胚胎干细胞体外分化为心肌细胞诱导因素的探讨
作者：刘兰英 杨琨 朱振宇 刘玉川 余细勇 银巍 马涧泉 顾军 汤建
单位：刘兰英 杨琨 朱振宇 刘玉川 余细勇 银巍 马涧泉 顾军 (中山医科大学分子医学研究中心， 广东 广州 510089)；汤建(北京医科大学基础心血管研究所，北京 100089)
关键词：胚胎；干细胞；心肌；基因表达
中国病理生理杂志000502
[摘 要] 目的：用胚胎干细胞(ESC)体外诱导分化为心肌细胞，从分子水平上研究早期心脏发育相关基因及其功能。方法：(1)胚胎干细胞的培养。(2)胚胎干细胞的分化培养。(3)被分化的心肌细胞鉴定：RNA的提取；心脏特异性引物的合成和RT-PCR反应；探针标记、纯化和比放射活性测定；RNA斑点杂交。结果：用最适条件培养液对ESC定向诱导分化，可使80%以上的ESC分化为心肌细胞。心肌细胞以同步的方式进行收缩。反转录PCR和斑点杂交的结果显示：心肌在早期发育就开始表达其特异性基因。结论：胚胎干细胞体外能诱导分化为心肌细胞。胎牛血清、二甲基亚砜和维甲酸的浓度及它们之间的组成不同，对ES细胞定向诱导为心肌细胞均有影响。最佳诱导条件是用2 nmol/L维甲酸、0.6%二甲基亚砜和20%胎牛血清组成的条件培养液。
, 百拇医药
[中图分类号] Q254 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0389-04
A study of inductive factors of embryonic stem cells differentiating into cardiac myocytes in vitro
LIU Lan-ying，YANG Kun，ZHU Zheng-yu, LIU Yu-chuan，YIN Wei1, MA Jian-quan, GU Jun
(The Recearch Cernter of Molecular Medicine, SUN Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
, 百拇医药
TANG Jian
(Cardiovascular Basic Institute, Beijing University of Medical Sciences, Beijing 100089, China)
YU Xi-yong
( Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People Hospital, Guangzhou 510080, China)
[Abstract] AIM: To study cellular and molecular mechanisms of cardiac development associated genes expression and its function during early stage cardiomyogenesis. METHODS: (1) Mouse embryonic stem cells (ESC) line D3 culture.(2) Inductive culture of ESC differentiated into cardiac myocytes in vitro. (3) Identification of ESC-derived cardiac myocytes: RNA isolation; synthesis of specific primer and RT-PCR; Label of RT-PCR products with [α-32P] dATP as probes, purifyed by sephadex G-50 columns, determined the yield of DNA. RNA dot hybridization. RESULTS: 80% of ESC differentiated into cardiomyocytes by improved conditional medium. Cardiomyocytes contracted in a synchronous manner. The results of RT-PCR and RNA blot showed that cardiac genes were expressed abundantly and specifically during the early cardiomyogenesis. CONCLUSIONS: ESC were able to be differentiate into cardiomyocytes. Different concentrations and components of RA, DMSO and FCS affected ESC cardiomyogenesis in vitro. The optimal result obtained was from the conditional medium, a mixturce of 2 nmol/L retinoic acid (RA), 0.6% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 20% fetal calf serum (FCS).
, 百拇医药
[MeSH] Embryonic; Stem cell; Myocardium; Gene expression
鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)是高度未分化的多潜能干细胞，能在体外自然分化为内脏卵黄囊、血岛、神经细胞、心肌细胞等[1]。ESC的建立使体外心肌发生的模型构建成为可能，为后来者研究各种器官的发生、相关基因的转录调控作用及信号传导方面拓宽了领域。90年代初，国外学者开始将ESC分化为心肌细胞，建立了体外心肌发生模型[2]，使不少学者研究体外心脏形成、早期心脏发育相关基因及其功能机制[3,4]、先天性心脏病的发病机制和干预性治疗成为可能，但至今为此，ESC分化为心肌细胞的比率并不理想。在国内这方面的研究不多，目前还未见有将ESC诱导分化为心肌细胞的报道。本研究综合前人的方法，探讨最佳ESC诱导分化为心肌细胞的因素。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、材料
(一)ESC-D3本校病理教研室提供。
(二)昆明鼠 本校动物中心提供。
(三)主要试剂 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)\,TRIZOL试剂、Sephadex G-50购于Gibco公司，β-巯基乙醇购于SERVA公司，反转录PCR试剂盒购于BOEHRINGER MANNHEIM公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)\,维甲酸
(retinoic acid, RA)\,甲酰胺、甲醛、水溶性聚蔗糖、聚乙烯吡咯酮(polyvinylpyrrolidone),鲑鱼精DNA购于Sigma公司，胎牛血清(fetal calf serum,FCS)购于Hyclone公司。
, 百拇医药 (四)引物：β-actin和β-MHC.β-actin引物其上游序列为5′-GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3′，下游序列为5′-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3′;β-MHC引物其上游序列为5′-ATCAAGGAGCTCACCTACCAG-3′，下游序列为5′-TCGACAATGTGTCCGAGGTC-3′，均由Gibco公司合成。
二、方法
(一)ESC-D3的培养[5] ESC需在鼠胚饲养层上生长才能保持未分化特性。饲养层是用13～15 d的鼠胚成纤维细胞制成，并用10 μg/mL的丝裂霉素处理1.5 h。ESC所用的培养液(medium)为高糖的DMEM，其内含有0.1 mmol/L β-巯基乙醇、10%的小牛血清和10%胎牛血清(FCS)。每隔2 d换1次培养液和1次饲养层。
(二)条件培养液的制备和ESC诱导分化培养[6～8]
, 百拇医药
1.条件培养液的制备 按RA、DMSO和FCS浓度不同分为3部分，每1部分以其中1种浓度变化而其它两种不变分为10个组，每组按下列不同浓度和组成进行：(0～0.9)%DMSO、0～9 nmol/L维甲酸、和(10～28)%FCS溶于含有0.1 mmol/L β-巯基乙醇、pH 7.4的DMEM溶液中。
2.ESC悬浮培养 ESC在除去饲养层的条件培养液中进行诱导分化。将ESC制成悬滴(每个悬滴含200～400个ESC)置平皿盖内面(底面平皿内含有少量PBS溶液)进行培养，两天后形成细胞集落称为胚胎体(embryoid bodies, EBs)，将EBs转入直径是100 mm平皿内悬浮培养5 d(共7 d)。每组制备30个悬滴。
3.EBs贴壁培养 首先用明胶处理盖玻片，然后置入24孔板中，再把每个EBs分别放在各个孔里的盖玻片上，加少量培养液于37℃温育4～5 h，以便EBs贴壁。贴壁后加适量培养液(每3 d换1次)，此时“7+0 d”开始用倒置显微镜(25～100倍)每日进行观察，以捕获心肌开始跳动的最初时间及连接收缩的总时间。
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(三)心肌细胞RNA的提取 收集不同收缩时间的心肌细胞，分别提取总RNA。1×107心肌细胞加1 mL TRIZOL充分混匀，加0.2 mL的氯仿混匀、离心、取上清，加等体积的异丙醇混匀、离心，沉淀用75%的乙醇洗涤。具体过程参照TRIZOL Reagent说明书。
(四)引物设计和反转录PCR 设计β-actin引物和心脏特异性β-MHC引物，用它们分别对不同时间分化而来的心肌细胞RNA进行反转录PCR。0.2 mL薄壁管中加下列主要试剂：0.2 mmol/L的脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物，5 U RNA抑制剂，分别加4 μmol/L上下游引物，1 μg RNA模板，1 μL酶混合物等总体积50 μL于55℃温育40 min,95℃变性4 min，然后94℃ 30 s,58℃30 s，68℃90 s，35个循环。具体过程参照TitanTM one tube RT-PCR kit说明书。
(五)探针的标记、纯化和比放射活性测定 反转录PCR产物在DNA聚合酶1 Klenow大片段作用下，用[α-32P]dATP标记为探针，sephadex G-50层析柱纯化，三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)沉淀法测其比放射活性。具体过程参照Sambrook等[9]的方法。
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(六)RNA斑点杂交 收集未分化的ESC和分化不同收缩时间的心肌细胞，分别提取其总RNA，用BioRad真空抽吸仪将RNA点到Bio dyNEB尼龙膜上，室温凉干，80℃烘干1 h。用上述探针分别与含有样本RNA的尼龙膜进行杂交，杂交液含有甲酰胺、水溶性聚蔗糖、聚乙烯吡咯酮等，预杂交于42℃杂交2 h，杂交时加入探针于42℃杂交16 h。然后进行洗膜和放射性自显影[10]。
结 果
一、不同浓度的RA、DMSO和FCS对ESC向心肌细胞分化的影响
ESC是高度未分化的具有典型形态的多潜能干细胞(图1)。在实验过程中，设计不同条件培养液，分析它们对ESC定向分化的影响。按RA、DMSO和FCS浓度不同分为3部分，第一部分RA浓度不同(0～9 nmol/L)而DMSO(0.6%)和FCS(20%)不变分为10个组，第二部分DMSO浓度不同(0～0.9%)而RA(2 nmol/L)和FCS(20%)不变分为10个组，第三部分FCS浓度不同(10%～28%，每组相隔2%)而RA(2 nmol/L)和DMSO(0.6%)不变分为10个组。每组结果均来自于30个悬滴中分化为心肌细胞的胚胎体平均百分数(embryoid bodies with beating cardiac myocytes %)。图2显示上述3部分结果。从图可见，第一部分的第1组未加RA，仅加了0.6% DMSO和20%的FCS，分化效率为67%，影响不明显；第二部分的第1组未加DMSO，仅加了2 nmol/L RA和20%的FCS，分化效率为43%，影响较大；第三部分在FCS浓度低(10%左右)的条件下加两种诱导剂，其诱导效率仅有21%。由此可知不同浓度的RA、DMSO和FCS对ESC的分化均有影响，尤其是胎牛血清的浓度影响最大。2 nmol/L RA、0.6% DMSO和20% FCS组成的条件培养液对ESC诱导分化效果最佳。我们用此条件培养液将80%以上的ESC定向诱导为心肌细胞。心肌细胞体形状类似半球体，在倒置显微镜下可观察到一个收缩中心(图3)。EBs贴壁后第1 d即“7+1 d”开始跳动，跳动频率最高为148 beats/min，最低为53 beats/min，持续跳动的时间最长为57 d，最短为8 d。
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二、心肌细胞β-MHC的表达
以分化“7+2 d”心肌细胞的RNA为模板，用β-actin和β-MHC为引物进行RT-PCR扩增，大小片段分别为237 bp和688 bp(图4)。RT-PCR产物用[α-32P]dATP标记为特异探针(比放射性为2×107 counts.min-1.μg-1 DAN)分别与分化“7+2，4，6，8，10 d”心肌细胞的总RNN进行杂交(图5)。
讨 论
ESC是高度未分化的多潜能干细胞，能在体外向各个细胞系分化。我们在前人的基础上进一步改进，通过用RA、DMSO和FCS的不同浓度和组成比例对ESC向心肌细胞的诱导分化进行比较，经过大量的实验发现：FCS、RA和DMSO的浓度过低或过高或他们之间组成比例不同均能影响ESC向心肌细胞的分化，而2 nmol/L RA\,0.6% DMSO和20% FCS的浓度和组成是最佳的诱导条件。我们用此条件培养液可将80%以上的ESC定向诱导分化为心肌细胞，并使其存活达57 d之久。
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Fig 1 Morphological characterization of ESC-D3 cultivated on feeder layer(×100)
图1 未分化的ESC-D3的形态学特征
Fig 2 Influence of different concentrations and components of RA, DMSO and FCS on ESC inductive differentiation
图2 不同浓度和组成的RA，DMSO和FCS对ESC诱导分化的影响
Fig 3 Morphological characterization of beating aggregate of ESC-derived cardiomyocytes(×100)
, 百拇医药
图3 心肌细胞集落的形态学特征
Fig 4 Analysis of RT-PCR by using β-MHC and β actin of ESC-derived cardiomyocytes (1.2% agrose gel electrophoresis)
Lane 1: β-MHC(688 bp); Lane 2: β-actin (237 bp); Lane 3: 100 bp marker
图4 ESC分化的心肌细胞β-MHC和β actin的RT-PCR分析
Fig 5 Analysis of RNA dot hybridization of ESC-derived cardiomyocytes
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dot 1. negative control; dot 2～6. 10μg each of beating cardiomyocytes RNA from “7+2，4，6，8，10d”，respectively
图5 ESC分化的心肌细胞RNA斑点杂交分析
被诱导的心肌细胞的判定除常规指标外，我们还用了心脏特异性引物β-MHC对不同收缩时间的心肌细胞总RNA进行RT-PCR扩增和RNA斑点杂交，发现该心肌细胞不仅具有正常心肌细胞的特性，而且在分化早期就高度地表达心脏特异性基因。因此，胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞体系的建立，为研究早期心脏发育相关基因及其转录调控作用、了解先天性心脏病的发病机制和基因治疗打下基础。
[基金项目] 国家攀登计划基金资助
[参 考 文 献]
, 百拇医药
[1] Doetschman TC, Eistetter H, Kemler R, et al. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium [J]. J Embryol Exp Morph, 1985,87:27～45.
[2] Robbins J, Doetschman T, Jones WK, et al. Embryonic stem cell as a model for cardiogenesis[J]. Trends Cardiovasc Med, 1992,2:44～50.
[3] Moreadith RW, Radford NB. Gene targeting in embryonic stem cells: the new physiology and metabolism [J]. J Mol Med, 1997,75(3):208～217.
, 百拇医药
[4] Metzger JM, Lin WI, Johnston RA, et al. Myosin heavy chain expression in contracting myocytes isolated during embryonic stem cell cardiogenesis [J]. Circ Res, 1995,76(5):710～719.
[5] 胡新立，尚克刚.6个小鼠ES细胞系的建立和鉴定[J]. 北京大学学报，1996，32(2)：248～252.
[6] Wobus AM, Wallukat G, Hescheler J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers [J]. Differentiation, 1991,48:173～182.
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[7] Metzger JM, Lin WI, Samuelson LC. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells [J]. J Cell Biol, 1994,126(3):701～711.
[8] Xu CH, Liguori G, Adamson ED, et al. Specific arrest of cardiogenesis in cultured ES cells lacking cripto-1 [J]. Dev Biol, 1998,196(2):237～247.
[9] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning [M]. A laboratory manual. 2 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 372～374.
[10] 胡晓年，李德春，方福德.核酸分子杂交[M]. 卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术. 第1版. 北京：高等教育出版社，1993.198～238.
[收稿日期]1999-07-08 [修回日期]1999-10-08
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单位：刘兰英 杨琨 朱振宇 刘玉川 余细勇 银巍 马涧泉 顾军 (中山医科大学分子医学研究中心， 广东 广州 510089)；汤建(北京医科大学基础心血管研究所，北京 100089)
关键词：胚胎；干细胞；心肌；基因表达
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[摘 要] 目的：用胚胎干细胞(ESC)体外诱导分化为心肌细胞，从分子水平上研究早期心脏发育相关基因及其功能。方法：(1)胚胎干细胞的培养。(2)胚胎干细胞的分化培养。(3)被分化的心肌细胞鉴定：RNA的提取；心脏特异性引物的合成和RT-PCR反应；探针标记、纯化和比放射活性测定；RNA斑点杂交。结果：用最适条件培养液对ESC定向诱导分化，可使80%以上的ESC分化为心肌细胞。心肌细胞以同步的方式进行收缩。反转录PCR和斑点杂交的结果显示：心肌在早期发育就开始表达其特异性基因。结论：胚胎干细胞体外能诱导分化为心肌细胞。胎牛血清、二甲基亚砜和维甲酸的浓度及它们之间的组成不同，对ES细胞定向诱导为心肌细胞均有影响。最佳诱导条件是用2 nmol/L维甲酸、0.6%二甲基亚砜和20%胎牛血清组成的条件培养液。
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[中图分类号] Q254 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0389-04
A study of inductive factors of embryonic stem cells differentiating into cardiac myocytes in vitro
LIU Lan-ying，YANG Kun，ZHU Zheng-yu, LIU Yu-chuan，YIN Wei1, MA Jian-quan, GU Jun
(The Recearch Cernter of Molecular Medicine, SUN Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
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TANG Jian
(Cardiovascular Basic Institute, Beijing University of Medical Sciences, Beijing 100089, China)
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( Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People Hospital, Guangzhou 510080, China)
[Abstract] AIM: To study cellular and molecular mechanisms of cardiac development associated genes expression and its function during early stage cardiomyogenesis. METHODS: (1) Mouse embryonic stem cells (ESC) line D3 culture.(2) Inductive culture of ESC differentiated into cardiac myocytes in vitro. (3) Identification of ESC-derived cardiac myocytes: RNA isolation; synthesis of specific primer and RT-PCR; Label of RT-PCR products with [α-32P] dATP as probes, purifyed by sephadex G-50 columns, determined the yield of DNA. RNA dot hybridization. RESULTS: 80% of ESC differentiated into cardiomyocytes by improved conditional medium. Cardiomyocytes contracted in a synchronous manner. The results of RT-PCR and RNA blot showed that cardiac genes were expressed abundantly and specifically during the early cardiomyogenesis. CONCLUSIONS: ESC were able to be differentiate into cardiomyocytes. Different concentrations and components of RA, DMSO and FCS affected ESC cardiomyogenesis in vitro. The optimal result obtained was from the conditional medium, a mixturce of 2 nmol/L retinoic acid (RA), 0.6% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 20% fetal calf serum (FCS).
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[MeSH] Embryonic; Stem cell; Myocardium; Gene expression
鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)是高度未分化的多潜能干细胞，能在体外自然分化为内脏卵黄囊、血岛、神经细胞、心肌细胞等[1]。ESC的建立使体外心肌发生的模型构建成为可能，为后来者研究各种器官的发生、相关基因的转录调控作用及信号传导方面拓宽了领域。90年代初，国外学者开始将ESC分化为心肌细胞，建立了体外心肌发生模型[2]，使不少学者研究体外心脏形成、早期心脏发育相关基因及其功能机制[3,4]、先天性心脏病的发病机制和干预性治疗成为可能，但至今为此，ESC分化为心肌细胞的比率并不理想。在国内这方面的研究不多，目前还未见有将ESC诱导分化为心肌细胞的报道。本研究综合前人的方法，探讨最佳ESC诱导分化为心肌细胞的因素。
材 料 和 方 法
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一、材料
(一)ESC-D3本校病理教研室提供。
(二)昆明鼠 本校动物中心提供。
(三)主要试剂 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)\,TRIZOL试剂、Sephadex G-50购于Gibco公司，β-巯基乙醇购于SERVA公司，反转录PCR试剂盒购于BOEHRINGER MANNHEIM公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)\,维甲酸
(retinoic acid, RA)\,甲酰胺、甲醛、水溶性聚蔗糖、聚乙烯吡咯酮(polyvinylpyrrolidone),鲑鱼精DNA购于Sigma公司，胎牛血清(fetal calf serum,FCS)购于Hyclone公司。
, 百拇医药 (四)引物：β-actin和β-MHC.β-actin引物其上游序列为5′-GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3′，下游序列为5′-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3′;β-MHC引物其上游序列为5′-ATCAAGGAGCTCACCTACCAG-3′，下游序列为5′-TCGACAATGTGTCCGAGGTC-3′，均由Gibco公司合成。
二、方法
(一)ESC-D3的培养[5] ESC需在鼠胚饲养层上生长才能保持未分化特性。饲养层是用13～15 d的鼠胚成纤维细胞制成，并用10 μg/mL的丝裂霉素处理1.5 h。ESC所用的培养液(medium)为高糖的DMEM，其内含有0.1 mmol/L β-巯基乙醇、10%的小牛血清和10%胎牛血清(FCS)。每隔2 d换1次培养液和1次饲养层。
(二)条件培养液的制备和ESC诱导分化培养[6～8]
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1.条件培养液的制备 按RA、DMSO和FCS浓度不同分为3部分，每1部分以其中1种浓度变化而其它两种不变分为10个组，每组按下列不同浓度和组成进行：(0～0.9)%DMSO、0～9 nmol/L维甲酸、和(10～28)%FCS溶于含有0.1 mmol/L β-巯基乙醇、pH 7.4的DMEM溶液中。
2.ESC悬浮培养 ESC在除去饲养层的条件培养液中进行诱导分化。将ESC制成悬滴(每个悬滴含200～400个ESC)置平皿盖内面(底面平皿内含有少量PBS溶液)进行培养，两天后形成细胞集落称为胚胎体(embryoid bodies, EBs)，将EBs转入直径是100 mm平皿内悬浮培养5 d(共7 d)。每组制备30个悬滴。
3.EBs贴壁培养 首先用明胶处理盖玻片，然后置入24孔板中，再把每个EBs分别放在各个孔里的盖玻片上，加少量培养液于37℃温育4～5 h，以便EBs贴壁。贴壁后加适量培养液(每3 d换1次)，此时“7+0 d”开始用倒置显微镜(25～100倍)每日进行观察，以捕获心肌开始跳动的最初时间及连接收缩的总时间。
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(三)心肌细胞RNA的提取 收集不同收缩时间的心肌细胞，分别提取总RNA。1×107心肌细胞加1 mL TRIZOL充分混匀，加0.2 mL的氯仿混匀、离心、取上清，加等体积的异丙醇混匀、离心，沉淀用75%的乙醇洗涤。具体过程参照TRIZOL Reagent说明书。
(四)引物设计和反转录PCR 设计β-actin引物和心脏特异性β-MHC引物，用它们分别对不同时间分化而来的心肌细胞RNA进行反转录PCR。0.2 mL薄壁管中加下列主要试剂：0.2 mmol/L的脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物，5 U RNA抑制剂，分别加4 μmol/L上下游引物，1 μg RNA模板，1 μL酶混合物等总体积50 μL于55℃温育40 min,95℃变性4 min，然后94℃ 30 s,58℃30 s，68℃90 s，35个循环。具体过程参照TitanTM one tube RT-PCR kit说明书。
(五)探针的标记、纯化和比放射活性测定 反转录PCR产物在DNA聚合酶1 Klenow大片段作用下，用[α-32P]dATP标记为探针，sephadex G-50层析柱纯化，三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)沉淀法测其比放射活性。具体过程参照Sambrook等[9]的方法。
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(六)RNA斑点杂交 收集未分化的ESC和分化不同收缩时间的心肌细胞，分别提取其总RNA，用BioRad真空抽吸仪将RNA点到Bio dyNEB尼龙膜上，室温凉干，80℃烘干1 h。用上述探针分别与含有样本RNA的尼龙膜进行杂交，杂交液含有甲酰胺、水溶性聚蔗糖、聚乙烯吡咯酮等，预杂交于42℃杂交2 h，杂交时加入探针于42℃杂交16 h。然后进行洗膜和放射性自显影[10]。
结 果
一、不同浓度的RA、DMSO和FCS对ESC向心肌细胞分化的影响
ESC是高度未分化的具有典型形态的多潜能干细胞(图1)。在实验过程中，设计不同条件培养液，分析它们对ESC定向分化的影响。按RA、DMSO和FCS浓度不同分为3部分，第一部分RA浓度不同(0～9 nmol/L)而DMSO(0.6%)和FCS(20%)不变分为10个组，第二部分DMSO浓度不同(0～0.9%)而RA(2 nmol/L)和FCS(20%)不变分为10个组，第三部分FCS浓度不同(10%～28%，每组相隔2%)而RA(2 nmol/L)和DMSO(0.6%)不变分为10个组。每组结果均来自于30个悬滴中分化为心肌细胞的胚胎体平均百分数(embryoid bodies with beating cardiac myocytes %)。图2显示上述3部分结果。从图可见，第一部分的第1组未加RA，仅加了0.6% DMSO和20%的FCS，分化效率为67%，影响不明显；第二部分的第1组未加DMSO，仅加了2 nmol/L RA和20%的FCS，分化效率为43%，影响较大；第三部分在FCS浓度低(10%左右)的条件下加两种诱导剂，其诱导效率仅有21%。由此可知不同浓度的RA、DMSO和FCS对ESC的分化均有影响，尤其是胎牛血清的浓度影响最大。2 nmol/L RA、0.6% DMSO和20% FCS组成的条件培养液对ESC诱导分化效果最佳。我们用此条件培养液将80%以上的ESC定向诱导为心肌细胞。心肌细胞体形状类似半球体，在倒置显微镜下可观察到一个收缩中心(图3)。EBs贴壁后第1 d即“7+1 d”开始跳动，跳动频率最高为148 beats/min，最低为53 beats/min，持续跳动的时间最长为57 d，最短为8 d。
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二、心肌细胞β-MHC的表达
以分化“7+2 d”心肌细胞的RNA为模板，用β-actin和β-MHC为引物进行RT-PCR扩增，大小片段分别为237 bp和688 bp(图4)。RT-PCR产物用[α-32P]dATP标记为特异探针(比放射性为2×107 counts.min-1.μg-1 DAN)分别与分化“7+2，4，6，8，10 d”心肌细胞的总RNN进行杂交(图5)。
讨 论
ESC是高度未分化的多潜能干细胞，能在体外向各个细胞系分化。我们在前人的基础上进一步改进，通过用RA、DMSO和FCS的不同浓度和组成比例对ESC向心肌细胞的诱导分化进行比较，经过大量的实验发现：FCS、RA和DMSO的浓度过低或过高或他们之间组成比例不同均能影响ESC向心肌细胞的分化，而2 nmol/L RA\,0.6% DMSO和20% FCS的浓度和组成是最佳的诱导条件。我们用此条件培养液可将80%以上的ESC定向诱导分化为心肌细胞，并使其存活达57 d之久。
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Fig 1 Morphological characterization of ESC-D3 cultivated on feeder layer(×100)
图1 未分化的ESC-D3的形态学特征
Fig 2 Influence of different concentrations and components of RA, DMSO and FCS on ESC inductive differentiation
图2 不同浓度和组成的RA，DMSO和FCS对ESC诱导分化的影响
Fig 3 Morphological characterization of beating aggregate of ESC-derived cardiomyocytes(×100)
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图3 心肌细胞集落的形态学特征
Fig 4 Analysis of RT-PCR by using β-MHC and β actin of ESC-derived cardiomyocytes (1.2% agrose gel electrophoresis)
Lane 1: β-MHC(688 bp); Lane 2: β-actin (237 bp); Lane 3: 100 bp marker
图4 ESC分化的心肌细胞β-MHC和β actin的RT-PCR分析
Fig 5 Analysis of RNA dot hybridization of ESC-derived cardiomyocytes
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dot 1. negative control; dot 2～6. 10μg each of beating cardiomyocytes RNA from “7+2，4，6，8，10d”，respectively
图5 ESC分化的心肌细胞RNA斑点杂交分析
被诱导的心肌细胞的判定除常规指标外，我们还用了心脏特异性引物β-MHC对不同收缩时间的心肌细胞总RNA进行RT-PCR扩增和RNA斑点杂交，发现该心肌细胞不仅具有正常心肌细胞的特性，而且在分化早期就高度地表达心脏特异性基因。因此，胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞体系的建立，为研究早期心脏发育相关基因及其转录调控作用、了解先天性心脏病的发病机制和基因治疗打下基础。
[基金项目] 国家攀登计划基金资助
[参 考 文 献]
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[收稿日期]1999-07-08 [修回日期]1999-10-08
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