Losartan对神经肽Y诱导血管平滑肌细胞增殖的逆转作用
作者：黄少华 刘建康 陈敏生
单位：黄少华(广州医学院第一附属医院心脏病研究室，广东 广州 510182)；刘建康(组胚教研室)；陈敏生(第三附属医院内科)
关键词：神经肽Y；血管紧张素Ⅱ；受体， 血管紧张素；肌，平滑，血管
中国病理生理杂志000306
[摘 要] 目的：观察神经肽Y(NPY)与血管紧张素受体拮抗剂losartan对体外培养的血管平滑肌细胞(VSMC)中PCNA、PDGF、c-myc癌基因表达的影响，从分子生物学的角度探讨NPY在高血压、动脉粥样硬化发生中的作用和losartan的逆转作用。方法：应用荧光免疫组化定量技术(ACAS570共聚焦激光扫描显微细胞仪)。结果：NPY刺激VSMC增殖，使其PCNA、PDGF和c-myc癌基因的表达明显高于对照组；losartan则可逆转NPY对VSMC增殖的刺激作用，使PCNA、PDGF和c-myc癌基因表达的平均荧光值降低。结论：NPY促进VSMC的增殖，其作用与高血压的发生有关；而losartan对高血压的治疗作用可能与拮抗NPY对VSMC增殖的刺激作用有关。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 253 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0211-03
The stimulating effects of neuropeptide Y on cultured arterial smooth muscle cell proliferation and losartan treatment
HUANG Shao-hua, LIU Jian-kang， CHEN Min-sheng
(Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182， China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To observe expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), platelet derived growth factor (PDGF) and c-myc in cultured vascular smooth muscle cells which is effected by neuropeptide Y (NPY) and losartan (the receptor blocking agent of angiotensin Ⅱ) therefore exploring effects of NPY on the generation of hypertension and its relationship with losartan reverse treatment in molecular biology. METHODS: Applied the method of quantitative immunocytochemistry through ACAS570. RESULTS: 24 hours exposure of vascular smooth muscle cell to NPY caused an increase in expression of PCNA, PDGF and c-myc respectively. But losartan could reverse these expressions by NPY, decreased the expression of PCNA, PDGF and c-myc. CONCLUSION: NPY is closely related to the generation of hypertension. But losartan could reverse these effects of NPY.
, 百拇医药
[MeSH] Neuropeptide Y; Angiotensin Ⅱ; Receptors, angiotensin; Muscle, smooth, vascular
研究资料表明：losartan对高血压心肌肥厚、高血压血管重塑具有良性的治疗效应[1]。有人推测这一作用除了losartan可拮抗血管紧张素Ⅱ受体的作用外，还很可能涉及losartan和神经体液因素中神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)间相互作用及对促进VSMC增殖癌基因的调控。本研究利用体外培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)模型，观察NPY、losartan对体外培养的VSMC中血小板生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、c-myc癌基因表达的影响，从分子生物学的角度探讨NPY在高血压、动脉粥样硬化发生中的作用和losartan的保护作用。
, 百拇医药 材 料 和 方 法
一、血管平滑肌细胞的体外培养
组织贴块法培养血管平滑肌细胞。无菌条件下分离SD大鼠的胸主动脉，剪碎后加入适量含10%胎牛血清的DMEM(GiBco公司产品)培养液，37℃、5% CO2培养箱中静置培养。用光镜和免疫化学方法进行鉴定。选择生长良好的第6～7代VSMC用于实验。
二、实验分组及NPY、losartan条件培养液的配制
实验分为对照组、NPY组、losartan组和NPY+losartan 组。各实验组分别依次加入NPY、losartan条件培养液各1 mL，对照组为无血清DMEM培养液。NPY(NOVA biochem产品,Switzerland)和losartan (MERCK & CO产品)条件培养液均以无血清的DMEM培养液配制，NPY与losartan终浓度分别为10-6mol/L和10-5g/L。
, 百拇医药
三、NPY对VSMC增殖和PDGF和c-myc原癌基因表达的影响及 losartan的逆转作用
选择第6代生长良好的平滑肌细胞，消化传代至96孔培养板上，传代细胞密度为5.0×107/L。细胞经18h的预培养和6h的预处理后，将NPY、losartan条件培养液和无血清DMEM培养液加入实验组和对照组，37℃、5% CO2继续培养24 h。吸去培养液，pH 7.3的PBS洗3次，3%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次。
已固定样品按常规免疫组织化学方法处理。首先，5%正常山羊血清封闭，室温孵育30 min；倾去血清，滴加稀释度为1∶50鼠抗大鼠细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、PDGF和c-myc的单克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品)，4℃冰箱过夜。样品倾去抗体孵育液，PBS洗3次，换加1∶10 FITC荧光标记兔抗鼠抗体(天象人公司产品)，室温孵育40 min后，PBS充分洗板，每待测样品加入20μL PBS后，分别置带电脑激光扫描共焦显微细胞仪(ACAS575UVC型，美国MERIDIAN公司)下,选用40×物镜,7%滤光片,确定激发光波长为488 nm,进入Kinetics-Image Scan程序,预扫描后选定最佳参数,对选定视野扫描并存储所获信息。扫描细胞总数在200个以上。
, http://www.100md.com
四、结果分析
进入Kinetics-Image Analysis程序，调出各次实验存储信息，分析并作综合处理，均数间差异显著性用t检验。结果均以
±s表示。
结 果
一、血管平滑肌细胞鉴定
倒置显微镜下，细胞生长呈典型的“谷与峰”结构特征，α-actin单克隆抗体免疫细胞化学显示95%为阳性VSMC。
二、NPY对VSMC增殖能力和PDGF、c-myc原癌基因表达的影响以及losartan的逆转作用
将免疫荧光显示技术和带电脑激光扫描共焦显微细胞仪的检测技术结合起来可较为准确地定量细胞中核酸和蛋白质的变化，样品中被检测物质的多少是以其检测物质被荧光标记的平均荧光值来表示。NPY组、losartan组、NPY+losartan组和对照组中PCNA、PDGF和c-myc原癌基因表达的平均荧光值变化见表1。与对照组相比，NPY组中PCNA、PDGF和c-myc的平均荧光值均高于对照组、其中以PDGF表达差异最为明显(P<0.01)；Losartan组除PDGF外，PCNA、c-myc癌基因表达的平均荧光值与对照组相比明显降低(P<0.05)。Losartan组与NPY组进行比较， 两者之间显示明显的差异(P<0.05)，而NPY+losartan组与对照组相比，除PDGF外无明显差异(P>0.05)，见表1。
, 百拇医药
表1 NPY刺激平滑肌细胞增殖及对PDGF、c-myc基因表达的影响和losartan的逆转作用
Tab 1 The effects of NPY and losartan on vascular smooth muscle cell proliferation and PDGF, c-myc expressions (±s，n=200) Group
PCNA
PDGF
c-myc
Control
1542.71±200.04
, 百拇医药
815.28±116.48
1620.26±174.58
NPY
1648.56 ±232.71*
1225.46±101.84**
1740.35±205.91*
Losartan
1338.56±232.71*△
828.69 ±127.54△
1528.03±152.14*△
, http://www.100md.com
NPY+losartan
1544.86±256.06
1143.00± 172.19**
1600.37±146.77
*P<0.05,**P<0.01,vs control；△P<0.05，vs NPY讨 论
血管壁平滑肌细胞的异常增殖或肥大是高血压、动脉粥样硬化发病早期血管构型改变的重要的形态学特征，其发生与神经肽Y和血管局部肾素-血管紧张素系统的功能改变密切相关[3，4]。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)对心血管系统功能活动的调节，除对血管的直接作用外，还可刺激交感神经末梢释放肾上腺素，促进醛固酮和抗利尿激素的分泌和释放。而losartan是临床上第一个针对血管紧张素Ⅱ受体、阻断其上述作用的高血压治疗剂[5]。但是，losartan的降压作用是否与拮抗血管局部的神经内分泌因素NPY的作用有关，并直接抑制VSMC的增殖而引起血管壁结构的重塑？目前尚无法确定。
, 百拇医药
实验结果显示：NPY作用下，VSMC中PCNA、PDGF和c-myc癌基因的表达都比对照组有明显增加，其中，以PDGF表达增加的最为明显(P<0.01)。这不仅说明NPY可影响VSMC的增殖，而且NPY对血管功能的调节作用，尤其是对VSMC增殖的影响涉及到癌基因环节的调控。PCNA是细胞核中DNA聚合酶的附属蛋白，其主要生物学作用是促进细胞核中DNA链的合成与延伸[6]；PDGF和原癌基因c-myc则都是重要的核蛋白调控基因，参与细胞的增殖和VSMC由中膜向内膜的迁移[7，8]。实验结果表明NPY通过PCNA、PDGF和原癌基因c-myc基因的介导引起VSMC的增殖。因此，在高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生中，NPY分泌或释放异常，作用于VSMC引起其癌基因过度表达，成为导致VSMC增殖和迁移的重要因素之一。而在losartan的作用下，与对照组相比，仅PCNA和c-myc癌基因表达降低，说明losartan对正常的平滑肌细胞增殖有一定的影响。PDGF不受影响；但同NPY的作用相比，PCNA、PDGF和c-myc癌基因表达均降低表现出一定的差异。在NPY+losartan组，PCNA与c-myc的表达和对照组相比无明显差异，这说明losartan对NPY所诱导的增殖作用是有一定的逆转作用。至于losartan对PDGF的表达未产生影响，这是否与losartan作用浓度(10-5g/L)低于正常人用药的血药浓度有关，还是由于不同浓度的losartan对各种癌基因表达的诱导作用存在着一定的差异，尚有待于进一步研究。
, 百拇医药
综上所述，本实验结果证明：losartan对高血压的治疗作用可能与拮抗NPY对VSMC增殖的刺激作用有关，并涉及癌基因环节的调控。
[基金项目] 广东省自然科学基金资助(980466)
[参 考 文 献]
[1] Bunkenburg B， van Amelsvoort T， Rogg H, et al. Receptor-mediated effects of angiotensin Ⅱ on growth of vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats [J]. Hypertension, 1992 , 20(6): 746～754 .
[2] 吴翠环，任大宏，陈多恩. 神经肽Y对培养的自发性高血压大鼠动脉平滑肌细胞的影响 [J]. 同济医科大学学报，1998，27(1):19～21.
, 百拇医药
[3] 刘建康，邓漪平. 内皮细胞和神经系统间相互作用与动脉粥样硬化 [J]. 中国动脉硬化杂志，1997，5(3)：272～276.
[4] Beck BC, Corson MA. Angiotensin Ⅱsignal transduction in vascular smooth muscle: role of tyrosine kinases [J]. Circ Res, 1997,80(5):607～616.
[5] McCoy R. A new class of antihypertensive: angiotensin Ⅱ receptor antagonists [J]. S D J Med, 1995, 48(9) Sep: 319～320 .
[6] Siitonen SM, Isola JJ, Rantala IS, et al. Intratumor variation in cell proliferation in breast carcinoma as determined by antiproliferating cell nuclear antigen monoclonal antibody and automated image analysis [J]. Am J Clin Pathol, 1993,99: 226～231.
, http://www.100md.com
[7] Edelman ER, Simons M, Sirois MG, et al. C-myc in vasculoproliferative disease [J]. Circ Res,1995,76(2): 176～182.
[8] Lindner V, Giachelli CM, Schwartz SM, et al. A subpopulation of smooth muscle cells in injured rat arteries expresses platelet-derived growth factor-B chain mRNA [J]. Circ Res,1995,76(6):951～957.
[收稿日期]1999-03-18 [修回日期]2000-01-05, 百拇医药
单位：黄少华(广州医学院第一附属医院心脏病研究室，广东 广州 510182)；刘建康(组胚教研室)；陈敏生(第三附属医院内科)
关键词：神经肽Y；血管紧张素Ⅱ；受体， 血管紧张素；肌，平滑，血管
中国病理生理杂志000306
[摘 要] 目的：观察神经肽Y(NPY)与血管紧张素受体拮抗剂losartan对体外培养的血管平滑肌细胞(VSMC)中PCNA、PDGF、c-myc癌基因表达的影响，从分子生物学的角度探讨NPY在高血压、动脉粥样硬化发生中的作用和losartan的逆转作用。方法：应用荧光免疫组化定量技术(ACAS570共聚焦激光扫描显微细胞仪)。结果：NPY刺激VSMC增殖，使其PCNA、PDGF和c-myc癌基因的表达明显高于对照组；losartan则可逆转NPY对VSMC增殖的刺激作用，使PCNA、PDGF和c-myc癌基因表达的平均荧光值降低。结论：NPY促进VSMC的增殖，其作用与高血压的发生有关；而losartan对高血压的治疗作用可能与拮抗NPY对VSMC增殖的刺激作用有关。
, 百拇医药
[中图分类号] Q 253 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0211-03
The stimulating effects of neuropeptide Y on cultured arterial smooth muscle cell proliferation and losartan treatment
HUANG Shao-hua, LIU Jian-kang， CHEN Min-sheng
(Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182， China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To observe expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), platelet derived growth factor (PDGF) and c-myc in cultured vascular smooth muscle cells which is effected by neuropeptide Y (NPY) and losartan (the receptor blocking agent of angiotensin Ⅱ) therefore exploring effects of NPY on the generation of hypertension and its relationship with losartan reverse treatment in molecular biology. METHODS: Applied the method of quantitative immunocytochemistry through ACAS570. RESULTS: 24 hours exposure of vascular smooth muscle cell to NPY caused an increase in expression of PCNA, PDGF and c-myc respectively. But losartan could reverse these expressions by NPY, decreased the expression of PCNA, PDGF and c-myc. CONCLUSION: NPY is closely related to the generation of hypertension. But losartan could reverse these effects of NPY.
, 百拇医药
[MeSH] Neuropeptide Y; Angiotensin Ⅱ; Receptors, angiotensin; Muscle, smooth, vascular
研究资料表明：losartan对高血压心肌肥厚、高血压血管重塑具有良性的治疗效应[1]。有人推测这一作用除了losartan可拮抗血管紧张素Ⅱ受体的作用外，还很可能涉及losartan和神经体液因素中神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)间相互作用及对促进VSMC增殖癌基因的调控。本研究利用体外培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)模型，观察NPY、losartan对体外培养的VSMC中血小板生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、c-myc癌基因表达的影响，从分子生物学的角度探讨NPY在高血压、动脉粥样硬化发生中的作用和losartan的保护作用。
, 百拇医药 材 料 和 方 法
一、血管平滑肌细胞的体外培养
组织贴块法培养血管平滑肌细胞。无菌条件下分离SD大鼠的胸主动脉，剪碎后加入适量含10%胎牛血清的DMEM(GiBco公司产品)培养液，37℃、5% CO2培养箱中静置培养。用光镜和免疫化学方法进行鉴定。选择生长良好的第6～7代VSMC用于实验。
二、实验分组及NPY、losartan条件培养液的配制
实验分为对照组、NPY组、losartan组和NPY+losartan 组。各实验组分别依次加入NPY、losartan条件培养液各1 mL，对照组为无血清DMEM培养液。NPY(NOVA biochem产品,Switzerland)和losartan (MERCK & CO产品)条件培养液均以无血清的DMEM培养液配制，NPY与losartan终浓度分别为10-6mol/L和10-5g/L。
, 百拇医药
三、NPY对VSMC增殖和PDGF和c-myc原癌基因表达的影响及 losartan的逆转作用
选择第6代生长良好的平滑肌细胞，消化传代至96孔培养板上，传代细胞密度为5.0×107/L。细胞经18h的预培养和6h的预处理后，将NPY、losartan条件培养液和无血清DMEM培养液加入实验组和对照组，37℃、5% CO2继续培养24 h。吸去培养液，pH 7.3的PBS洗3次，3%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次。
已固定样品按常规免疫组织化学方法处理。首先，5%正常山羊血清封闭，室温孵育30 min；倾去血清，滴加稀释度为1∶50鼠抗大鼠细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、PDGF和c-myc的单克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品)，4℃冰箱过夜。样品倾去抗体孵育液，PBS洗3次，换加1∶10 FITC荧光标记兔抗鼠抗体(天象人公司产品)，室温孵育40 min后，PBS充分洗板，每待测样品加入20μL PBS后，分别置带电脑激光扫描共焦显微细胞仪(ACAS575UVC型，美国MERIDIAN公司)下,选用40×物镜,7%滤光片,确定激发光波长为488 nm,进入Kinetics-Image Scan程序,预扫描后选定最佳参数,对选定视野扫描并存储所获信息。扫描细胞总数在200个以上。
, http://www.100md.com
四、结果分析
进入Kinetics-Image Analysis程序，调出各次实验存储信息，分析并作综合处理，均数间差异显著性用t检验。结果均以
±s表示。结 果
一、血管平滑肌细胞鉴定
倒置显微镜下，细胞生长呈典型的“谷与峰”结构特征，α-actin单克隆抗体免疫细胞化学显示95%为阳性VSMC。
二、NPY对VSMC增殖能力和PDGF、c-myc原癌基因表达的影响以及losartan的逆转作用
将免疫荧光显示技术和带电脑激光扫描共焦显微细胞仪的检测技术结合起来可较为准确地定量细胞中核酸和蛋白质的变化，样品中被检测物质的多少是以其检测物质被荧光标记的平均荧光值来表示。NPY组、losartan组、NPY+losartan组和对照组中PCNA、PDGF和c-myc原癌基因表达的平均荧光值变化见表1。与对照组相比，NPY组中PCNA、PDGF和c-myc的平均荧光值均高于对照组、其中以PDGF表达差异最为明显(P<0.01)；Losartan组除PDGF外，PCNA、c-myc癌基因表达的平均荧光值与对照组相比明显降低(P<0.05)。Losartan组与NPY组进行比较， 两者之间显示明显的差异(P<0.05)，而NPY+losartan组与对照组相比，除PDGF外无明显差异(P>0.05)，见表1。
, 百拇医药
表1 NPY刺激平滑肌细胞增殖及对PDGF、c-myc基因表达的影响和losartan的逆转作用
Tab 1 The effects of NPY and losartan on vascular smooth muscle cell proliferation and PDGF, c-myc expressions (
±s，n=200) GroupPCNA
PDGF
c-myc
Control
1542.71±200.04
, 百拇医药
815.28±116.48
1620.26±174.58
NPY
1648.56 ±232.71*
1225.46±101.84**
1740.35±205.91*
Losartan
1338.56±232.71*△
828.69 ±127.54△
1528.03±152.14*△
, http://www.100md.com
NPY+losartan
1544.86±256.06
1143.00± 172.19**
1600.37±146.77
*P<0.05,**P<0.01,vs control；△P<0.05，vs NPY讨 论
血管壁平滑肌细胞的异常增殖或肥大是高血压、动脉粥样硬化发病早期血管构型改变的重要的形态学特征，其发生与神经肽Y和血管局部肾素-血管紧张素系统的功能改变密切相关[3，4]。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)对心血管系统功能活动的调节，除对血管的直接作用外，还可刺激交感神经末梢释放肾上腺素，促进醛固酮和抗利尿激素的分泌和释放。而losartan是临床上第一个针对血管紧张素Ⅱ受体、阻断其上述作用的高血压治疗剂[5]。但是，losartan的降压作用是否与拮抗血管局部的神经内分泌因素NPY的作用有关，并直接抑制VSMC的增殖而引起血管壁结构的重塑？目前尚无法确定。
, 百拇医药
实验结果显示：NPY作用下，VSMC中PCNA、PDGF和c-myc癌基因的表达都比对照组有明显增加，其中，以PDGF表达增加的最为明显(P<0.01)。这不仅说明NPY可影响VSMC的增殖，而且NPY对血管功能的调节作用，尤其是对VSMC增殖的影响涉及到癌基因环节的调控。PCNA是细胞核中DNA聚合酶的附属蛋白，其主要生物学作用是促进细胞核中DNA链的合成与延伸[6]；PDGF和原癌基因c-myc则都是重要的核蛋白调控基因，参与细胞的增殖和VSMC由中膜向内膜的迁移[7，8]。实验结果表明NPY通过PCNA、PDGF和原癌基因c-myc基因的介导引起VSMC的增殖。因此，在高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生中，NPY分泌或释放异常，作用于VSMC引起其癌基因过度表达，成为导致VSMC增殖和迁移的重要因素之一。而在losartan的作用下，与对照组相比，仅PCNA和c-myc癌基因表达降低，说明losartan对正常的平滑肌细胞增殖有一定的影响。PDGF不受影响；但同NPY的作用相比，PCNA、PDGF和c-myc癌基因表达均降低表现出一定的差异。在NPY+losartan组，PCNA与c-myc的表达和对照组相比无明显差异，这说明losartan对NPY所诱导的增殖作用是有一定的逆转作用。至于losartan对PDGF的表达未产生影响，这是否与losartan作用浓度(10-5g/L)低于正常人用药的血药浓度有关，还是由于不同浓度的losartan对各种癌基因表达的诱导作用存在着一定的差异，尚有待于进一步研究。
, 百拇医药
综上所述，本实验结果证明：losartan对高血压的治疗作用可能与拮抗NPY对VSMC增殖的刺激作用有关，并涉及癌基因环节的调控。
[基金项目] 广东省自然科学基金资助(980466)
[参 考 文 献]
[1] Bunkenburg B， van Amelsvoort T， Rogg H, et al. Receptor-mediated effects of angiotensin Ⅱ on growth of vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats [J]. Hypertension, 1992 , 20(6): 746～754 .
[2] 吴翠环，任大宏，陈多恩. 神经肽Y对培养的自发性高血压大鼠动脉平滑肌细胞的影响 [J]. 同济医科大学学报，1998，27(1):19～21.
, 百拇医药
[3] 刘建康，邓漪平. 内皮细胞和神经系统间相互作用与动脉粥样硬化 [J]. 中国动脉硬化杂志，1997，5(3)：272～276.
[4] Beck BC, Corson MA. Angiotensin Ⅱsignal transduction in vascular smooth muscle: role of tyrosine kinases [J]. Circ Res, 1997,80(5):607～616.
[5] McCoy R. A new class of antihypertensive: angiotensin Ⅱ receptor antagonists [J]. S D J Med, 1995, 48(9) Sep: 319～320 .
[6] Siitonen SM, Isola JJ, Rantala IS, et al. Intratumor variation in cell proliferation in breast carcinoma as determined by antiproliferating cell nuclear antigen monoclonal antibody and automated image analysis [J]. Am J Clin Pathol, 1993,99: 226～231.
, http://www.100md.com
[7] Edelman ER, Simons M, Sirois MG, et al. C-myc in vasculoproliferative disease [J]. Circ Res,1995,76(2): 176～182.
[8] Lindner V, Giachelli CM, Schwartz SM, et al. A subpopulation of smooth muscle cells in injured rat arteries expresses platelet-derived growth factor-B chain mRNA [J]. Circ Res,1995,76(6):951～957.
[收稿日期]1999-03-18 [修回日期]2000-01-05, 百拇医药