EB病毒LMP1表达对鼻咽癌细胞增殖及细胞周期分布的影响
作者：黄培春 梁洪英 邓惠华 蔡康荣 赵明伦
单位：黄培春 梁洪英(广东医学院病理生理教研室，广东 湛江 524023)；邓惠华(广东医学院病理教研室)；蔡康荣(广东医学院分析中心)；赵明伦(广东医学院病理生理教研室，广东 湛江 524023)
关键词：爱泼斯坦-巴尔病毒；鼻咽肿瘤；细胞系；细胞分裂；细胞周期
中国病理生理杂志000620
[摘 要] 目的：观察EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)表达对鼻咽癌细胞系增殖和细胞周期分布的作用。方法：用免疫组化(LSAB)法检测LMP1蛋白的表达；用MTT法测定鼻咽癌细胞系的增殖能力；用流式细胞术检测细胞周期的分布。结果：表达LMP1的鼻咽癌细胞系L-CNE1的OD值明显高于LMP1阴性的鼻咽癌细胞系V-CNE1和CNE1(P<0.001)。L-CNE1细胞系的G1期细胞百分率明显减少和S期细胞百分率明显增加，与V-CNE1和CNE1细胞系比较均有非常显著性差异(P<0.001)。而V-CNE1与CNE1细胞系之间各期细胞百分率则无明显差异(P>0.05)。结论：EBV-LMP1表达可使鼻咽癌细胞系细胞周期分布改变和增殖能力增强。
, 百拇医药
[中图分类号] R739.63 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0557-03
The effect of EBV latent membrane protein 1 on proliferation and cell cycle of nasopharyngeal carcinoma cells
HUANG Pei-chun, LIANG Hong-ying, DENG Hui-hua, CAI Kang-rong, ZHAO Ming-lun
(Department of Pathophysiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)
, 百拇医药 [Abstract] AIM:To investigate the effect of Epstain-Barr virus latent membrane protein 1 (EBV-LMP1) on proliferation and cell cycle of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells. METHODS:The expression of EBV-LMP1 was detected by immunohistochemical method (LSAB). Proliferation of NPC cells was identified by MTT method. Cell cycle percentage was detected by flow cytometry analysis. RESULTS: OD value of EBV-LMP1 expressive NPC cells L-CEN1 was much higher than that of both EBV-LMP1 negative NPC cells V-CEN1 and CNE1 (P<0.01). Compared with the cell cycle percentage in both V-CNE1 and CNE1, the percentage of G1 was significantly decreased and the percentage of S was much increased in L-CNE1 (P<0.01). But no obvious differences were observed in all cell cycle percentage between V-CNE1 and CNE1 (P>0.05).CONCLUSION:The expression of EBV-LMP1 on NPC cell might cause some change of cell cycle and enhance cell proliferation.
, http://www.100md.com
[MeSH] Epstein-Barr virus; Nasopharyngeal neoplasms; Cell line; Cell division; Cell cycle
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与鼻咽癌的发生、发展关系密切。EBV潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)是由EBV-LMP基因编码的产物，研究已证实它是EBV在鼻咽癌上皮细胞中表达的唯一与细胞转化有关的癌蛋白[1]。因此 LMP1 在鼻咽癌发病中的作用是目前鼻咽癌病因发病学研究中的热点。我们曾用LMP1基因真核表达质粒转染LMP1表达阴性的人高分化鼻咽癌细胞系CNE1，发现LMP1表达可促进鼻咽癌细胞系的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)自分泌和CNE1细胞生长[2]。本文进一步研究LMP1表达对鼻咽癌细胞系增殖和细胞周期分布的影响。
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材 料 和 方 法
一、细胞系与细胞培养
表达LMP1的鼻咽癌细胞系CNE1 (L-CNE1) 为段朝军等所制备，其质粒和转染方法见文献[2]。LMP1表达阴性的鼻咽癌细胞系CNE1，包括用不含LMP1基因质粒转染的CNE1(V-CNE1)和未转染的CNE1。以上细胞系用含15%小牛血清RPMI-1640培养液常规培养。
二、LMP1的检测
采用免疫组化法 (LSAB法) 。LMP1单克隆抗体及LSAB试剂盒均为Dake公司产品，单抗用Tris-HCl缓冲液(TBS)释稀，工作浓度为1∶40。消化、收集各种生长良好的贴壁细胞涂片，自然风干后用丙酮甲醇(1∶1)4℃固定10 min。用LMP1单抗，按LSAB试剂盒说明书操作，最后用苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察结果。以镜下所见明显的棕黄色颗粒为阳性。用TBS代替一抗作阴性对照。
, 百拇医药
三、细胞增殖能力的检测
用MTT法 。分别将5×104/mL的细胞L-CNE1、V-CNE1和CNE1加入96孔培养板，每孔100 μL，每种细胞分2组，每组设12个平行孔，其中一组于37℃、5%CO2培养4 h后加入MTT，另一组于37℃、5%CO2培养48 h后加入MTT，每孔10 μL MTT(5 mg/mL)。加MTT后继续培养4 h，加入DMSO，每孔100 μL，静置16 h 后用全自动酶标仪测定570 nm、630 nm波长的OD值，并按以下公式：
计算出每种细胞的平均OD值。每种细胞均同时测定含15%血清和无血清培养液培养的增殖能力。
四、细胞周期分布的检测
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用流式细胞仪分析法，参照文献[3]略加修改。贴壁细胞经胰酶消化、收获，用PBS洗2次，调细胞浓度为2×106/mL， 0.3 mL/管分装，每管加入PI染液(其中含PI 100 mg/L , RNase 100 mg/L , 0.1% Triton X-100 , 0.1%醋酸钠)0.7 mL 作用30 min, 用流式细胞仪(美国Coulter公司生产的EPLCSXL型)检测。
五、统计方法
实验数据用均数±标准差表示，用t检验判定均数差异显著性。
结 果
一、LMP1表达的检测结果
免疫组化检测结果显示，L-CNE1细胞系的LMP1呈强阳性反应，V-CNE1和CNE1细胞系均为阴性；而用TBS代替一抗的阴性对照组全为阴性。
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二、表达LMP1的鼻咽癌细胞系增殖能力的变化
表达LMP1的L-CNE1细胞系的增殖能力明显增强。无论在15%血清或在无血清培养条件下，L-CNE1的OD值均明显高于LMP1阴性的V-CNE1和CNE1细胞系(P<0.001)，而后两者在15%血清和无血清培养的OD值均无明显差异(表1)。
表1 LMP1表达对鼻咽癌细胞系增殖能力的影响
Tab 1 The effect of LMP1 expression on proliferative activity
of nasopharyngeal carcinoma cell lines(
±s，n=12) Cell lines
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OD value
15% serum culture
Serum-free culture
L-CNE1
3.04±0.22**
2.69±0.83**
V-CNE1
2.40±0.13
1.46±0.35
CNE1
2.43±0.12
, 百拇医药
1.51±0.61
**P<0.01, vs V-CNE1 and CNE1 groups
三、LMP1表达对鼻咽癌细胞周期分布的影响
表达LMP1的L-CNE1细胞系的细胞周期分布发生了明显的变化，在15%血清和无血清培养下其G1期细胞百分率均明显减少和S期细胞百分率均明显增加，与LMP1阴性的V-CNE1和CNE1细胞系比较均有非常显著差异(P<0.001)。但G2期细胞百分率无明显变化。V-CNE1与CNE1细胞系之间各期细胞百分率在15%血清和无血清培养下均无明显差异(表2)。
表2 LMP1表达对鼻咽癌细胞周期分布的影响
Tab 2 The effect of LMP1 expression on cell cycle of nasopharyngeal carcinoma cell lines(%，±s，n=5) Cell lines
, http://www.100md.com
15% serum culture
Serum-free culture
G1
S
G2
G1
S
G2
L-CNE1
71.7±2.8**
20.1±1.3**
, 百拇医药
8.2±0.9
69.7±1.3**
24.7±1.9**
5.6±1.2
V-CNE1
79.1±1.2
12.6±0.9
8.3±0.5
78.5±1.8
17.1±1.5
4.3±0.9
, 百拇医药 CNE1
78.9±1.5
12.2±1.1
8.9±0.7
80.7±2.1
15.7±1.6
4.0±1.1
**P<0.01, vs V-CNE1 and CNE1 groups讨 论
EB病毒LMP1是目前被证实在上皮细胞中表达的唯一具有癌基因编码蛋白特性的EB病毒基因产物，其在鼻咽癌发生、发展中的作用已经受到学者的关注。刘振声等[4]曾报道，用EB病毒反义LMP基因转染可抑制LMP表达阳性的人低分化鼻咽癌细胞系CNE-3的生长。最近，陈宜芳等[5]也报道，用LMP1基因转染永生化的人胚肾上皮细胞，可使该细胞的增殖能力增强。本文用MTT法检测经EBV-LMP1基因转染并表达LMP1的人高分化鼻咽癌上皮细胞系CNE1，结果发现表达LMP1的CNE1细胞系的OD值无论在15%血清或无血清培养条件下均明显高于非表达LMP1的CNE1细胞系(包括空白质粒转染和未转染的CNE1)。这进一步表明了LMP1在鼻咽癌细胞中表达可使其增殖能力增强。
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研究表明，细胞周期调控失调以致细胞周期异常而导致细胞增殖和生长失控，是肿瘤发生、发展的重要环节[6]。本实验结果显示，LMP1表达可使鼻咽癌细胞系CNE1的细胞周期分布发生明显改变，其改变特点为G1期细胞百分率明显减少，S期细胞百分率明显增加，而G2期细胞百分率则无明显变化。G1期细胞减少和S期细胞增加，说明细胞从静止状态进入分裂周期者增多，细胞增殖能力增强。因此LMP1在鼻咽癌细胞中表达引起细胞周期的改变可能是导致细胞增殖能力增强的重要原因。
本实验结果表明，EBV-LMP1表达可使鼻咽癌细胞周期分布发生改变，从而引起细胞的增殖能力增强，提示EBV-LMP1在鼻咽癌发生、发展中可能起重要作用。至于EBV-LMP1表达引起鼻咽癌细胞周期分布改变和增殖能力增强的机制，我们的研究[2]曾发现EBV-LMP1表达具有增加EGF自分泌作用，但其具体作用机制和环节尚待作进一步深入研究。
, 百拇医药
[基金项目] 广东省高教厅重点科研基金资助(高9502)
[参 考 文 献]
[1] Hu LF, Eugene RZ, Fu C, et al. Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus BNLF-1 gene (LMP1) from a Chinese nasopharyngeal carcinoma[J]. J Gen Viral, 1991, 72: 2399～2409.
[2] 段朝军，陈主初，赵明伦. EB病毒LMP与EGF自分泌在鼻咽癌细胞生长中的作用及其关系[J]. 湖南医科大学学报, 1997, 22 (6): 483～486.
[3] Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry[J]. J Immun Methods, 1991, 139: 271～279.
, 百拇医药
[4] 刘振声，李宝民，刘彦仿，等. EB病毒反义LMP基因对人低分化鼻咽癌CNE-3细胞株生长的抑制作用[J]. 中华耳鼻喉科杂志, 1996, 31 (2): 92～95.
[5] 陈宜芳，郭辉玉，汪慧民，等. 鼻咽癌细胞系SUNE中EBV-LMP1基因对上皮细胞增殖的影响[J]. 肿瘤, 1999, 19(1): 15～18.
[6] Laland HH, Micheal BK. Cell cycle control and cancer[J]. Science, 1994, 266: 1821～1828.
[收稿日期] 1999-09-08 [修回日期] 1999-12-17, 百拇医药
单位：黄培春 梁洪英(广东医学院病理生理教研室，广东 湛江 524023)；邓惠华(广东医学院病理教研室)；蔡康荣(广东医学院分析中心)；赵明伦(广东医学院病理生理教研室，广东 湛江 524023)
关键词：爱泼斯坦-巴尔病毒；鼻咽肿瘤；细胞系；细胞分裂；细胞周期
中国病理生理杂志000620
[摘 要] 目的：观察EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)表达对鼻咽癌细胞系增殖和细胞周期分布的作用。方法：用免疫组化(LSAB)法检测LMP1蛋白的表达；用MTT法测定鼻咽癌细胞系的增殖能力；用流式细胞术检测细胞周期的分布。结果：表达LMP1的鼻咽癌细胞系L-CNE1的OD值明显高于LMP1阴性的鼻咽癌细胞系V-CNE1和CNE1(P<0.001)。L-CNE1细胞系的G1期细胞百分率明显减少和S期细胞百分率明显增加，与V-CNE1和CNE1细胞系比较均有非常显著性差异(P<0.001)。而V-CNE1与CNE1细胞系之间各期细胞百分率则无明显差异(P>0.05)。结论：EBV-LMP1表达可使鼻咽癌细胞系细胞周期分布改变和增殖能力增强。
, 百拇医药
[中图分类号] R739.63 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0557-03
The effect of EBV latent membrane protein 1 on proliferation and cell cycle of nasopharyngeal carcinoma cells
HUANG Pei-chun, LIANG Hong-ying, DENG Hui-hua, CAI Kang-rong, ZHAO Ming-lun
(Department of Pathophysiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)
, 百拇医药 [Abstract] AIM:To investigate the effect of Epstain-Barr virus latent membrane protein 1 (EBV-LMP1) on proliferation and cell cycle of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells. METHODS:The expression of EBV-LMP1 was detected by immunohistochemical method (LSAB). Proliferation of NPC cells was identified by MTT method. Cell cycle percentage was detected by flow cytometry analysis. RESULTS: OD value of EBV-LMP1 expressive NPC cells L-CEN1 was much higher than that of both EBV-LMP1 negative NPC cells V-CEN1 and CNE1 (P<0.01). Compared with the cell cycle percentage in both V-CNE1 and CNE1, the percentage of G1 was significantly decreased and the percentage of S was much increased in L-CNE1 (P<0.01). But no obvious differences were observed in all cell cycle percentage between V-CNE1 and CNE1 (P>0.05).CONCLUSION:The expression of EBV-LMP1 on NPC cell might cause some change of cell cycle and enhance cell proliferation.
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[MeSH] Epstein-Barr virus; Nasopharyngeal neoplasms; Cell line; Cell division; Cell cycle
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与鼻咽癌的发生、发展关系密切。EBV潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)是由EBV-LMP基因编码的产物，研究已证实它是EBV在鼻咽癌上皮细胞中表达的唯一与细胞转化有关的癌蛋白[1]。因此 LMP1 在鼻咽癌发病中的作用是目前鼻咽癌病因发病学研究中的热点。我们曾用LMP1基因真核表达质粒转染LMP1表达阴性的人高分化鼻咽癌细胞系CNE1，发现LMP1表达可促进鼻咽癌细胞系的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)自分泌和CNE1细胞生长[2]。本文进一步研究LMP1表达对鼻咽癌细胞系增殖和细胞周期分布的影响。
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材 料 和 方 法
一、细胞系与细胞培养
表达LMP1的鼻咽癌细胞系CNE1 (L-CNE1) 为段朝军等所制备，其质粒和转染方法见文献[2]。LMP1表达阴性的鼻咽癌细胞系CNE1，包括用不含LMP1基因质粒转染的CNE1(V-CNE1)和未转染的CNE1。以上细胞系用含15%小牛血清RPMI-1640培养液常规培养。
二、LMP1的检测
采用免疫组化法 (LSAB法) 。LMP1单克隆抗体及LSAB试剂盒均为Dake公司产品，单抗用Tris-HCl缓冲液(TBS)释稀，工作浓度为1∶40。消化、收集各种生长良好的贴壁细胞涂片，自然风干后用丙酮甲醇(1∶1)4℃固定10 min。用LMP1单抗，按LSAB试剂盒说明书操作，最后用苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察结果。以镜下所见明显的棕黄色颗粒为阳性。用TBS代替一抗作阴性对照。
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三、细胞增殖能力的检测
用MTT法 。分别将5×104/mL的细胞L-CNE1、V-CNE1和CNE1加入96孔培养板，每孔100 μL，每种细胞分2组，每组设12个平行孔，其中一组于37℃、5%CO2培养4 h后加入MTT，另一组于37℃、5%CO2培养48 h后加入MTT，每孔10 μL MTT(5 mg/mL)。加MTT后继续培养4 h，加入DMSO，每孔100 μL，静置16 h 后用全自动酶标仪测定570 nm、630 nm波长的OD值，并按以下公式：
计算出每种细胞的平均OD值。每种细胞均同时测定含15%血清和无血清培养液培养的增殖能力。
四、细胞周期分布的检测
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用流式细胞仪分析法，参照文献[3]略加修改。贴壁细胞经胰酶消化、收获，用PBS洗2次，调细胞浓度为2×106/mL， 0.3 mL/管分装，每管加入PI染液(其中含PI 100 mg/L , RNase 100 mg/L , 0.1% Triton X-100 , 0.1%醋酸钠)0.7 mL 作用30 min, 用流式细胞仪(美国Coulter公司生产的EPLCSXL型)检测。
五、统计方法
实验数据用均数±标准差表示，用t检验判定均数差异显著性。
结 果
一、LMP1表达的检测结果
免疫组化检测结果显示，L-CNE1细胞系的LMP1呈强阳性反应，V-CNE1和CNE1细胞系均为阴性；而用TBS代替一抗的阴性对照组全为阴性。
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二、表达LMP1的鼻咽癌细胞系增殖能力的变化
表达LMP1的L-CNE1细胞系的增殖能力明显增强。无论在15%血清或在无血清培养条件下，L-CNE1的OD值均明显高于LMP1阴性的V-CNE1和CNE1细胞系(P<0.001)，而后两者在15%血清和无血清培养的OD值均无明显差异(表1)。
表1 LMP1表达对鼻咽癌细胞系增殖能力的影响
Tab 1 The effect of LMP1 expression on proliferative activity
of nasopharyngeal carcinoma cell lines(
±s，n=12) Cell lines, http://www.100md.com
OD value
15% serum culture
Serum-free culture
L-CNE1
3.04±0.22**
2.69±0.83**
V-CNE1
2.40±0.13
1.46±0.35
CNE1
2.43±0.12
, 百拇医药
1.51±0.61
**P<0.01, vs V-CNE1 and CNE1 groups
三、LMP1表达对鼻咽癌细胞周期分布的影响
表达LMP1的L-CNE1细胞系的细胞周期分布发生了明显的变化，在15%血清和无血清培养下其G1期细胞百分率均明显减少和S期细胞百分率均明显增加，与LMP1阴性的V-CNE1和CNE1细胞系比较均有非常显著差异(P<0.001)。但G2期细胞百分率无明显变化。V-CNE1与CNE1细胞系之间各期细胞百分率在15%血清和无血清培养下均无明显差异(表2)。
表2 LMP1表达对鼻咽癌细胞周期分布的影响
Tab 2 The effect of LMP1 expression on cell cycle of nasopharyngeal carcinoma cell lines(%，
±s，n=5) Cell lines, http://www.100md.com
15% serum culture
Serum-free culture
G1
S
G2
G1
S
G2
L-CNE1
71.7±2.8**
20.1±1.3**
, 百拇医药
8.2±0.9
69.7±1.3**
24.7±1.9**
5.6±1.2
V-CNE1
79.1±1.2
12.6±0.9
8.3±0.5
78.5±1.8
17.1±1.5
4.3±0.9
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78.9±1.5
12.2±1.1
8.9±0.7
80.7±2.1
15.7±1.6
4.0±1.1
**P<0.01, vs V-CNE1 and CNE1 groups讨 论
EB病毒LMP1是目前被证实在上皮细胞中表达的唯一具有癌基因编码蛋白特性的EB病毒基因产物，其在鼻咽癌发生、发展中的作用已经受到学者的关注。刘振声等[4]曾报道，用EB病毒反义LMP基因转染可抑制LMP表达阳性的人低分化鼻咽癌细胞系CNE-3的生长。最近，陈宜芳等[5]也报道，用LMP1基因转染永生化的人胚肾上皮细胞，可使该细胞的增殖能力增强。本文用MTT法检测经EBV-LMP1基因转染并表达LMP1的人高分化鼻咽癌上皮细胞系CNE1，结果发现表达LMP1的CNE1细胞系的OD值无论在15%血清或无血清培养条件下均明显高于非表达LMP1的CNE1细胞系(包括空白质粒转染和未转染的CNE1)。这进一步表明了LMP1在鼻咽癌细胞中表达可使其增殖能力增强。
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研究表明，细胞周期调控失调以致细胞周期异常而导致细胞增殖和生长失控，是肿瘤发生、发展的重要环节[6]。本实验结果显示，LMP1表达可使鼻咽癌细胞系CNE1的细胞周期分布发生明显改变，其改变特点为G1期细胞百分率明显减少，S期细胞百分率明显增加，而G2期细胞百分率则无明显变化。G1期细胞减少和S期细胞增加，说明细胞从静止状态进入分裂周期者增多，细胞增殖能力增强。因此LMP1在鼻咽癌细胞中表达引起细胞周期的改变可能是导致细胞增殖能力增强的重要原因。
本实验结果表明，EBV-LMP1表达可使鼻咽癌细胞周期分布发生改变，从而引起细胞的增殖能力增强，提示EBV-LMP1在鼻咽癌发生、发展中可能起重要作用。至于EBV-LMP1表达引起鼻咽癌细胞周期分布改变和增殖能力增强的机制，我们的研究[2]曾发现EBV-LMP1表达具有增加EGF自分泌作用，但其具体作用机制和环节尚待作进一步深入研究。
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[基金项目] 广东省高教厅重点科研基金资助(高9502)
[参 考 文 献]
[1] Hu LF, Eugene RZ, Fu C, et al. Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus BNLF-1 gene (LMP1) from a Chinese nasopharyngeal carcinoma[J]. J Gen Viral, 1991, 72: 2399～2409.
[2] 段朝军，陈主初，赵明伦. EB病毒LMP与EGF自分泌在鼻咽癌细胞生长中的作用及其关系[J]. 湖南医科大学学报, 1997, 22 (6): 483～486.
[3] Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry[J]. J Immun Methods, 1991, 139: 271～279.
, 百拇医药
[4] 刘振声，李宝民，刘彦仿，等. EB病毒反义LMP基因对人低分化鼻咽癌CNE-3细胞株生长的抑制作用[J]. 中华耳鼻喉科杂志, 1996, 31 (2): 92～95.
[5] 陈宜芳，郭辉玉，汪慧民，等. 鼻咽癌细胞系SUNE中EBV-LMP1基因对上皮细胞增殖的影响[J]. 肿瘤, 1999, 19(1): 15～18.
[6] Laland HH, Micheal BK. Cell cycle control and cancer[J]. Science, 1994, 266: 1821～1828.
[收稿日期] 1999-09-08 [修回日期] 1999-12-17, 百拇医药