血管紧张素Ⅱ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA表达的影响
作者：陶婷 朱鼎良 龚兰生
单位：(上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所，上海 200025)
关键词：血管紧张素Ⅱ；血管；成纤维细胞；胶原
中国病理生理杂志000506
[摘 要] 目的：观察血管紧张素Ⅱ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA表达的影响。方法：血管紧张素Ⅱ作用于培养的大鼠血管外膜成纤维细胞，采取酶联免疫吸附法(ELISA)、竞争性逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果：在血管紧张素Ⅱ作用下，血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达均增加，且有一定的剂量依赖性。结论：血管紧张素Ⅱ可刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达，提示血管紧张素Ⅱ是调节血管外膜成纤维细胞胶原代谢的重要因子，血管外膜成纤维细胞可能参与高血压血管重塑过程。
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[中图分类号] Q344+.13; R544.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0405-04
Role of angiotensin Ⅱ on typeⅠcollagen synthesis and its mRNA expression in vascular adventitial fibroblasts
TAO Ting, ZHU Ding-liang, GONG Lan-sheng
(Shanghai Institute of Hypertension，Ruijin Hospital，Shanghai 200025, China)
[Abstract] AIM：Effects of angiotensin Ⅱ on typeⅠcollagen synthesis and its mRNA expression in cultured vascular adventitial fibroblasts. METHODS:Vascular adventitial fibroblasts (VAF)were isolated, cultured from rat thoracic aorta by explant method. ELISA was used to study typeⅠcollagen synthesis and competitive RT-PCR was employed to detect its mRNA expression after angiotensin Ⅱ administration. RESULTS: Angiontensin Ⅱ caused a dose dependent increase of typeⅠcollagen synthesis and its mRNA expression in VAF. CONCLUSION:The results support that angiotensin Ⅱ is an important factor controlling collagen metabolism of VAF and VAF may play an important role in vascular remodelling of hypertension.
, 百拇医药
[MeSH] Angiotensin Ⅱ； Blood vessels; Fibroblasts; Collagen
高血压血管重塑既是高血压的重要病理变化，又是高血压维持,进展的结构基础，既往研究多集中于内皮细胞及中膜血管平滑肌细胞。1991年朱鼎良报道自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)血管外膜成纤维细胞增殖明显快于对照京都种Wistar大鼠(WKY)，且SHR血管外膜成纤维细胞对多种生长因子的反应也明显强于WKY[1，2]，这些现象提示血管外膜成纤维细胞可能参与高血压血管重塑过程。
血管重塑过程中，除了有细胞的增殖、肥大还存在细胞外间质种类和数量的变化，而局部体液因素起重要的调节作用，其中血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)尤为重要。已有文献报道血管外膜也存在AngⅡ的受体，经AngⅡ灌流的SD大鼠其胸主动脉外膜胶原沉积增多[3]。而血管外膜主要的细胞成分为血管外膜成纤维细胞，故本文在细胞水平上，采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosor bent assay, ELISA)法及竞争性逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)法研究AngⅡ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA表达的影响。
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材 料 和 方 法
一、血管外膜成纤维细胞的培养
参照文献[1]取6～8周雄性SHR大鼠(上海市高血压研究所提供)，断头处死，常规体表消毒，开胸游离取出胸主动脉，分离外膜.剪至1 mm×1 mm大小的组织块，置于培养皿(Nunc)中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液进行组织贴块培养。待细胞长至亚融合状态，用0.125% trypsin-EDTA消化、传代，取第5～10代细胞作实验材料。细胞经α-actin单抗鉴定以与血管平滑肌细胞区别。(胎牛血清、DMEM粉剂、0.125%trypsin-EDTA均购自GIBCOL，α-actin单抗购自Sigma)。
二、ELISA法检测培养液中Ⅰ型胶原的含量
收集经不同浓度的AngⅡ(Sigma)刺激24 h后的血管外膜成纤维细胞的培养液，采用ELISA法检测培养液中Ⅰ型胶原的含量.首先将待测培养液加入96孔板4℃过夜，后加鼠抗人Ⅰ型胶原抗体(Sigma)37℃ 2 h，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(华美)37℃ 1 h，最后加入邻苯二胺显色，并用酶联仪(BioRad)读取492 nm处的光密度值(OD值)。
, 百拇医药
三、竞争性RT-PCR检测Ⅰ型胶原mRNA的表达
简要步骤如下：用Trizol试剂(GIBCOL)按说明书抽提RNA。取1.5μg RNA进行逆转录，逆转录酶为M-MLV(GIBCOL)，温度条件为：65℃ 5 min，37℃ 1 h，95℃ 5 min，RT产物-70℃保存。取RT产物采用PCR法合成目的片段(254 bp)及竞争片段(175 bp)并进行回收、纯化。用于合成目的片段的引物参照文献[4]略作修改：上游引物(P1)5′-GTT CGT GGT TCT CAG GGT AG-3′，下游引物(P2)5′-TTG TCG TAG CAG GGT TCT TTC-3′；竞争片段的上游引物同P1为5′-GTT CGT GGT TCT CAG GGT AG-3′， 设计下游引物(P3)为5′-TTG TCG TAG CAG GGT TCT TTC TCT GAG TGA AGG CTG GGA GCG -3′ 。(所有引物的靶序列为小鼠α2(I)前胶原的cDNA序列)。PCR条件为94℃ 3 min×1个循环，94℃ 45 s，58℃ 1 min，72℃ 45 s ×26个循环。以一定量的竞争片段与连续对倍稀释的目的片段为模板进行PCR，条件同前，PCR产物进行2%琼脂糖电泳，经图像处理(VIDAS图象处理系统)扫描得到目的片段和竞争片段的密度值，以二者比值的对数值与目的片段量的对数值进行直线回归，建立标准曲线。取样品的RT产物加入一定量的竞争片段(与制作标准曲线时使用量相同)为模板及引物P1，P2进行PCR，条件同前，同上步骤得到PCR产物目的片段与竞争片段的密度比，代入直线回归方程即可得到样品的拷贝数。在进行竞争性PCR前，为防止RT效率的差异先取样本的RT产物加入3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase,GAPDH)引物[5]进行PCR，观察其表达情况。
, 百拇医药
结 果
一、ELISA法检测培养液中Ⅰ型胶原含量
AngⅡ可刺激SHR血管外膜成纤维细胞合成、分泌Ⅰ型胶原，有一定的剂量依赖性。对照组、10-10mol/L、10-8mol/L、10-6mol/L AngⅡ处理组OD值(±s)分别为0.123±0.015、0.270±0.048、0.273±0.124、0.310±0.046，各AngⅡ处理组与对照组比较均有显著差异(P<0.05)，且随着浓度的增大(10-10mol/L -10-6mol/L)，其作用也逐渐增强，在此范围内10-6mol/L作用最强，约为对照组的2.5倍(图1)。
Fig 1 Effect of AngⅡ on the collagen synthesis of vascular adventitial fibroblasts(n=4)
, 百拇医药
CON:control group, without AngⅡ treatment
*P<0.05,vs control group
图1 不同浓度血管紧张素Ⅱ对血管外膜成纤维
细胞Ⅰ型胶原合成的影响
二、竞争性RT-PCR检测Ⅰ型胶原mRNA的表达
标准曲线的直线回归方程为：lg T/C=-0.4998+0.2466lgX r=0.98 P<0.01相关性良好(T代表目的片段的密度值，C代表竞争片段的密度值，X代表待测样品的拷贝数)。对照组及AngⅡ处理组RT产物GAPDH表达基本一致，提示RT效率一致(图2)。样本竞争性RT-PCR的结果(图3)经图象处理代入回归方程，计算得到对照组及AngⅡ处理组的α2(I)前胶原mRNA的表达量(表1)。经DUNCAN检验验证AngⅡ作用10-6mol/L组与10-8mol/L组，10-6mol/L组与10-10mol/L组，10-6mol/L组与对照组，10-8mol/L与对照组间均有显著差异(P<0.05)，提示AngⅡ可刺激血管外膜成纤维细胞α2(I)前胶原mRNA的表达，且随着AngⅡ浓度的增大，其作用也增强，10-6mol/L的作用最强，约为对照组的2.1倍。
, 百拇医药
表1 血管紧张素Ⅱ对大鼠血管外膜成纤维细胞α2(I)前胶原mRNA表达(fg/μgRNA)的影响
Tab1 Effect of AngⅡ on the α2(I) procollagen mRNA expression of vascular adventitial fibroblasts (
±s, n=3) AngⅡconcentration(mol/L)
10-6
10-8
10-10
Control
, 百拇医药
mRNA expression(fg/μg RNA)
30.55±0.24*△#
15.40±0.03*
9.52±0.04
4.96±0.02
control： without AngⅡ treatment；*P<0.05，vs control;△P<0.05,vs group treated by Ang Ⅱ of 10-8 mol/L;# P<0.05,vs group treated by Ang Ⅱ of 10-10 mol/L
, 百拇医药
Fig 2 Effect of AngⅡ(mol/L) on GAPDH RNA expression of vascular adventitial fibroblasts
Length of the fragment is 309bp,the same density of the four fragment reveals the same RT efficiency. CON: control group,without AngⅡ treatment
图2 血管紧张素Ⅱ刺激大鼠血管外膜成纤维细胞样本GAPDH的表达
Fig 3 AngⅡ(mol/L) stimulate the α2(I) procollagen mRNA expression of vascular adventitial fibroblasts
, 百拇医药
The length of the target fragment and the competitive fragment is 254bp and 175bp.With the increasing of the AngⅡ concentration ,the density of the target fragment become higher and that of the competitive fragment become lower
图3 血管紧张素Ⅱ刺激大鼠血管外膜成纤维细胞α2(I)前胶原mRNA的表达
讨 论
血管重塑是高血压重要病理改变之一。近年来关于血管外膜成纤维细胞在高血压血管重塑中的作用的研究已逐步开展。除了有关于体外培养的成纤维细胞的研究结果[1，2]，在组织细胞水平亦发现高血压大鼠血管外膜成纤维细胞数目及其在外膜的分布密度也发生改变： Lee的研究表明在DOCA高血压大鼠，其胸主动脉外膜厚度和外膜成纤维细胞数目均二倍于对照，且肥厚程度与血压升高的程度呈正相关[6]；另一项大体研究采用共聚焦显微镜观察高血压血管重塑发现，与WKY比较易卒中高血压大鼠胸主动脉外膜细胞密度明显增高[7]。
, 百拇医药
但是，在高血压血管重塑中除了存在细胞的增殖、肥大，细胞外基质尤其是胶原的种类、数量的变化也非常重要。调节胶原代谢的因素有多种，是否有血管外膜成纤维细胞的参与，目前也不清楚。本研究首次报道了AngⅡ可刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原的合成，提示血管外膜成纤维细胞可能通过AngⅡ参与血管壁胶原代谢的调节，为研究高血压血管重塑的机制提供了新的思路。至于AngⅡ刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成的机制尚不清楚，可能与转录水平或转录后水平的调节有关。为进一步探讨，本文就AngⅡ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响进行了研究。
RT-PCR法是研究基因表达的常用方法，但由于管效应及平台期的存在，常规以β-actin为参照的PCR法不能很好地用于基因表达的定量研究[8]，近来文献报道的一种竞争性RT-PCR法较为成功地解决了这些问题。其基本原理为预先构建一个竞争片段，以一定量竞争片段与样本cDNA同时进行PCR，由于竞争片段与目的片段几乎相同，且所使用的引物也完全相同，故两者的PCR效率也相近，两者PCR产物的比值可代表其初始模板量的差异[9]。本文以Nicoletti设计的引物[4]为基础采用较为简单的方法，构建、纯化了与目的片段相差79bp的竞争片段，用于竞争性RT-PCR。为防止样品RT效率的差异，本文用GAPDH的表达作RT效率的校正。因此，本方法较可靠，简便易行，是方法学上的创新。
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本研究结果表明，AngⅡ可刺激血管外膜成纤维细胞α2(I)前胶原mRNA的表达，且随着浓度的增大，其作用亦增强，与蛋白水平的研究结果相一致，由此推测AngⅡ刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成的机制与其在转录水平刺激Ⅰ型胶原mRNA的表达有关。总之，血管紧张素Ⅱ可刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA的表达，由此提示血管外膜成纤维细胞可能参与血管壁胶原代谢的调节，为高血压血管重塑机制的研究及高血压的防治提供了新的思路。
[基金项目]卫生部基金资助
[参 考 文 献]
[1] Zhu DL, Herembert T, Marche P. Increased proliferation of adventitial fibroblasts from spontaneously hypertensive rat aorta [J]. J Hypertens, 1991, 9:1161～1168.
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[2] Zhu DL, Herembert T, Caruelle D, et al. Signaling mechanism of basic fibroblast growth factor in arterial cells from genetically hypertensive rat [J]. Am J Hypertens, 1994, 7: 351～356.
[3] Sun Y， Pamires F J A, Weber KT. Fibrosis of atria and great vessels in response to angiotensin Ⅱ or aldosterone infusion [J]. Cardiovasc Res,1997, 35: 138～147.
[4] Nicoletti A,Heudes D,Hinglais N,et al.Left ventricular fibrosis in renovascular hypertensive rats: effect of losartan and spironolactone [J].Hypertension, 1995,26:101～107.
, 百拇医药
[5] Verrey F.Regulation of gene expression by aldosterone in tight epithelia [J]. Semin Nephrol, 1990,10:410～420.
[6] Lee RMKW.Structure alteration of blood vessels in hypertensive rats [J].Can J Physiol Pharmacol, 1987,65: 1528～1535.
[7] Arribas SM, Hillier C, Gonzalez C, et al.Cellular aspects of vascular remodeling in hypertension revealed by confocal microscopy [J]. Hypertension, 1997,30:1455～1464.
, 百拇医药
[8] Ballagi-Pordany A,Funa Ka.Quantitative determination of mRNA phenotypes by the polymerase chain reaction [J]. Anal Biochem ,1991,196:89～94.
[9] Jiang Y-H,Davidson LA,Lupton JR,et al.Rapid competitive PCR determination of relative gene expression in limiting tissue samples [J]. Clin Chem, 1996,42:227～231.
[收稿日期]1999-03-17 [修回日期]1999-09-03
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单位：(上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所，上海 200025)
关键词：血管紧张素Ⅱ；血管；成纤维细胞；胶原
中国病理生理杂志000506
[摘 要] 目的：观察血管紧张素Ⅱ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA表达的影响。方法：血管紧张素Ⅱ作用于培养的大鼠血管外膜成纤维细胞，采取酶联免疫吸附法(ELISA)、竞争性逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果：在血管紧张素Ⅱ作用下，血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达均增加，且有一定的剂量依赖性。结论：血管紧张素Ⅱ可刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达，提示血管紧张素Ⅱ是调节血管外膜成纤维细胞胶原代谢的重要因子，血管外膜成纤维细胞可能参与高血压血管重塑过程。
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[中图分类号] Q344+.13; R544.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0405-04
Role of angiotensin Ⅱ on typeⅠcollagen synthesis and its mRNA expression in vascular adventitial fibroblasts
TAO Ting, ZHU Ding-liang, GONG Lan-sheng
(Shanghai Institute of Hypertension，Ruijin Hospital，Shanghai 200025, China)
[Abstract] AIM：Effects of angiotensin Ⅱ on typeⅠcollagen synthesis and its mRNA expression in cultured vascular adventitial fibroblasts. METHODS:Vascular adventitial fibroblasts (VAF)were isolated, cultured from rat thoracic aorta by explant method. ELISA was used to study typeⅠcollagen synthesis and competitive RT-PCR was employed to detect its mRNA expression after angiotensin Ⅱ administration. RESULTS: Angiontensin Ⅱ caused a dose dependent increase of typeⅠcollagen synthesis and its mRNA expression in VAF. CONCLUSION:The results support that angiotensin Ⅱ is an important factor controlling collagen metabolism of VAF and VAF may play an important role in vascular remodelling of hypertension.
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[MeSH] Angiotensin Ⅱ； Blood vessels; Fibroblasts; Collagen
高血压血管重塑既是高血压的重要病理变化，又是高血压维持,进展的结构基础，既往研究多集中于内皮细胞及中膜血管平滑肌细胞。1991年朱鼎良报道自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)血管外膜成纤维细胞增殖明显快于对照京都种Wistar大鼠(WKY)，且SHR血管外膜成纤维细胞对多种生长因子的反应也明显强于WKY[1，2]，这些现象提示血管外膜成纤维细胞可能参与高血压血管重塑过程。
血管重塑过程中，除了有细胞的增殖、肥大还存在细胞外间质种类和数量的变化，而局部体液因素起重要的调节作用，其中血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)尤为重要。已有文献报道血管外膜也存在AngⅡ的受体，经AngⅡ灌流的SD大鼠其胸主动脉外膜胶原沉积增多[3]。而血管外膜主要的细胞成分为血管外膜成纤维细胞，故本文在细胞水平上，采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosor bent assay, ELISA)法及竞争性逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)法研究AngⅡ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA表达的影响。
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材 料 和 方 法
一、血管外膜成纤维细胞的培养
参照文献[1]取6～8周雄性SHR大鼠(上海市高血压研究所提供)，断头处死，常规体表消毒，开胸游离取出胸主动脉，分离外膜.剪至1 mm×1 mm大小的组织块，置于培养皿(Nunc)中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液进行组织贴块培养。待细胞长至亚融合状态，用0.125% trypsin-EDTA消化、传代，取第5～10代细胞作实验材料。细胞经α-actin单抗鉴定以与血管平滑肌细胞区别。(胎牛血清、DMEM粉剂、0.125%trypsin-EDTA均购自GIBCOL，α-actin单抗购自Sigma)。
二、ELISA法检测培养液中Ⅰ型胶原的含量
收集经不同浓度的AngⅡ(Sigma)刺激24 h后的血管外膜成纤维细胞的培养液，采用ELISA法检测培养液中Ⅰ型胶原的含量.首先将待测培养液加入96孔板4℃过夜，后加鼠抗人Ⅰ型胶原抗体(Sigma)37℃ 2 h，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(华美)37℃ 1 h，最后加入邻苯二胺显色，并用酶联仪(BioRad)读取492 nm处的光密度值(OD值)。
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三、竞争性RT-PCR检测Ⅰ型胶原mRNA的表达
简要步骤如下：用Trizol试剂(GIBCOL)按说明书抽提RNA。取1.5μg RNA进行逆转录，逆转录酶为M-MLV(GIBCOL)，温度条件为：65℃ 5 min，37℃ 1 h，95℃ 5 min，RT产物-70℃保存。取RT产物采用PCR法合成目的片段(254 bp)及竞争片段(175 bp)并进行回收、纯化。用于合成目的片段的引物参照文献[4]略作修改：上游引物(P1)5′-GTT CGT GGT TCT CAG GGT AG-3′，下游引物(P2)5′-TTG TCG TAG CAG GGT TCT TTC-3′；竞争片段的上游引物同P1为5′-GTT CGT GGT TCT CAG GGT AG-3′， 设计下游引物(P3)为5′-TTG TCG TAG CAG GGT TCT TTC TCT GAG TGA AGG CTG GGA GCG -3′ 。(所有引物的靶序列为小鼠α2(I)前胶原的cDNA序列)。PCR条件为94℃ 3 min×1个循环，94℃ 45 s，58℃ 1 min，72℃ 45 s ×26个循环。以一定量的竞争片段与连续对倍稀释的目的片段为模板进行PCR，条件同前，PCR产物进行2%琼脂糖电泳，经图像处理(VIDAS图象处理系统)扫描得到目的片段和竞争片段的密度值，以二者比值的对数值与目的片段量的对数值进行直线回归，建立标准曲线。取样品的RT产物加入一定量的竞争片段(与制作标准曲线时使用量相同)为模板及引物P1，P2进行PCR，条件同前，同上步骤得到PCR产物目的片段与竞争片段的密度比，代入直线回归方程即可得到样品的拷贝数。在进行竞争性PCR前，为防止RT效率的差异先取样本的RT产物加入3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase,GAPDH)引物[5]进行PCR，观察其表达情况。
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结 果
一、ELISA法检测培养液中Ⅰ型胶原含量
AngⅡ可刺激SHR血管外膜成纤维细胞合成、分泌Ⅰ型胶原，有一定的剂量依赖性。对照组、10-10mol/L、10-8mol/L、10-6mol/L AngⅡ处理组OD值(±s)分别为0.123±0.015、0.270±0.048、0.273±0.124、0.310±0.046，各AngⅡ处理组与对照组比较均有显著差异(P<0.05)，且随着浓度的增大(10-10mol/L -10-6mol/L)，其作用也逐渐增强，在此范围内10-6mol/L作用最强，约为对照组的2.5倍(图1)。
Fig 1 Effect of AngⅡ on the collagen synthesis of vascular adventitial fibroblasts(n=4)
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CON:control group, without AngⅡ treatment
*P<0.05,vs control group
图1 不同浓度血管紧张素Ⅱ对血管外膜成纤维
细胞Ⅰ型胶原合成的影响
二、竞争性RT-PCR检测Ⅰ型胶原mRNA的表达
标准曲线的直线回归方程为：lg T/C=-0.4998+0.2466lgX r=0.98 P<0.01相关性良好(T代表目的片段的密度值，C代表竞争片段的密度值，X代表待测样品的拷贝数)。对照组及AngⅡ处理组RT产物GAPDH表达基本一致，提示RT效率一致(图2)。样本竞争性RT-PCR的结果(图3)经图象处理代入回归方程，计算得到对照组及AngⅡ处理组的α2(I)前胶原mRNA的表达量(表1)。经DUNCAN检验验证AngⅡ作用10-6mol/L组与10-8mol/L组，10-6mol/L组与10-10mol/L组，10-6mol/L组与对照组，10-8mol/L与对照组间均有显著差异(P<0.05)，提示AngⅡ可刺激血管外膜成纤维细胞α2(I)前胶原mRNA的表达，且随着AngⅡ浓度的增大，其作用也增强，10-6mol/L的作用最强，约为对照组的2.1倍。
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表1 血管紧张素Ⅱ对大鼠血管外膜成纤维细胞α2(I)前胶原mRNA表达(fg/μgRNA)的影响
Tab1 Effect of AngⅡ on the α2(I) procollagen mRNA expression of vascular adventitial fibroblasts (
±s, n=3) AngⅡconcentration(mol/L)10-6
10-8
10-10
Control
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mRNA expression(fg/μg RNA)
30.55±0.24*△#
15.40±0.03*
9.52±0.04
4.96±0.02
control： without AngⅡ treatment；*P<0.05，vs control;△P<0.05,vs group treated by Ang Ⅱ of 10-8 mol/L;# P<0.05,vs group treated by Ang Ⅱ of 10-10 mol/L
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Fig 2 Effect of AngⅡ(mol/L) on GAPDH RNA expression of vascular adventitial fibroblasts
Length of the fragment is 309bp,the same density of the four fragment reveals the same RT efficiency. CON: control group,without AngⅡ treatment
图2 血管紧张素Ⅱ刺激大鼠血管外膜成纤维细胞样本GAPDH的表达
Fig 3 AngⅡ(mol/L) stimulate the α2(I) procollagen mRNA expression of vascular adventitial fibroblasts
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The length of the target fragment and the competitive fragment is 254bp and 175bp.With the increasing of the AngⅡ concentration ,the density of the target fragment become higher and that of the competitive fragment become lower
图3 血管紧张素Ⅱ刺激大鼠血管外膜成纤维细胞α2(I)前胶原mRNA的表达
讨 论
血管重塑是高血压重要病理改变之一。近年来关于血管外膜成纤维细胞在高血压血管重塑中的作用的研究已逐步开展。除了有关于体外培养的成纤维细胞的研究结果[1，2]，在组织细胞水平亦发现高血压大鼠血管外膜成纤维细胞数目及其在外膜的分布密度也发生改变： Lee的研究表明在DOCA高血压大鼠，其胸主动脉外膜厚度和外膜成纤维细胞数目均二倍于对照，且肥厚程度与血压升高的程度呈正相关[6]；另一项大体研究采用共聚焦显微镜观察高血压血管重塑发现，与WKY比较易卒中高血压大鼠胸主动脉外膜细胞密度明显增高[7]。
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但是，在高血压血管重塑中除了存在细胞的增殖、肥大，细胞外基质尤其是胶原的种类、数量的变化也非常重要。调节胶原代谢的因素有多种，是否有血管外膜成纤维细胞的参与，目前也不清楚。本研究首次报道了AngⅡ可刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原的合成，提示血管外膜成纤维细胞可能通过AngⅡ参与血管壁胶原代谢的调节，为研究高血压血管重塑的机制提供了新的思路。至于AngⅡ刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成的机制尚不清楚，可能与转录水平或转录后水平的调节有关。为进一步探讨，本文就AngⅡ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响进行了研究。
RT-PCR法是研究基因表达的常用方法，但由于管效应及平台期的存在，常规以β-actin为参照的PCR法不能很好地用于基因表达的定量研究[8]，近来文献报道的一种竞争性RT-PCR法较为成功地解决了这些问题。其基本原理为预先构建一个竞争片段，以一定量竞争片段与样本cDNA同时进行PCR，由于竞争片段与目的片段几乎相同，且所使用的引物也完全相同，故两者的PCR效率也相近，两者PCR产物的比值可代表其初始模板量的差异[9]。本文以Nicoletti设计的引物[4]为基础采用较为简单的方法，构建、纯化了与目的片段相差79bp的竞争片段，用于竞争性RT-PCR。为防止样品RT效率的差异，本文用GAPDH的表达作RT效率的校正。因此，本方法较可靠，简便易行，是方法学上的创新。
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本研究结果表明，AngⅡ可刺激血管外膜成纤维细胞α2(I)前胶原mRNA的表达，且随着浓度的增大，其作用亦增强，与蛋白水平的研究结果相一致，由此推测AngⅡ刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成的机制与其在转录水平刺激Ⅰ型胶原mRNA的表达有关。总之，血管紧张素Ⅱ可刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA的表达，由此提示血管外膜成纤维细胞可能参与血管壁胶原代谢的调节，为高血压血管重塑机制的研究及高血压的防治提供了新的思路。
[基金项目]卫生部基金资助
[参 考 文 献]
[1] Zhu DL, Herembert T, Marche P. Increased proliferation of adventitial fibroblasts from spontaneously hypertensive rat aorta [J]. J Hypertens, 1991, 9:1161～1168.
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[2] Zhu DL, Herembert T, Caruelle D, et al. Signaling mechanism of basic fibroblast growth factor in arterial cells from genetically hypertensive rat [J]. Am J Hypertens, 1994, 7: 351～356.
[3] Sun Y， Pamires F J A, Weber KT. Fibrosis of atria and great vessels in response to angiotensin Ⅱ or aldosterone infusion [J]. Cardiovasc Res,1997, 35: 138～147.
[4] Nicoletti A,Heudes D,Hinglais N,et al.Left ventricular fibrosis in renovascular hypertensive rats: effect of losartan and spironolactone [J].Hypertension, 1995,26:101～107.
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[5] Verrey F.Regulation of gene expression by aldosterone in tight epithelia [J]. Semin Nephrol, 1990,10:410～420.
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[7] Arribas SM, Hillier C, Gonzalez C, et al.Cellular aspects of vascular remodeling in hypertension revealed by confocal microscopy [J]. Hypertension, 1997,30:1455～1464.
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[收稿日期]1999-03-17 [修回日期]1999-09-03
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