, 1997,90:3819~3843.

    [6] Ichinose A, Fujikawa K,Suyama T, et al. The activation of prourokinase by plasma kallikrein and its inactivation by thrombin [J].J Biol Chem, 1986, 261: 3486~3488.

    [7] Cubellis MV, Wun TC, Blasi F, et al. Receptor mediated internalization and degradation of urokinase is caused by its specific inhibition PAI-1 [J]. EMBO J, 1990, 9: 1079~1085.

    [收稿日期] 1999-01-06 [修回日期] 1999-09-03, http://www.100md.com