过氧化氢诱导心肌细胞凋亡性和非凋亡性死亡的研究
作者：曹纯章 杨绍娟 卜丽莎 杨同书
单位：曹纯章 杨绍娟 卜丽莎(白求恩医科大学第三临床学院中心研究室，吉林 长春 130031)；杨同书(白求恩医科大学基础医学研究所)
关键词：氧；过氧化氢；心肌；细胞，培养的；细胞死亡
中国病理生理杂志000521
[摘 要] 目的：探讨活性氧过氧化氢(H2O2)对心肌细胞损伤作用。方法：用不同浓度的H2O2作用于新生鼠培养心肌细胞，通过琼脂糖凝胶电泳、Giemsa染色和流式细胞仪等方法观察H2O2对心肌细胞的凋亡性损伤作用，同时检测培养介质中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)等生化指标的改变。结果：5 mmol/L H2O2作用于培养心肌细胞6 h，在琼脂糖凝胶电泳上出现梯状DNA带；Giemsa染色细胞涂片可见到染色体浓聚或边缘化，成新月型聚集在核膜周边，并有凋亡小体的存在；流式细胞仪可检测出亚二倍体峰的出现。结论：H2O2具有浓度和时间依赖关系诱导心肌细胞的凋亡，在低浓度H2O2(<1 mmol/L)导致培养心肌细胞的早期生物化学改变，自由基含量升高，膜通透性增加，同时伴有少量心肌细胞凋亡；而在高浓度H2O2(>10 mmol/L)时会造成培养心肌细胞的坏死性死亡，细胞膜崩塌，脂质过氧化物(MDA)大量产生，LDH大量泄漏，DNA琼脂糖凝胶电泳出现弥散(smear)泳带；5～10 mmol/L H2O2诱导大量心肌细胞凋亡性死亡，同时伴有LDH和MDA含量升高等生物化学的改变。
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[中图分类号] R363.21 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0457-05
Study on apoptotic and nonapoptotic injuries induced by hydrogen peroxide in cardiac myocytes
CAO Chun-zhang, YANG Shao-juan, BU Li-sha, YANG Tong-shu
(Central Laboratory, Third Clinical Teaching College, Norman Bethune University
of Medical Sciences, Changchun 130031, China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To study apoptotic injury induced by reactive oxygen species-hydrogen peroxide (H2O2) on cardiac myocytes.METHODS:Cultured rat neonatal cardiac myocytes were treated with H2O2 of various concentration to observe apoptotic injury of cardiomyocytes by agarose gel electrophoresis, Giemsa-stained smears of cell, and flow cytometry, meanwhile lactate dehydrogenas (LDH) and malondialdehyde(MDA) were determined to assess the effect of H2O2 on lipid peroxidation and permeability of the plasma membrane. RESULTS: 5 mmol/L H2O2 caused cultured cardiomyocytes apoptotic morphological characteristics, including nucleosomal DNA fragmentation in myocytes by agarose gel electrophoresis (DNA ladder), cell shrinkage, nuclear condensation, and chromatin margin by Giemsa-stained cell smears, and aneuploid peak(AP)-apoptotic bodies occurrence by flow cytometry.CONCLUSIONS: H2O2-induced apoptosis in myocytes was a time-and concentration-dependent process. Treatment with low concentration of H2O2(<1 mmol/L) only caused cardiomyocyted early biochemical changes, such as increase of free radicals level and membrane permeability ,which were pro-apoptotic injurious features. High concentration of H2O2 (>10 mmol/L) rapidly induced a necrotic form of death characterized by smeared patterns of DNA digestion on agarose gel electrophoresis and lethal membrane disruption (as measured by LDH release). Exposure of 5～10 mmol/L H2O2 induced cardiomyocytes apoptosis concurrently with biochemical changes of LDH and MDA increase in the medium.
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[MeSH] Oxygen; Hydrogen peroxide; Myocardium; Cells, cultured; Cell death
细胞凋亡是真核生物细胞最基本的生命过程之一，通过激活细胞内源性的自杀机制及时清除生理上不需要的、严重受损的和有潜在危险的细胞。细胞凋亡是一个主动的、由基因指导的细胞死亡过程，它与坏死性细胞死亡可从形态学和生物化学上区分开来。最近的研究表明，心脏疾病时如：缺血/再灌注损伤[1]、心肌梗塞[2]、心力衰竭[3]等人或动物的心脏中，都存在心肌细胞凋亡性死亡，细胞凋亡是心肌细胞死亡的一个重要机制，在心脏重塑、心脏功能障碍进一步发展过程中起重要的作用。但是，人们对心肌细胞凋亡的分子机制仍不清楚。
导致细胞凋亡的许多类型的刺激能造成细胞内活性氧的产生，另外将外源性氧化剂作用于细胞也可诱导细胞凋亡[4]，因此活性氧的产生可能直接参与细胞凋亡过程。过氧化氢(H2O2)是体内氧化代谢的中间产物，同时又是一种活性氧。H2O2的浓度积累达到一定程度会对心肌细胞产生损伤作用。本研究目的是确定H2O2的浓度积累所造成心肌细胞的生物化学改变和细胞形态学所见，以及心肌细胞凋亡产生中，其生物化学改变和细胞凋亡、细胞坏死等细胞形态学所见之间的关系。
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材 料 和 方 法
一、心肌细胞的培养[5]
取新生1～2 d的Wistar大鼠的心室肌组织，研碎，用0.25%的胰蛋白酶分别消化5、15、20 min，将后两次的细胞悬液混合在一起。预培养90 min去掉非心肌细胞，以3×105细胞/mL的密度置入培养器皿中，在36.5℃的CO2(5%)孵箱内进行培养。培养基为MEM(含15%小牛血清)。在培养4 d后细胞达融合状态后施加H2O2损伤因素，作用一定时间后做检测，以不含H2O2的培养心肌细胞作对照。
二、DNA琼脂糖电泳
培养完毕后，将细胞溶解在裂解液中，37℃保温18 h。用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA两次，用乙醇-20℃沉淀DNA，过夜。10 000×g离心30 min，沉淀重新溶解在TE中，用100 μg/mL RNase 10 μL于37℃保温1 h。再用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA，用70%乙醇沉淀DNA。沉淀重新溶解在TE液中，在1.8%琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色，紫外灯下观察。
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三、流式细胞术(flow cytometry)检测心肌细胞凋亡小体
培养的心肌细胞(2×106 cells/mL)用胰蛋白酶消化下来后，用PBS洗涤两次，离心去除细胞碎片。以350目尼龙网过滤去除细胞团块，加入RNase至100 μg/mL，37℃消化30 min，50 μg/mL碘化丙锭(PI)4℃染色1 h，ELITE型流式细胞仪检测，以Multicycle软件分析数据，记录亚二倍体峰(aneuploid peak, AP)，即凋亡小体百分率。
四、LDH活性测定
通过测定培养介质中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的活性来评价H2O2对培养心肌细胞膜的损伤。以不同浓度的H2O2作用不同的时间，取培养液在日立7150生化自动分析仪上测LDH活性。每个浓度的实验做6份重复测试。
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五、MDA含量测定
通过测定细胞及培养介质中的总丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量来评价H2O2对细胞膜中脂质过氧化反应的影响。以1，1，3，3-四甲基丙烷为标准品，岛津RF-540荧光分光光度计测定MDA的含量。
六、以Giemsa染色观察培养心肌细胞形态学的改变 按病理学常规方法涂片，在光镜下观察。
七、统计处理
数据以均数±标准差表示，H2O2作用前后采用方差分析。
结 果
一、DNA-琼脂糖凝胶电泳分析
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不同浓度的H2O2作用于培养心肌细胞一定的时间后，从中提取DNA进行电泳。结果表明，当5～10 mmol/L H2O2作用6 h，染色体核小体间断裂，产生具一定寡核苷酸长度的DNA片段，紫外灯下可见到典型的细胞凋亡DNA梯状带(见图1，第3泳道)。低浓度的H2O2(<1 mmol/L)作用6～24 h，对培养的心肌细胞核均未见有影响，DNA电泳出现高分子量的完整DNA带，无梯形带(见图1，第4泳道)。当高浓度的H2O2(>10 mmol/L)作用于培养心肌细胞2 h，就可造成心肌细胞坏死性死亡，DNA电泳出现典型的弥散(smear)泳带(见图1，第2泳道)。
二、Giemsa染色的细胞形态学分析
形态学分析表明，5～10 mmol/L H2O2作用6 h，Giemsa染色的细胞涂片表现出典型的凋亡形态学改变，细胞体积缩小，细胞核及染色质浓聚，呈半圆型或新月型聚集在核膜周边，染色体断裂成碎片并附着在核膜边缘，并有凋亡小体存在(见图2A)。低浓度的H2O2(<1 mmol/L)作用6 h，形态学表现与正常对照组基本相同，细胞体积变化不大，胞质均匀，细胞核无浓聚、边缘化和碎片化(见图2B)。而高浓度的H2O2(>10 mmol/L)作用2 h，表现出细胞膜破裂，细胞器降解，心肌细胞坏死性死亡。
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Fig 1 Electrophoretic analysis of DNA extracted
from cultured myocytes
(1) DL 15 000 DNA markers; (2) 20 mmol/L H2O2 for 6 h； (3) 5 mmol/L H2O2 for 6 h; (4) 1 mmol/L H2O2 for 24 h； (5) control
图1 培养心肌细胞DNA琼脂糖凝胶电泳
Fig 2 Giemsa-stained preparationof cultured myocytes(A:5mmol/L H2O2 for6h;B:1mmol/L H2O2 for 6h)
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图2培养心肌细胞Giemsa染色
三、流式细胞术分析结果
一定浓度的H2O2作用于培养心肌细胞，反应一定时间后，用流式细胞仪检测凋亡小体百分率及细胞凋亡峰。结果表明，5 mmol/L H2O2作用2,4,6, 12 h产生凋亡小体百分比分别为11.5%、20.1%、35.6%和49.3%。产生的凋亡峰见图3。
另外低浓度的H2O2(<1 mmol/L)作用2 h，产生凋亡小体6.7%，与5 mmol/L H2O2组相比差异显著。当10 mmol/L以上浓度的H2O2作用培养心肌细胞2 h，就可造成心肌细胞坏死，产生大量的细胞碎片。
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四、H2O2对培养心肌细胞膜通透性的影响
不同剂量的H2O2作用于培养心肌细胞不同时间，其膜通透性的改变以LDH从心肌细胞的漏出来衡量。当0.1 mmol/L H2O2作用2 h，心肌细胞酶基本无漏出，5 mmol/L H2O2作用于心肌细胞2 h，膜通透性明显增加，LDH大量由细胞膜漏出[由对照组(47.0±1.2) U/L上升到(143.0±1.7) U/L，P<0.01]。随着H2O2作用浓度和时间的增加，培养液中LDH活性显著升高，差异显著(见图4)。
Fig 3 Aneuploid peak (apoptotic peak) of cultured cardiomyocytes by flow cytometry
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(A: 5 mmol/L H2O2 for 2 h; B: 5 mmol/L H2O2 for 12 h)
图3 流式细胞仪检测培养心肌细胞凋亡峰
Fig 4 Effect of H2O2 on cardiomyocytes (n=6)
图4 不同浓度的H2O2作用不同的时间
培养心肌细胞漏出LDH之比较
表1 不同浓度H2O2作用培养心肌细胞24 h，细胞和介质中的MDA含量比较
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Tab 1 MDA content in the medium and
cardiomyocytes exposed to H2O2 at 24 h (n=6) H2O2(mmol/L)
Time(h)
MDA(nmol/L，
±s)
0
24
0.388±0.145
0.05
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24
0.549±0.061
0.1
24
0.602±0.122*
1.0
24
1.713±0.275**
5.0
24
3.578±0.327**
10
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24
5.710±0.571**
*P<0.05，**P<0.01, vs control( without H2O2-treated)
五、H2O2诱导心肌细胞脂质过氧化反应
不同剂量的H2O2作用于培养的心肌细胞24 h，丙二醛的测定结果见表1。当0.05 mmol/L H2O2 作用24 h，MDA略有升高。当0.1 mmol/L H2O2作用时，MDA含量升高明显。当1 mmol/L H2O2作用24 h，细胞内脂质过氧化反应显著增加，产物MDA显著升高，P<0.01。
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讨 论
活性氧自由基是心脏疾病时诱导心肌细胞死亡的重要因素之一[6]。通常生物体内的氧化代谢会产生少量的自由基。体内的抗氧化系统(抗氧化剂和自由基清除酶类)能及时清除以维持自由基的代谢平衡。在一些损伤因素的作用下，如：缺血、缺氧、离子辐射、紫外线照射、化疗药物、化学试剂等可诱导体内大量的自由基堆积，从而产生氧化和抗氧化的不平衡状态—氧化应激，造成细胞损伤。心肌缺血时导致氧化应激状态，造成心肌内抵制活性氧自由基的保护机制发生改变，产生大量的自由基，并且诱导心肌细胞损伤，这在左心室功能障碍、心肌顿抑、心室重塑等的病理发生过程中起重要作用。心肌缺血诱导心肌细胞损伤的分子机制尚未完全阐明。研究发现，心脏疾病时(如缺血、心肌梗塞、心衰、心室肥大等)细胞内活性氧水平增加和抗氧化剂水平的降低能直接诱导细胞凋亡，因此氧化应激—心肌细胞凋亡—心脏疾病之间有着密切的联系。基于此，本研究通过外源性活性氧H2O2作用于培养的心肌细胞，建立了H2O2诱导的心脏氧化应激的细胞模型，来探讨H2O2诱导的心肌细胞凋亡性损伤。
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研究结果表明，H2O2积累可诱导新生鼠培养心肌细胞发生细胞凋亡。在5～10 mmol/L H2O2作用至6 h以上时，DNA琼脂糖凝胶电泳上出现典型的DNA梯形带(DNA ladder)；Giemsa染色可见到细胞核凝聚，染色体碎片化并附着在核膜周边，有凋亡小体存在；同时心肌细胞膜受到损伤，膜磷脂过氧化反应增加，产生大量的过氧化反应终产物丙二醛(MDA)，由于MDA在膜内能形成交联，使膜成分多聚化，最后导致膜结构的改变和膜通透性的增加。实验结果也表明LDH从心肌细胞中大量泄漏，培养介质中LDH活性显著升高。这说明此时大量的心肌细胞凋亡，染色体核小体间断裂，同时伴有细胞坏死，细胞膜遭到破坏使得心肌酶渗出。低浓度的H2O2(<1 mmol/L)作用于培养心肌细胞，造成细胞早期的生物化学改变，介质中LDH活性和MDA积累有所改变，但与正常对照组相比并无显著差异；流式细胞仪上可检测到凋亡峰，其百分率为6.7%，而琼脂糖凝胶电泳和Giemsa形态学分析并无心肌细胞发生细胞凋亡的特征表现，基本上与正常对照细胞的表现相同，染色体完整，无断裂，无边缘化，电泳无ladder带，只有高分子量的DNA带。说明此时只有少量的心肌细胞发生凋亡，灵敏度相对较低的电泳和形态学分析并未检测出来。高浓度的H2O2(>10 mmol/L)使培养心肌细胞发生坏死性的死亡，仅作用2 h时已有90%以上的细胞快速死亡，并从培养板上脱落；染色体随机断裂，DNA电泳表现出坏死特征的smear带；MDA大量积累，已达到5.71 nmol/L，明显高于正常组(0.388 nmol/L，P<0.01)；LDH也大量泄漏，达到152 U/L，与正常对照组4.7 U/L组比较差异显著，P<0.01。
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H2O2诱导的培养心肌细胞凋亡具有浓度和时间的依赖关系。本研究从细胞学分析、生物化学分析和形态学分析综合地判定了H2O2对心肌细胞的凋亡性损伤作用。另外，在低浓度的H2O2(<1 mmol/L)还看到凋亡前的生物化学改变；在高浓度H2O2(>10 mmol/L)时，可出现心肌细胞坏死性损伤；从本文实验结果，我们认为活性氧H2O2诱导心肌细胞损伤表现并不是固定不变的，它随着H2O2浓度和反应时间不同，成功地显示出凋亡前、细胞凋亡和细胞坏死等3个不同的阶段和3种不同水平的心肌细胞损伤。而且这3个阶段是在一定条件下可能产生互相转化。这一所见为进一步采取保护性措施，预防或挽救受损心肌细胞提供了有力的科学依据。
[参 考 文 献]
, 百拇医药
[1] Fliss H, Gattinger D. Apoptosis in ischemic and reperfused rat myocardium[J]. Circ Res, 1996, 79:949～956.
[2] Itoh G, Tamura J, Suzuki M, et al. DNA fragmentation of human infarcted myocardial cells demonstrated by the nick end labeling method and DNA agarose gel electrophoresis[J]. Am J Pathol, 1995,146:1325～1333.
[3] Olivetti G, Abbi R, Quaini F. Apoptosis in the failing human heart[J]. N Engl J Med, 1997, 336:1131～1341.
, 百拇医药
[4] Forrest VJ, Kang YH, MeClain DE, et al. Oxidative stress-induced apoptosis prevented by trolox[J]. Free Radic Biol Med, 1994, 16:675～684.
[5] Iwaki K, Sukhatme V. α and β-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells[J]. J Biol Chem, 1990,265:13809～13818.
[6] Ferrari G, Agnoletti L, Comini L, et al. Oxidative stress during myocardial ischemia and heart failure[J]. Eur Heart J, 1998,19(suppl B):B2～B11.
[收稿日期]1999-09-22 [修回日期]1999-12-09, 百拇医药
单位：曹纯章 杨绍娟 卜丽莎(白求恩医科大学第三临床学院中心研究室，吉林 长春 130031)；杨同书(白求恩医科大学基础医学研究所)
关键词：氧；过氧化氢；心肌；细胞，培养的；细胞死亡
中国病理生理杂志000521
[摘 要] 目的：探讨活性氧过氧化氢(H2O2)对心肌细胞损伤作用。方法：用不同浓度的H2O2作用于新生鼠培养心肌细胞，通过琼脂糖凝胶电泳、Giemsa染色和流式细胞仪等方法观察H2O2对心肌细胞的凋亡性损伤作用，同时检测培养介质中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)等生化指标的改变。结果：5 mmol/L H2O2作用于培养心肌细胞6 h，在琼脂糖凝胶电泳上出现梯状DNA带；Giemsa染色细胞涂片可见到染色体浓聚或边缘化，成新月型聚集在核膜周边，并有凋亡小体的存在；流式细胞仪可检测出亚二倍体峰的出现。结论：H2O2具有浓度和时间依赖关系诱导心肌细胞的凋亡，在低浓度H2O2(<1 mmol/L)导致培养心肌细胞的早期生物化学改变，自由基含量升高，膜通透性增加，同时伴有少量心肌细胞凋亡；而在高浓度H2O2(>10 mmol/L)时会造成培养心肌细胞的坏死性死亡，细胞膜崩塌，脂质过氧化物(MDA)大量产生，LDH大量泄漏，DNA琼脂糖凝胶电泳出现弥散(smear)泳带；5～10 mmol/L H2O2诱导大量心肌细胞凋亡性死亡，同时伴有LDH和MDA含量升高等生物化学的改变。
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[中图分类号] R363.21 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0457-05
Study on apoptotic and nonapoptotic injuries induced by hydrogen peroxide in cardiac myocytes
CAO Chun-zhang, YANG Shao-juan, BU Li-sha, YANG Tong-shu
(Central Laboratory, Third Clinical Teaching College, Norman Bethune University
of Medical Sciences, Changchun 130031, China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To study apoptotic injury induced by reactive oxygen species-hydrogen peroxide (H2O2) on cardiac myocytes.METHODS:Cultured rat neonatal cardiac myocytes were treated with H2O2 of various concentration to observe apoptotic injury of cardiomyocytes by agarose gel electrophoresis, Giemsa-stained smears of cell, and flow cytometry, meanwhile lactate dehydrogenas (LDH) and malondialdehyde(MDA) were determined to assess the effect of H2O2 on lipid peroxidation and permeability of the plasma membrane. RESULTS: 5 mmol/L H2O2 caused cultured cardiomyocytes apoptotic morphological characteristics, including nucleosomal DNA fragmentation in myocytes by agarose gel electrophoresis (DNA ladder), cell shrinkage, nuclear condensation, and chromatin margin by Giemsa-stained cell smears, and aneuploid peak(AP)-apoptotic bodies occurrence by flow cytometry.CONCLUSIONS: H2O2-induced apoptosis in myocytes was a time-and concentration-dependent process. Treatment with low concentration of H2O2(<1 mmol/L) only caused cardiomyocyted early biochemical changes, such as increase of free radicals level and membrane permeability ,which were pro-apoptotic injurious features. High concentration of H2O2 (>10 mmol/L) rapidly induced a necrotic form of death characterized by smeared patterns of DNA digestion on agarose gel electrophoresis and lethal membrane disruption (as measured by LDH release). Exposure of 5～10 mmol/L H2O2 induced cardiomyocytes apoptosis concurrently with biochemical changes of LDH and MDA increase in the medium.
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[MeSH] Oxygen; Hydrogen peroxide; Myocardium; Cells, cultured; Cell death
细胞凋亡是真核生物细胞最基本的生命过程之一，通过激活细胞内源性的自杀机制及时清除生理上不需要的、严重受损的和有潜在危险的细胞。细胞凋亡是一个主动的、由基因指导的细胞死亡过程，它与坏死性细胞死亡可从形态学和生物化学上区分开来。最近的研究表明，心脏疾病时如：缺血/再灌注损伤[1]、心肌梗塞[2]、心力衰竭[3]等人或动物的心脏中，都存在心肌细胞凋亡性死亡，细胞凋亡是心肌细胞死亡的一个重要机制，在心脏重塑、心脏功能障碍进一步发展过程中起重要的作用。但是，人们对心肌细胞凋亡的分子机制仍不清楚。
导致细胞凋亡的许多类型的刺激能造成细胞内活性氧的产生，另外将外源性氧化剂作用于细胞也可诱导细胞凋亡[4]，因此活性氧的产生可能直接参与细胞凋亡过程。过氧化氢(H2O2)是体内氧化代谢的中间产物，同时又是一种活性氧。H2O2的浓度积累达到一定程度会对心肌细胞产生损伤作用。本研究目的是确定H2O2的浓度积累所造成心肌细胞的生物化学改变和细胞形态学所见，以及心肌细胞凋亡产生中，其生物化学改变和细胞凋亡、细胞坏死等细胞形态学所见之间的关系。
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材 料 和 方 法
一、心肌细胞的培养[5]
取新生1～2 d的Wistar大鼠的心室肌组织，研碎，用0.25%的胰蛋白酶分别消化5、15、20 min，将后两次的细胞悬液混合在一起。预培养90 min去掉非心肌细胞，以3×105细胞/mL的密度置入培养器皿中，在36.5℃的CO2(5%)孵箱内进行培养。培养基为MEM(含15%小牛血清)。在培养4 d后细胞达融合状态后施加H2O2损伤因素，作用一定时间后做检测，以不含H2O2的培养心肌细胞作对照。
二、DNA琼脂糖电泳
培养完毕后，将细胞溶解在裂解液中，37℃保温18 h。用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA两次，用乙醇-20℃沉淀DNA，过夜。10 000×g离心30 min，沉淀重新溶解在TE中，用100 μg/mL RNase 10 μL于37℃保温1 h。再用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA，用70%乙醇沉淀DNA。沉淀重新溶解在TE液中，在1.8%琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色，紫外灯下观察。
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三、流式细胞术(flow cytometry)检测心肌细胞凋亡小体
培养的心肌细胞(2×106 cells/mL)用胰蛋白酶消化下来后，用PBS洗涤两次，离心去除细胞碎片。以350目尼龙网过滤去除细胞团块，加入RNase至100 μg/mL，37℃消化30 min，50 μg/mL碘化丙锭(PI)4℃染色1 h，ELITE型流式细胞仪检测，以Multicycle软件分析数据，记录亚二倍体峰(aneuploid peak, AP)，即凋亡小体百分率。
四、LDH活性测定
通过测定培养介质中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的活性来评价H2O2对培养心肌细胞膜的损伤。以不同浓度的H2O2作用不同的时间，取培养液在日立7150生化自动分析仪上测LDH活性。每个浓度的实验做6份重复测试。
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五、MDA含量测定
通过测定细胞及培养介质中的总丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量来评价H2O2对细胞膜中脂质过氧化反应的影响。以1，1，3，3-四甲基丙烷为标准品，岛津RF-540荧光分光光度计测定MDA的含量。
六、以Giemsa染色观察培养心肌细胞形态学的改变 按病理学常规方法涂片，在光镜下观察。
七、统计处理
数据以均数±标准差表示，H2O2作用前后采用方差分析。
结 果
一、DNA-琼脂糖凝胶电泳分析
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不同浓度的H2O2作用于培养心肌细胞一定的时间后，从中提取DNA进行电泳。结果表明，当5～10 mmol/L H2O2作用6 h，染色体核小体间断裂，产生具一定寡核苷酸长度的DNA片段，紫外灯下可见到典型的细胞凋亡DNA梯状带(见图1，第3泳道)。低浓度的H2O2(<1 mmol/L)作用6～24 h，对培养的心肌细胞核均未见有影响，DNA电泳出现高分子量的完整DNA带，无梯形带(见图1，第4泳道)。当高浓度的H2O2(>10 mmol/L)作用于培养心肌细胞2 h，就可造成心肌细胞坏死性死亡，DNA电泳出现典型的弥散(smear)泳带(见图1，第2泳道)。
二、Giemsa染色的细胞形态学分析
形态学分析表明，5～10 mmol/L H2O2作用6 h，Giemsa染色的细胞涂片表现出典型的凋亡形态学改变，细胞体积缩小，细胞核及染色质浓聚，呈半圆型或新月型聚集在核膜周边，染色体断裂成碎片并附着在核膜边缘，并有凋亡小体存在(见图2A)。低浓度的H2O2(<1 mmol/L)作用6 h，形态学表现与正常对照组基本相同，细胞体积变化不大，胞质均匀，细胞核无浓聚、边缘化和碎片化(见图2B)。而高浓度的H2O2(>10 mmol/L)作用2 h，表现出细胞膜破裂，细胞器降解，心肌细胞坏死性死亡。
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Fig 1 Electrophoretic analysis of DNA extracted
from cultured myocytes
(1) DL 15 000 DNA markers; (2) 20 mmol/L H2O2 for 6 h； (3) 5 mmol/L H2O2 for 6 h; (4) 1 mmol/L H2O2 for 24 h； (5) control
图1 培养心肌细胞DNA琼脂糖凝胶电泳
Fig 2 Giemsa-stained preparationof cultured myocytes(A:5mmol/L H2O2 for6h;B:1mmol/L H2O2 for 6h)
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图2培养心肌细胞Giemsa染色
三、流式细胞术分析结果
一定浓度的H2O2作用于培养心肌细胞，反应一定时间后，用流式细胞仪检测凋亡小体百分率及细胞凋亡峰。结果表明，5 mmol/L H2O2作用2,4,6, 12 h产生凋亡小体百分比分别为11.5%、20.1%、35.6%和49.3%。产生的凋亡峰见图3。
另外低浓度的H2O2(<1 mmol/L)作用2 h，产生凋亡小体6.7%，与5 mmol/L H2O2组相比差异显著。当10 mmol/L以上浓度的H2O2作用培养心肌细胞2 h，就可造成心肌细胞坏死，产生大量的细胞碎片。
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四、H2O2对培养心肌细胞膜通透性的影响
不同剂量的H2O2作用于培养心肌细胞不同时间，其膜通透性的改变以LDH从心肌细胞的漏出来衡量。当0.1 mmol/L H2O2作用2 h，心肌细胞酶基本无漏出，5 mmol/L H2O2作用于心肌细胞2 h，膜通透性明显增加，LDH大量由细胞膜漏出[由对照组(47.0±1.2) U/L上升到(143.0±1.7) U/L，P<0.01]。随着H2O2作用浓度和时间的增加，培养液中LDH活性显著升高，差异显著(见图4)。
Fig 3 Aneuploid peak (apoptotic peak) of cultured cardiomyocytes by flow cytometry
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(A: 5 mmol/L H2O2 for 2 h; B: 5 mmol/L H2O2 for 12 h)
图3 流式细胞仪检测培养心肌细胞凋亡峰
Fig 4 Effect of H2O2 on cardiomyocytes (n=6)
图4 不同浓度的H2O2作用不同的时间
培养心肌细胞漏出LDH之比较
表1 不同浓度H2O2作用培养心肌细胞24 h，细胞和介质中的MDA含量比较
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Tab 1 MDA content in the medium and
cardiomyocytes exposed to H2O2 at 24 h (n=6) H2O2(mmol/L)
Time(h)
MDA(nmol/L，
±s)0
24
0.388±0.145
0.05
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24
0.549±0.061
0.1
24
0.602±0.122*
1.0
24
1.713±0.275**
5.0
24
3.578±0.327**
10
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24
5.710±0.571**
*P<0.05，**P<0.01, vs control( without H2O2-treated)
五、H2O2诱导心肌细胞脂质过氧化反应
不同剂量的H2O2作用于培养的心肌细胞24 h，丙二醛的测定结果见表1。当0.05 mmol/L H2O2 作用24 h，MDA略有升高。当0.1 mmol/L H2O2作用时，MDA含量升高明显。当1 mmol/L H2O2作用24 h，细胞内脂质过氧化反应显著增加，产物MDA显著升高，P<0.01。
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讨 论
活性氧自由基是心脏疾病时诱导心肌细胞死亡的重要因素之一[6]。通常生物体内的氧化代谢会产生少量的自由基。体内的抗氧化系统(抗氧化剂和自由基清除酶类)能及时清除以维持自由基的代谢平衡。在一些损伤因素的作用下，如：缺血、缺氧、离子辐射、紫外线照射、化疗药物、化学试剂等可诱导体内大量的自由基堆积，从而产生氧化和抗氧化的不平衡状态—氧化应激，造成细胞损伤。心肌缺血时导致氧化应激状态，造成心肌内抵制活性氧自由基的保护机制发生改变，产生大量的自由基，并且诱导心肌细胞损伤，这在左心室功能障碍、心肌顿抑、心室重塑等的病理发生过程中起重要作用。心肌缺血诱导心肌细胞损伤的分子机制尚未完全阐明。研究发现，心脏疾病时(如缺血、心肌梗塞、心衰、心室肥大等)细胞内活性氧水平增加和抗氧化剂水平的降低能直接诱导细胞凋亡，因此氧化应激—心肌细胞凋亡—心脏疾病之间有着密切的联系。基于此，本研究通过外源性活性氧H2O2作用于培养的心肌细胞，建立了H2O2诱导的心脏氧化应激的细胞模型，来探讨H2O2诱导的心肌细胞凋亡性损伤。
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研究结果表明，H2O2积累可诱导新生鼠培养心肌细胞发生细胞凋亡。在5～10 mmol/L H2O2作用至6 h以上时，DNA琼脂糖凝胶电泳上出现典型的DNA梯形带(DNA ladder)；Giemsa染色可见到细胞核凝聚，染色体碎片化并附着在核膜周边，有凋亡小体存在；同时心肌细胞膜受到损伤，膜磷脂过氧化反应增加，产生大量的过氧化反应终产物丙二醛(MDA)，由于MDA在膜内能形成交联，使膜成分多聚化，最后导致膜结构的改变和膜通透性的增加。实验结果也表明LDH从心肌细胞中大量泄漏，培养介质中LDH活性显著升高。这说明此时大量的心肌细胞凋亡，染色体核小体间断裂，同时伴有细胞坏死，细胞膜遭到破坏使得心肌酶渗出。低浓度的H2O2(<1 mmol/L)作用于培养心肌细胞，造成细胞早期的生物化学改变，介质中LDH活性和MDA积累有所改变，但与正常对照组相比并无显著差异；流式细胞仪上可检测到凋亡峰，其百分率为6.7%，而琼脂糖凝胶电泳和Giemsa形态学分析并无心肌细胞发生细胞凋亡的特征表现，基本上与正常对照细胞的表现相同，染色体完整，无断裂，无边缘化，电泳无ladder带，只有高分子量的DNA带。说明此时只有少量的心肌细胞发生凋亡，灵敏度相对较低的电泳和形态学分析并未检测出来。高浓度的H2O2(>10 mmol/L)使培养心肌细胞发生坏死性的死亡，仅作用2 h时已有90%以上的细胞快速死亡，并从培养板上脱落；染色体随机断裂，DNA电泳表现出坏死特征的smear带；MDA大量积累，已达到5.71 nmol/L，明显高于正常组(0.388 nmol/L，P<0.01)；LDH也大量泄漏，达到152 U/L，与正常对照组4.7 U/L组比较差异显著，P<0.01。
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H2O2诱导的培养心肌细胞凋亡具有浓度和时间的依赖关系。本研究从细胞学分析、生物化学分析和形态学分析综合地判定了H2O2对心肌细胞的凋亡性损伤作用。另外，在低浓度的H2O2(<1 mmol/L)还看到凋亡前的生物化学改变；在高浓度H2O2(>10 mmol/L)时，可出现心肌细胞坏死性损伤；从本文实验结果，我们认为活性氧H2O2诱导心肌细胞损伤表现并不是固定不变的，它随着H2O2浓度和反应时间不同，成功地显示出凋亡前、细胞凋亡和细胞坏死等3个不同的阶段和3种不同水平的心肌细胞损伤。而且这3个阶段是在一定条件下可能产生互相转化。这一所见为进一步采取保护性措施，预防或挽救受损心肌细胞提供了有力的科学依据。
[参 考 文 献]
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[4] Forrest VJ, Kang YH, MeClain DE, et al. Oxidative stress-induced apoptosis prevented by trolox[J]. Free Radic Biol Med, 1994, 16:675～684.
[5] Iwaki K, Sukhatme V. α and β-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells[J]. J Biol Chem, 1990,265:13809～13818.
[6] Ferrari G, Agnoletti L, Comini L, et al. Oxidative stress during myocardial ischemia and heart failure[J]. Eur Heart J, 1998,19(suppl B):B2～B11.
[收稿日期]1999-09-22 [修回日期]1999-12-09, 百拇医药