血小板活化因子受体拮抗剂对实验性肾病综合征的疗效观察及机制探讨
作者：任国辉 李悦 叶任高
单位：任国辉 李悦 (广州医学院第二附属医院， 广东 广州 510360)；叶任高(中山医科大学肾脏研究所，广东 广州 510089)
关键词：血小板活化因子；肾变病；肿瘤坏死因子
中国病理生理杂志000525
[摘 要] 目的：探讨血小板活化因子受体拮抗剂对实验性肾病综合征的疗效及机制。方法： 实验大鼠均复制成阿霉素(ADR)肾病模型,分为2组:ADR肾病组和ADR肾病+血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂(BN52021)组。结果： ADR肾病+BN52021组大鼠各期尿蛋白量、血清总蛋白下降幅度、血清胆固醇上升幅度均显著低于ADR肾病组(P<0.05),第21 d时血清肌酐含量显著低于ADR肾病组(P<0.05);电镜下肾组织病理改变显著轻于ADR肾病组。ADR肾病组中,肾皮质PAF最大产量在14 d(先于最大蛋白尿量),而肿瘤坏死因子(TNFα)最大含量在21 d,而且, ADR肾病+BN52021组肾皮质内PAF、TNFα含量显著低于ADR肾病组。结论： PAF可能直接或间接通过刺激肾小球固有细胞(肾小球系膜细胞、上皮细胞等)产生TNF导致肾小球损伤,PAF拮抗剂可能通过抑制肾皮质内PAF、TNFα合成,而减轻肾小球损伤。
, 百拇医药
[中图分类号] R692 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0466-03
[MeSH] Platelet activating factor; Nephrosis; Tumor necrosis factor
血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)是体内一种具有多种生物活性、作用广泛的炎症介质。研究表明,PAF能参与肾小球疾病的致病[1]。研究中,用PAF受体拮抗剂BN52021影响阿霉素(adriamycin,ADR)肾病大鼠,观察其疗效和其对肾皮质内PAF、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNFα)含量的影响,并探讨其机理。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、实验动物
SD雄性大鼠,体重180～220 g,共40只。
二、ADR肾病模型
给大鼠尾静脉1次性注射ADR(购自意大利Carlo Erba公司) 6 mg/kg体重。
三、PAF受体拮抗剂
BN52021(法国Institut Henri Beaufour公司Braquet博士惠赠),每支5 mg/mL。
四、实验分组
通过尾静脉给大鼠注射ADR后,随机分为两组:
(一) ADR肾病+BN52021组(20只) 在注射ADR造模型的当天开始,腹腔注射BN52021,10 mg/kg鼠重,每日2次,直至大鼠被处死。
, 百拇医药
(二) ADR肾病组(20只) 仅注射同等剂量的等渗盐水以代替BN52021。
五、主要观察指标
(一)尿蛋白定量测定 采用考马斯亮蓝微量法测定。两组均于尾静脉注射ADR后0、7、14、21 d，收集24 h尿液各测1次。
(二) 血清总蛋白、胆固醇、肌酐测定 两组均于尾静脉注射ADR后0、7、14、21 d，通过大鼠眶底静脉取血，测定血清总蛋白、胆固醇含量，21 d时颈静脉放血处死大鼠取血清测肌酐含量。各指标均由日立7170全自动生化分析仪测定。
(三) 肾皮质PAF、TNFα含量测定 在尾静脉注射ADR后7、14、21 d每组分别随机选5只大鼠处死，无菌操作，生理盐水灌注冲洗肾脏后，取肾皮质测定PAF、TNFα含量。
PAF含量测定采用血小板聚集生物活性法，即在肾皮质组织精确称重后，进行匀浆，用氯仿、甲醇混合液抽取肾皮质匀浆中的脂质，用薄层层析法分离出PAF，以血小板聚集仪测定其含量[2]。肾皮质匀浆中TNFα含量测定采用放射免疫法(按试剂盒操作说明书步骤操作,试剂盒由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供)。
, 百拇医药
(四)肾脏组织学检查 在实验第21 d颈静脉放血处死大鼠,取肾组织分别作免疫荧光,光镜和电镜检查。
结 果
一、24 h尿蛋白定量(表1)
结果表明，ADR肾病+BN52021组尿蛋白量在0、7、14、21 d时均显著低于ADR肾病组(P<0.05)。
表1 两组大鼠24h尿蛋白量变化
Tab 1 The amounts of urinary protein in 24 hours(
±s, mg/24 h) Group
Exp.day:
, http://www.100md.com
Amounts of urinary protein
0(n=20)
7(n=20)
14(n=15)
21(n=10)
ADR
5.2±1.2
24.6±4.9
62.8±10.4
172.8±12.4
ADR+BN52021
, http://www.100md.com 5.1± 1.0
16.2±4.2**
27.2±7.1**
32.2± 7.4**
**P<0.01, vs ADR group
二、血清总蛋白、胆固醇、肌酐含量测定
结果表明：ADR肾病+BN52021组血清总蛋白下降幅度，血清胆固醇升高幅度显著低于ADR肾病组(P<0.05)(表2);第21 d处死时ADR肾病+BN52021组血清肌酐为53±0.7 μmol/L,ADR肾病组为89.0±0.8 μmol/L,ADR肾病+BN52021组升高幅度显著低于ADR肾病组(P<0.05)。
, 百拇医药
表2 两组大鼠血清总蛋白、胆固醇含量变化
Tab 2 The amounts of serum total protein and cholesterol(±s) Exp. day
Total protein(g/L)
Cholesterol(mmol/L)
ADR
ADR+BN52021
ADR
ADR+BN52021
0
, 百拇医药
63.28±4.22
62.31±3.24
1.14±0.26
1.17±0.26
7
52.76±3.61
61.83±3.12*
4.01±0.53
1.35±0.31**
14
48.33±2.71
, http://www.100md.com
63.62±4.09**
4.81±0.73
1.51±0.36**
21
43.29±2.63
60.24±3.02**
5.30±0.94
1.61±0.42**
*P<0.05, **P<0.01, vs ADR group
三、肾皮质组织PAF、TNFα含量测定(表3)
, http://www.100md.com
结果表明,ADR肾病组大鼠7、14、21 d时肾皮质内PAF、TNFα含量均显著升高,其中肾皮质内PAF含量在14 d时最大(前于最大尿蛋白量时),而TNFα含量在21 d时最大,PAF含量升高出现在最大TNFα含量和尿蛋白量之前。ADR肾病+BN52021组各期肾皮质内PAF、TNFα含量均显著少于ADR肾病组(P<0.05)。
表3 两组大鼠肾皮质组织PAF、TNFα含量变化
Tab 3 The amounts of PAF, TNFα in the renal cortex (±s) Exp. day
PAF(pg/g)
TNFα(pg/mg)
, http://www.100md.com ADR
ADR+BN52021
ADR
ADR+BN52021
7
160.0±28.0
20.0± 7.2**
62.6±4.6
32.4±2.1**
14
280.0±46.2
60.0±14.2**
, 百拇医药
69.1±11.2
36.4±2.1**
21
190.0±34.4
30.0± 9.8**
131.6±31.2
34.2±2.2**
**P<0.01, vs ADR group
四、肾脏组织学检查
免疫荧光、光镜检查两组均未见明显病变,电镜检查见ADR肾病组肾小球上皮细胞足突肿胀、倒伏、融合，而ADR肾病+BN52021组未见明显病变。
, 百拇医药
讨 论
在本研究中,我们观察到PAF受体特异性拮抗剂BN52021治疗ADR肾病大鼠,可显著减少蛋白尿,升高血清总蛋白,降低血清胆固醇、肌酐和改善肾脏组织学病变。并发现,PAF受体拮抗剂BN52021可显著减少肾皮质组织内PAF、TNFα含量。
既往对PAF在肾脏组织损伤中的作用方面研究,大多是针对补体依赖性、浸润性肾小球肾炎[3]。近年来对PAF在非浸润性肾病中的作用,越来越引起学者们的关注,Perico等[4]发现,当将PAF注射至兔腹主动脉或离体鼠肾时,可增强血管通透性,改变肾小球滤过屏障大小和电荷选择性,而加重蛋白尿;并认为其机制可能是直接作用于肾小球毛细血管壁,或间接通过诱导细胞产生其它炎症介质,而由此加重组织损伤。TNFα是一种具有广泛生物学活性的细胞因子,肾小球固有细胞(系膜细胞、上皮细胞等)在受刺激时,能合成TNFα;微小病变肾病活动期病人和动物模型中,血清TNFα水平升高,肾小球内TNFmRNA表达明显增加[5],所以,TNFα可能参与该肾病大量蛋白尿的发病机制。体外研究已经建立起PAF与TNFα之间的相互作用,PAF能刺激单核巨噬细胞产生TNFα,而TNFα也可诱导多种细胞(包括单核巨噬细胞、多核白细胞、内皮细胞和系膜细胞)合成PAF,给实验大鼠使用TNFα,可复现灌注PAF的表现。
, 百拇医药
已有资料表明,PAF是肾小球损伤早期释放的炎症介质,而在本研究中,我们观察到,ADR肾病大鼠肾皮质中PAF含量升高,先于肾皮质TNFα含量和尿蛋白量升高,而且,使用PAF拮抗剂干扰ADR肾病大鼠,明显降低肾皮质内PAF和TNFα合成,其与肾小球损伤减轻相平行。这些发现表明,以肾小球内无炎症细胞浸润为特征的ADR肾病早期,产生的PAF能促使肾小球固有细胞合成TNFα,加重肾小球损伤。PAF直接或间接通过释放TNFα,而导致肾小球损伤加重。PAF受体拮抗剂通过抑制肾皮质内的PAF、TNFα的合成,而减轻肾小球损伤。
[基金项目] 广东省自然科学基金资助(No.980462)
[参 考 文 献]
[1] Oritiz A, Gomez-Chiarri M, Lerma JL, et al. The role of platelet activating factor in experimental glomerular injury[J]. Lipids, 1991,26:1310～1318.
, 百拇医药
[2] Hanahan DJ. Platlet activating factor isolation, identification and assay[J]. Methods Biochem Anal, 1985, 31:195～201.
[3] 任国辉, 叶任高, 李幼姬, 等. 血小板活化因子受体拮抗剂干扰实验性肾炎的疗效观察及机理探讨[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志， 1996，5(1):9～11.
[4] Perico N, Remuzzi A, Dadan C, et al. Platelet activating factor alters glomerular barrier size selectivity for macromolecules in rats[J]. Am J Physiol, 1991, 261:F85～F94.
[5] Brennan DC, Yui MA, Wuthrich RP, et al. Tumor necrosis factor and IL-1 in New Zealand black/white mice. Enhanced gene expression and acceleration of renal injury[J]. J Immunol, 1989, 143:3470～3479.
[收稿日期]1999-09-01 [修回日期]1999-12-14
, http://www.100md.com
单位：任国辉 李悦 (广州医学院第二附属医院， 广东 广州 510360)；叶任高(中山医科大学肾脏研究所，广东 广州 510089)
关键词：血小板活化因子；肾变病；肿瘤坏死因子
中国病理生理杂志000525
[摘 要] 目的：探讨血小板活化因子受体拮抗剂对实验性肾病综合征的疗效及机制。方法： 实验大鼠均复制成阿霉素(ADR)肾病模型,分为2组:ADR肾病组和ADR肾病+血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂(BN52021)组。结果： ADR肾病+BN52021组大鼠各期尿蛋白量、血清总蛋白下降幅度、血清胆固醇上升幅度均显著低于ADR肾病组(P<0.05),第21 d时血清肌酐含量显著低于ADR肾病组(P<0.05);电镜下肾组织病理改变显著轻于ADR肾病组。ADR肾病组中,肾皮质PAF最大产量在14 d(先于最大蛋白尿量),而肿瘤坏死因子(TNFα)最大含量在21 d,而且, ADR肾病+BN52021组肾皮质内PAF、TNFα含量显著低于ADR肾病组。结论： PAF可能直接或间接通过刺激肾小球固有细胞(肾小球系膜细胞、上皮细胞等)产生TNF导致肾小球损伤,PAF拮抗剂可能通过抑制肾皮质内PAF、TNFα合成,而减轻肾小球损伤。
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[中图分类号] R692 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0466-03
[MeSH] Platelet activating factor; Nephrosis; Tumor necrosis factor
血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)是体内一种具有多种生物活性、作用广泛的炎症介质。研究表明,PAF能参与肾小球疾病的致病[1]。研究中,用PAF受体拮抗剂BN52021影响阿霉素(adriamycin,ADR)肾病大鼠,观察其疗效和其对肾皮质内PAF、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNFα)含量的影响,并探讨其机理。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、实验动物
SD雄性大鼠,体重180～220 g,共40只。
二、ADR肾病模型
给大鼠尾静脉1次性注射ADR(购自意大利Carlo Erba公司) 6 mg/kg体重。
三、PAF受体拮抗剂
BN52021(法国Institut Henri Beaufour公司Braquet博士惠赠),每支5 mg/mL。
四、实验分组
通过尾静脉给大鼠注射ADR后,随机分为两组:
(一) ADR肾病+BN52021组(20只) 在注射ADR造模型的当天开始,腹腔注射BN52021,10 mg/kg鼠重,每日2次,直至大鼠被处死。
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(二) ADR肾病组(20只) 仅注射同等剂量的等渗盐水以代替BN52021。
五、主要观察指标
(一)尿蛋白定量测定 采用考马斯亮蓝微量法测定。两组均于尾静脉注射ADR后0、7、14、21 d，收集24 h尿液各测1次。
(二) 血清总蛋白、胆固醇、肌酐测定 两组均于尾静脉注射ADR后0、7、14、21 d，通过大鼠眶底静脉取血，测定血清总蛋白、胆固醇含量，21 d时颈静脉放血处死大鼠取血清测肌酐含量。各指标均由日立7170全自动生化分析仪测定。
(三) 肾皮质PAF、TNFα含量测定 在尾静脉注射ADR后7、14、21 d每组分别随机选5只大鼠处死，无菌操作，生理盐水灌注冲洗肾脏后，取肾皮质测定PAF、TNFα含量。
PAF含量测定采用血小板聚集生物活性法，即在肾皮质组织精确称重后，进行匀浆，用氯仿、甲醇混合液抽取肾皮质匀浆中的脂质，用薄层层析法分离出PAF，以血小板聚集仪测定其含量[2]。肾皮质匀浆中TNFα含量测定采用放射免疫法(按试剂盒操作说明书步骤操作,试剂盒由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供)。
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(四)肾脏组织学检查 在实验第21 d颈静脉放血处死大鼠,取肾组织分别作免疫荧光,光镜和电镜检查。
结 果
一、24 h尿蛋白定量(表1)
结果表明，ADR肾病+BN52021组尿蛋白量在0、7、14、21 d时均显著低于ADR肾病组(P<0.05)。
表1 两组大鼠24h尿蛋白量变化
Tab 1 The amounts of urinary protein in 24 hours(
±s, mg/24 h) GroupExp.day:
, http://www.100md.com
Amounts of urinary protein
0(n=20)
7(n=20)
14(n=15)
21(n=10)
ADR
5.2±1.2
24.6±4.9
62.8±10.4
172.8±12.4
ADR+BN52021
, http://www.100md.com 5.1± 1.0
16.2±4.2**
27.2±7.1**
32.2± 7.4**
**P<0.01, vs ADR group
二、血清总蛋白、胆固醇、肌酐含量测定
结果表明：ADR肾病+BN52021组血清总蛋白下降幅度，血清胆固醇升高幅度显著低于ADR肾病组(P<0.05)(表2);第21 d处死时ADR肾病+BN52021组血清肌酐为53±0.7 μmol/L,ADR肾病组为89.0±0.8 μmol/L,ADR肾病+BN52021组升高幅度显著低于ADR肾病组(P<0.05)。
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表2 两组大鼠血清总蛋白、胆固醇含量变化
Tab 2 The amounts of serum total protein and cholesterol(
±s) Exp. dayTotal protein(g/L)
Cholesterol(mmol/L)
ADR
ADR+BN52021
ADR
ADR+BN52021
0
, 百拇医药
63.28±4.22
62.31±3.24
1.14±0.26
1.17±0.26
7
52.76±3.61
61.83±3.12*
4.01±0.53
1.35±0.31**
14
48.33±2.71
, http://www.100md.com
63.62±4.09**
4.81±0.73
1.51±0.36**
21
43.29±2.63
60.24±3.02**
5.30±0.94
1.61±0.42**
*P<0.05, **P<0.01, vs ADR group
三、肾皮质组织PAF、TNFα含量测定(表3)
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结果表明,ADR肾病组大鼠7、14、21 d时肾皮质内PAF、TNFα含量均显著升高,其中肾皮质内PAF含量在14 d时最大(前于最大尿蛋白量时),而TNFα含量在21 d时最大,PAF含量升高出现在最大TNFα含量和尿蛋白量之前。ADR肾病+BN52021组各期肾皮质内PAF、TNFα含量均显著少于ADR肾病组(P<0.05)。
表3 两组大鼠肾皮质组织PAF、TNFα含量变化
Tab 3 The amounts of PAF, TNFα in the renal cortex (
±s) Exp. dayPAF(pg/g)
TNFα(pg/mg)
, http://www.100md.com ADR
ADR+BN52021
ADR
ADR+BN52021
7
160.0±28.0
20.0± 7.2**
62.6±4.6
32.4±2.1**
14
280.0±46.2
60.0±14.2**
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69.1±11.2
36.4±2.1**
21
190.0±34.4
30.0± 9.8**
131.6±31.2
34.2±2.2**
**P<0.01, vs ADR group
四、肾脏组织学检查
免疫荧光、光镜检查两组均未见明显病变,电镜检查见ADR肾病组肾小球上皮细胞足突肿胀、倒伏、融合，而ADR肾病+BN52021组未见明显病变。
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讨 论
在本研究中,我们观察到PAF受体特异性拮抗剂BN52021治疗ADR肾病大鼠,可显著减少蛋白尿,升高血清总蛋白,降低血清胆固醇、肌酐和改善肾脏组织学病变。并发现,PAF受体拮抗剂BN52021可显著减少肾皮质组织内PAF、TNFα含量。
既往对PAF在肾脏组织损伤中的作用方面研究,大多是针对补体依赖性、浸润性肾小球肾炎[3]。近年来对PAF在非浸润性肾病中的作用,越来越引起学者们的关注,Perico等[4]发现,当将PAF注射至兔腹主动脉或离体鼠肾时,可增强血管通透性,改变肾小球滤过屏障大小和电荷选择性,而加重蛋白尿;并认为其机制可能是直接作用于肾小球毛细血管壁,或间接通过诱导细胞产生其它炎症介质,而由此加重组织损伤。TNFα是一种具有广泛生物学活性的细胞因子,肾小球固有细胞(系膜细胞、上皮细胞等)在受刺激时,能合成TNFα;微小病变肾病活动期病人和动物模型中,血清TNFα水平升高,肾小球内TNFmRNA表达明显增加[5],所以,TNFα可能参与该肾病大量蛋白尿的发病机制。体外研究已经建立起PAF与TNFα之间的相互作用,PAF能刺激单核巨噬细胞产生TNFα,而TNFα也可诱导多种细胞(包括单核巨噬细胞、多核白细胞、内皮细胞和系膜细胞)合成PAF,给实验大鼠使用TNFα,可复现灌注PAF的表现。
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已有资料表明,PAF是肾小球损伤早期释放的炎症介质,而在本研究中,我们观察到,ADR肾病大鼠肾皮质中PAF含量升高,先于肾皮质TNFα含量和尿蛋白量升高,而且,使用PAF拮抗剂干扰ADR肾病大鼠,明显降低肾皮质内PAF和TNFα合成,其与肾小球损伤减轻相平行。这些发现表明,以肾小球内无炎症细胞浸润为特征的ADR肾病早期,产生的PAF能促使肾小球固有细胞合成TNFα,加重肾小球损伤。PAF直接或间接通过释放TNFα,而导致肾小球损伤加重。PAF受体拮抗剂通过抑制肾皮质内的PAF、TNFα的合成,而减轻肾小球损伤。
[基金项目] 广东省自然科学基金资助(No.980462)
[参 考 文 献]
[1] Oritiz A, Gomez-Chiarri M, Lerma JL, et al. The role of platelet activating factor in experimental glomerular injury[J]. Lipids, 1991,26:1310～1318.
, 百拇医药
[2] Hanahan DJ. Platlet activating factor isolation, identification and assay[J]. Methods Biochem Anal, 1985, 31:195～201.
[3] 任国辉, 叶任高, 李幼姬, 等. 血小板活化因子受体拮抗剂干扰实验性肾炎的疗效观察及机理探讨[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志， 1996，5(1):9～11.
[4] Perico N, Remuzzi A, Dadan C, et al. Platelet activating factor alters glomerular barrier size selectivity for macromolecules in rats[J]. Am J Physiol, 1991, 261:F85～F94.
[5] Brennan DC, Yui MA, Wuthrich RP, et al. Tumor necrosis factor and IL-1 in New Zealand black/white mice. Enhanced gene expression and acceleration of renal injury[J]. J Immunol, 1989, 143:3470～3479.
[收稿日期]1999-09-01 [修回日期]1999-12-14
, http://www.100md.com