APP17 肽对D-半乳糖性脑老化模型小鼠学习、记忆功能和海马神经元NT-3 、NGF表达的影响
作者：王晶 姬志娟 赵志炜 赵咏梅 盛树力
单位：(首都医科大学宣武医院 北京脑老化研究实验室， 北京 100053)
关键词：肽类；半乳糖； 疾病模型， 动物；神经生长因子
中国病理生理杂志000617
[摘 要] 目的与方法：用D-半乳糖(D-gal)复制脑老化模型，给模型小鼠皮下注射β-淀粉样肽前体蛋白319-335肽段(APP17p)，8周后应用水迷宫实验、神经免疫组化法，观察APP17肽对D-gal脑老化模型小鼠学习、记忆功能及海马神经元中神经营养因子3(NT-3)、神经生长因子(NGF)表达的影响。结果：(1)水迷宫实验D-gal组小鼠游完全程时间及错误反应次数明显高于对照组；APP17肽组小鼠游完全程时间及错误反应次数明显低于对照组和D-gal组。(2) APP17肽组海马神经元NT-3、NGF表达高于C组和D-gal组(P<0.01)。结论：D-半乳糖性脑老化模型小鼠存在学习、记忆功能障碍，其海马神经元NT-3、NGF表达降低；APP17肽有保护模型小鼠学习、记忆功能的作用，并能促进其海马神经元NT-3、NGF表达的增加。
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[中图分类号] R338 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0545-04
Influence of APP17 peptide on the study ability, memory and NT-3, NGF expression of the hippocampus neurons D-galactose induced brain aging model mice
WANG Jing， JI Zhi-juan， ZHAO Zhi-wei， ZHAO Yong-mei， SHENG Shu-li
(Beijing Research Labor for Brain Aging, Beijing Xuanwu Hospital, Beijing 100053，China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM:To observe the influence of beta-amyloid precursor protein (APP17) on the study ability, memory and the expression of neurotrophin-3 (NT-3), nerve growth factor(NGF)in the hippocampus neuron of the model mice. METHODS: Mice brain aging model were produced with D-galactose(D-gal), the model mice were given hypodermic injection of APP17 peptide. APP17 peptide is the 319-335 peptide sequence of beta-amyloid precursor protein. Eight weeks later, the animals were observed by water labyrinth test and immunohistochemistry assay. RESULT:(1) The whole time needed and total times of wrong response for the D-gal group mice to complete the whole course of the water labyrinth test is significantly higher than the normal control group. (2) The expression of NT-3, NGF in the hippocampus neurons of the mice in APP17 peptide group is significantly higher than that of the normal control group and D-gal mice group, P<0.01. CONCLUSIONS: The study ability, memory and the expression of NT-3, NGF in hippocampus neurons decreased in the D-gal induced brain aging model mice; APP17 peptide protected the study ability and memory of the model mice and in increasing the expression of NT-3, NGF in the hippocampus neurons.
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[MeSH] Peptides; D-Galactose； Disease model, animal; Nerve growth factors
脑老化在器官老化中占有非常重要的地位，研究较多。脑老化患者其临床最突出的特点之一是学习、记忆功能的明显降低，反应迟钝；其病理表现是神经元突触减少，神经元纤维缠结形成[1]。D-半乳糖作为衰老模型1991年由我国学者龚国清等首次提出[2]，随后许多学者在大鼠和小鼠上都证实该模型表现出与人类自然衰老相类似的生化改变、免疫功能低下、基因表达调控异常、细胞生长繁殖能力下降、细胞的退行性变、大鼠记忆巩固和再现障碍等现象，其机理是氧自由基介导的脂质过氧化效应[2～5]。APP17肽是β-淀粉样肽前体蛋白(beta-amyloid precursor protein, APP)的一个肽段 (APP695中319-335肽段)，有促进神经元存活及神经轴突生长等神经营养作用[6]。神经营养因子3(neurotrophin-3,NT-3)，它的单体是由119个氨基酸组成的15 kD碱性蛋白，与神经生长因子(nerve growth factor, NGF)有同源性。NT-3、NGF对多种神经元有支持存活和促进分化作用，具有调节和维持发育中神经元的突触，促进损伤神经的再生和修复的作用[7～9]。本实验通过对D-gal模型小鼠皮下注射APP17肽，观察APP17肽对模型小鼠神经行为及海马神经元NT-3 、NGF表达的影响，以探索改善脑老化途径。
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材 料 和 方 法
一、试剂
(一) APP17肽由本室用美国PE公司431-A型多肽自动合成仪用固相法合成，原料全部购于美国, 高效液相(HPLC)法纯化，纯度为99.8%，并经氨基酸组分分析，结果显示与目的肽相符。APP17肽的氨基酸序列为AKERLEAKHRERMSQVM。
(二) D-gal香港生化试剂公司生产,购于北京生化试剂公司，用生理盐水配成溶液。NT-3、NGF抗体及免疫组化试剂盒购自中山生物技术公司。
二、 动物及动物D-半乳糖模型复制
健康昆明种小鼠，雄性，体重(40±8) g，购自中国医科院药研所，随机分3组，每组20只。对照组(C group)：生理盐水0.2 mL.kg-1.d-1皮下注射8周；半乳糖组( D group)：D-半乳糖50 mg.kg-1.d-1皮下注射8周；半乳糖+APP 17肽组(APP17p+D group)：D-半乳糖50 mg.kg-1.d-1皮下注射,同时皮下注射APP17肽每只0.7 μg.d-1，注射8周。
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三、水迷宫实验
成模后行水迷宫实验，实验水深15 cm，水温28℃，将小鼠尾部朝向安全岛放入起始区，每天训练2次，连续5 d，第1 d 2个盲端，第2 d 3个盲端，第3、4、5 d 4个盲端，以头部碰到盲端为1次错误，记录每只小鼠游完全程的时间及错误反应次数，以判断小鼠学习、记忆功能。
四、免疫组织化学观察
小鼠用10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后立即开胸暴露心脏，经左心室插管，同时剪开右心房，快速灌注生理盐水至肝脏变白，改灌注液为4%多聚甲醛灌注时间约30 min，小鼠四肢僵硬为满意。然后取出鼠脑投入30%蔗糖多聚甲醛溶液中固定至脑下沉后，行冰冻切片，厚度为40 μm,进行NT-3、 NGF免疫组化染色。按说明书进行实验，阴性对照以正常血清代替一抗。在40倍物镜下计数3组相应海马区内阳性细胞数，并用奔腾Visilog 5图象分析仪检测阳性细胞胞浆平均灰度，以反映染色深浅程度。100倍显微镜下拍摄照片。
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五、数据处理
计数资料用均数±标准差(
±s)表示，差异显著性检验用多因素方差分析，用SPSS软件处理。
结 果
一、水迷宫实验结果见表1、2。
表1 游完全程所需时间
Tab 1 Time expense for swimming a whole course (s,±s, n=15) Group
1d
2d
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3d
4d
5d
C
11.82±0.95
17.06±16.32
36.20±37.64*
25.60±31.33*
12.70±10.28*
D
15.40±10.23
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13.34±11.56
40.83±41.84
28.56±33.64
19.40±24.11
APP17p+D
8.94±5.63
13.37±12.09
33.2±38.64*
14.10±9.64**
9.61±6.12**
*P<0.05, **P<0.01, vs group D； C group: control group； D group: D-galactose group； APP17p+D group: D-galactose treated with APP17 peptide表2 错误反应次数
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Tab 2 Wrong response times (times,±s,n=15) Group
1d
2d
3d
4d
5d
C
0.41±0.32
1.02±0.89
2.10±2.51*
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1.03±1.66*
0.25±0.51*
D
0.95±0.78
0.95±0.67
2.70±2.81
1.96±2.95
0.90±1.39
APP17p+D
0.56±0.41
1.68±0.94
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1.80±2.13**
0.46±0.89**
0.31±0.68**
*P<0.05, **P<0.01，vs group D
二、神经免疫组化结果
C组海马区可见大的、深染的NT-3 阳性神经元，数目多；D组海马区NT-3 阳性神经元数目明显少于C组，神经元染色浅；APP17p+D组NT-3阳性神经元染色与C组类似，细胞数明显多于C组和D组。C组海马区 NGF阳性神经元数目多，细胞胞体染色深并可见长的突起；D组NGF阳性神经元数目少，胞体染色浅，突起短；APP17p+D组NGF阳性神经元染色与C组相似，细胞数明显多于C 组、D组。3组小鼠大脑海马神经元中NT-3 及 NGF阳性细胞(图1，2)。3组小鼠大脑海马神经元中NT-3 及 NGF阳性细胞计数及灰度见表3。
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表3 3组小鼠大脑海马NT-3, NGF阳性神经元数目及灰度的比较
Tab 3 The numerical comparison of positive neurons and gray scale of neurons (±s,n=15) Group
NT-3
Positive neurons
NGF
Positive neurons
NT-3
Positive neurons
gray scale
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NGF
Positive neurons
gray scale
C
79.35±27.34*
54.61±7.87*
59.62±5.08*
76.20±8.71*
D
52.11 ±21.40
26.57±12.59
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75.61±6.13
99.18±11.70
APP17p+D
102.20±19.53*
52.00±6.86*
62.69±6.29*
84.60±8.61*
*P<0.01,vs group D；NT-3: neurotrophin-3； NGF: nerve growth factor
从表3可以看出, C 组、APP17p+D组的阳性神经元数及灰度相似,但与D组有显著差异,说明C组和APP17p+D组阳性细胞较D组染色深。
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Fig 1 Immunohistochemistry of mice hippocampal neurons stained with NGF monoclonal(×100)
A. The number of NGF positive neurons increased and the cell body stained obviously with long apophysis seen in C group mice
B. The number of NGF positive neurons decreased and the cell body stained less with short apophysis seen in D group mice
C. The NGF positive neurons in APP17p+D group stains similar as ones in group C, but the number of cells are greater than those in group C and group D
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图1 用NGF单克隆抗体免疫组化法对小鼠海马神经无染色(×100)
Fig 2 Immunohistochemistry of mice hippocampal neurons stained with NT-3 monoclonal(×100)
A. The increased number of greatly stained large NT-3 positive neurons can be seen
B. The number of NT-3 positive neurons decreased and the cell body stained less seen in D group mice
C. The NT-3 positive neurons in APP17p+D group stains similar as ones in group C, but the number of cell are greater than those in group C and group D
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图2 用NT-3单克隆抗体免疫组化法对小鼠海马神经元染色(×100)
讨 论
半乳糖性模型在国外主要用于白内障的研究，并认为半乳糖性白内障是代谢障碍在晶体产生的病理变化。我国学者龚国清，徐黻本，李文彬, 等人发现大剂量D-半乳糖不仅引起老年白内障，还会引起其他组织细胞包括脑神经元的一系列退行性变化[2～5，10]，符合人类自然衰老时所发生的变化。目前D-半乳糖所致亚急性衰老模型已得到认可。许多研究表明，D-半乳糖可引起小鼠出现脑老化，表现在水迷宫训练成绩下降；皮层神经元转录水平降低，脑组织中RNA含量减少 ,可溶性蛋白质含量减少，不可溶性蛋白增加；神经元数目减少；脑组织中SOD 活性下降， MDA、脂褐素水平升高；GSH-Px水平降低[2～5，10]。本实验结果显示小鼠腹腔注射D-半乳糖8周后D-半乳糖性脑老化模型小鼠出现了明显的行为学异常，即游出水迷宫的时间和错误反应次数均较正常对照组明显增多，说明D-半乳糖性脑老化模型小鼠存在学习记忆障碍。我们还发现8周模型组小鼠大脑海马超微结构的异常，表现在微管中微丝溶解消失，神经元突触减少(文章待发表)，说明8周模型组小鼠已表现出明显的脑功能和形态学的异常。研究表明海马与学习记忆功能密切相关，海马损伤直接影响其功能。本实验中D-半乳糖模型小鼠海马神经元中NT-3 、NGF的表达量明显低于对照组，提示D-半乳糖性脑老化模型小鼠学习记忆障碍与海马神经元中NT-3、NGF表达减少有关。APP17p是β-淀粉样肽前体蛋白中具有促进神经元存活和轴突生长的一个肽段，本实验中APP17p+D组小鼠游出水迷宫的时间及错误反应次数均低于D-半乳糖组和对照组，海马神经元中NT-3、NGF的表达明显高于D-半乳糖组和对照组。APP17p 可能通过增加海马神经元中NT-3、NGF的表达量来改善D-半乳糖性模型小鼠学习记忆障碍的。由此提示我们APP17p能够防治D-半乳糖所致的脑老化，但其内在机制尚不清楚，需继续研究。
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[参 考 文 献]
[1] Banchcr C, Brunner C,Lassmann H, et al. Accumulation of Alzheimer abnormally phosphorylated tau precedes the formation of neurofibrillary tangles in Alzheimers disease[J]. Brain Res 1989, 477:90～99.
[2] 龚国清，徐黻本.小鼠衰老模型的研究[J]. 中国药科大学学报, 1991, 22(2)：101～103.
[3] 李文彬, 韦 丰, 范 明, 等.D-半乳糖在小鼠上诱导的拟老化效应[J].中国药理学与毒理学杂志,1995, 9(2):93～95.
[4] 崔 旭, 李文彬, 张柄烈, 等.D-半乳糖对神经元和成纤维细胞拟老化作用的实验研究[J]. 中国应用生理学杂志,1997, 13(2):131～133.
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[5] 张 熙, 张葆樽, 扬新平, 等.D-半乳糖诱导大鼠操作性记忆巩固与再现障碍[J].中国应用生理杂志,1996，12(4):377～379.
[6] Roch JM, Masliah E, Rochlevecg AC, et al. Increase of synaptic density and memory retention by a peptide representing the trophic domain of the amyloid β/A4 protein precursor[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:7450～7454.
[7] Maisonpierre PC, Belluscio L, Squinto S, et al. Neurotrophin-3: a neurotrophic factor related to NGF and BDNF[J]. Science, 1990，247:1446～1451.
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[8] Lachyankar MB, Condon PJ ,Quesenberry PJ, et al. Embryonic precursor cells that express TrK receptor: induction of different cell fates by NGF ,BDNF,NT-3 and CNTF[J]. Exp Neurol, 1997,144(2):350～360.
[9] Liou JC, Yang RS, Fu WM. Regulation secretion by neurotrophic factors at developing motoneurons in Xenopus cell cultures[J]. J Physiol Lond, 1997,503:129～139.
[10] 崔 旭, 李文彬, 张炳烈, 等D-半乳糖脑老化模型的脂质过氧化机理[J]. 中国老年学杂志,1998，18(2):38～40.
[收稿日期] 1999-09-08 [修回日期] 2000-02-09
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单位：(首都医科大学宣武医院 北京脑老化研究实验室， 北京 100053)
关键词：肽类；半乳糖； 疾病模型， 动物；神经生长因子
中国病理生理杂志000617
[摘 要] 目的与方法：用D-半乳糖(D-gal)复制脑老化模型，给模型小鼠皮下注射β-淀粉样肽前体蛋白319-335肽段(APP17p)，8周后应用水迷宫实验、神经免疫组化法，观察APP17肽对D-gal脑老化模型小鼠学习、记忆功能及海马神经元中神经营养因子3(NT-3)、神经生长因子(NGF)表达的影响。结果：(1)水迷宫实验D-gal组小鼠游完全程时间及错误反应次数明显高于对照组；APP17肽组小鼠游完全程时间及错误反应次数明显低于对照组和D-gal组。(2) APP17肽组海马神经元NT-3、NGF表达高于C组和D-gal组(P<0.01)。结论：D-半乳糖性脑老化模型小鼠存在学习、记忆功能障碍，其海马神经元NT-3、NGF表达降低；APP17肽有保护模型小鼠学习、记忆功能的作用，并能促进其海马神经元NT-3、NGF表达的增加。
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[中图分类号] R338 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0545-04
Influence of APP17 peptide on the study ability, memory and NT-3, NGF expression of the hippocampus neurons D-galactose induced brain aging model mice
WANG Jing， JI Zhi-juan， ZHAO Zhi-wei， ZHAO Yong-mei， SHENG Shu-li
(Beijing Research Labor for Brain Aging, Beijing Xuanwu Hospital, Beijing 100053，China)
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[Abstract] AIM:To observe the influence of beta-amyloid precursor protein (APP17) on the study ability, memory and the expression of neurotrophin-3 (NT-3), nerve growth factor(NGF)in the hippocampus neuron of the model mice. METHODS: Mice brain aging model were produced with D-galactose(D-gal), the model mice were given hypodermic injection of APP17 peptide. APP17 peptide is the 319-335 peptide sequence of beta-amyloid precursor protein. Eight weeks later, the animals were observed by water labyrinth test and immunohistochemistry assay. RESULT:(1) The whole time needed and total times of wrong response for the D-gal group mice to complete the whole course of the water labyrinth test is significantly higher than the normal control group. (2) The expression of NT-3, NGF in the hippocampus neurons of the mice in APP17 peptide group is significantly higher than that of the normal control group and D-gal mice group, P<0.01. CONCLUSIONS: The study ability, memory and the expression of NT-3, NGF in hippocampus neurons decreased in the D-gal induced brain aging model mice; APP17 peptide protected the study ability and memory of the model mice and in increasing the expression of NT-3, NGF in the hippocampus neurons.
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[MeSH] Peptides; D-Galactose； Disease model, animal; Nerve growth factors
脑老化在器官老化中占有非常重要的地位，研究较多。脑老化患者其临床最突出的特点之一是学习、记忆功能的明显降低，反应迟钝；其病理表现是神经元突触减少，神经元纤维缠结形成[1]。D-半乳糖作为衰老模型1991年由我国学者龚国清等首次提出[2]，随后许多学者在大鼠和小鼠上都证实该模型表现出与人类自然衰老相类似的生化改变、免疫功能低下、基因表达调控异常、细胞生长繁殖能力下降、细胞的退行性变、大鼠记忆巩固和再现障碍等现象，其机理是氧自由基介导的脂质过氧化效应[2～5]。APP17肽是β-淀粉样肽前体蛋白(beta-amyloid precursor protein, APP)的一个肽段 (APP695中319-335肽段)，有促进神经元存活及神经轴突生长等神经营养作用[6]。神经营养因子3(neurotrophin-3,NT-3)，它的单体是由119个氨基酸组成的15 kD碱性蛋白，与神经生长因子(nerve growth factor, NGF)有同源性。NT-3、NGF对多种神经元有支持存活和促进分化作用，具有调节和维持发育中神经元的突触，促进损伤神经的再生和修复的作用[7～9]。本实验通过对D-gal模型小鼠皮下注射APP17肽，观察APP17肽对模型小鼠神经行为及海马神经元NT-3 、NGF表达的影响，以探索改善脑老化途径。
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材 料 和 方 法
一、试剂
(一) APP17肽由本室用美国PE公司431-A型多肽自动合成仪用固相法合成，原料全部购于美国, 高效液相(HPLC)法纯化，纯度为99.8%，并经氨基酸组分分析，结果显示与目的肽相符。APP17肽的氨基酸序列为AKERLEAKHRERMSQVM。
(二) D-gal香港生化试剂公司生产,购于北京生化试剂公司，用生理盐水配成溶液。NT-3、NGF抗体及免疫组化试剂盒购自中山生物技术公司。
二、 动物及动物D-半乳糖模型复制
健康昆明种小鼠，雄性，体重(40±8) g，购自中国医科院药研所，随机分3组，每组20只。对照组(C group)：生理盐水0.2 mL.kg-1.d-1皮下注射8周；半乳糖组( D group)：D-半乳糖50 mg.kg-1.d-1皮下注射8周；半乳糖+APP 17肽组(APP17p+D group)：D-半乳糖50 mg.kg-1.d-1皮下注射,同时皮下注射APP17肽每只0.7 μg.d-1，注射8周。
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三、水迷宫实验
成模后行水迷宫实验，实验水深15 cm，水温28℃，将小鼠尾部朝向安全岛放入起始区，每天训练2次，连续5 d，第1 d 2个盲端，第2 d 3个盲端，第3、4、5 d 4个盲端，以头部碰到盲端为1次错误，记录每只小鼠游完全程的时间及错误反应次数，以判断小鼠学习、记忆功能。
四、免疫组织化学观察
小鼠用10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后立即开胸暴露心脏，经左心室插管，同时剪开右心房，快速灌注生理盐水至肝脏变白，改灌注液为4%多聚甲醛灌注时间约30 min，小鼠四肢僵硬为满意。然后取出鼠脑投入30%蔗糖多聚甲醛溶液中固定至脑下沉后，行冰冻切片，厚度为40 μm,进行NT-3、 NGF免疫组化染色。按说明书进行实验，阴性对照以正常血清代替一抗。在40倍物镜下计数3组相应海马区内阳性细胞数，并用奔腾Visilog 5图象分析仪检测阳性细胞胞浆平均灰度，以反映染色深浅程度。100倍显微镜下拍摄照片。
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五、数据处理
计数资料用均数±标准差(
±s)表示，差异显著性检验用多因素方差分析，用SPSS软件处理。结 果
一、水迷宫实验结果见表1、2。
表1 游完全程所需时间
Tab 1 Time expense for swimming a whole course (s,
±s, n=15) Group1d
2d
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3d
4d
5d
C
11.82±0.95
17.06±16.32
36.20±37.64*
25.60±31.33*
12.70±10.28*
D
15.40±10.23
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13.34±11.56
40.83±41.84
28.56±33.64
19.40±24.11
APP17p+D
8.94±5.63
13.37±12.09
33.2±38.64*
14.10±9.64**
9.61±6.12**
*P<0.05, **P<0.01, vs group D； C group: control group； D group: D-galactose group； APP17p+D group: D-galactose treated with APP17 peptide表2 错误反应次数
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Tab 2 Wrong response times (times,
±s,n=15) Group1d
2d
3d
4d
5d
C
0.41±0.32
1.02±0.89
2.10±2.51*
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1.03±1.66*
0.25±0.51*
D
0.95±0.78
0.95±0.67
2.70±2.81
1.96±2.95
0.90±1.39
APP17p+D
0.56±0.41
1.68±0.94
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1.80±2.13**
0.46±0.89**
0.31±0.68**
*P<0.05, **P<0.01，vs group D
二、神经免疫组化结果
C组海马区可见大的、深染的NT-3 阳性神经元，数目多；D组海马区NT-3 阳性神经元数目明显少于C组，神经元染色浅；APP17p+D组NT-3阳性神经元染色与C组类似，细胞数明显多于C组和D组。C组海马区 NGF阳性神经元数目多，细胞胞体染色深并可见长的突起；D组NGF阳性神经元数目少，胞体染色浅，突起短；APP17p+D组NGF阳性神经元染色与C组相似，细胞数明显多于C 组、D组。3组小鼠大脑海马神经元中NT-3 及 NGF阳性细胞(图1，2)。3组小鼠大脑海马神经元中NT-3 及 NGF阳性细胞计数及灰度见表3。
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表3 3组小鼠大脑海马NT-3, NGF阳性神经元数目及灰度的比较
Tab 3 The numerical comparison of positive neurons and gray scale of neurons (±s,n=15) Group
NT-3
Positive neurons
NGF
Positive neurons
NT-3
Positive neurons
gray scale
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NGF
Positive neurons
gray scale
C
79.35±27.34*
54.61±7.87*
59.62±5.08*
76.20±8.71*
D
52.11 ±21.40
26.57±12.59
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75.61±6.13
99.18±11.70
APP17p+D
102.20±19.53*
52.00±6.86*
62.69±6.29*
84.60±8.61*
*P<0.01,vs group D；NT-3: neurotrophin-3； NGF: nerve growth factor
从表3可以看出, C 组、APP17p+D组的阳性神经元数及灰度相似,但与D组有显著差异,说明C组和APP17p+D组阳性细胞较D组染色深。
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Fig 1 Immunohistochemistry of mice hippocampal neurons stained with NGF monoclonal(×100)
A. The number of NGF positive neurons increased and the cell body stained obviously with long apophysis seen in C group mice
B. The number of NGF positive neurons decreased and the cell body stained less with short apophysis seen in D group mice
C. The NGF positive neurons in APP17p+D group stains similar as ones in group C, but the number of cells are greater than those in group C and group D
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图1 用NGF单克隆抗体免疫组化法对小鼠海马神经无染色(×100)
Fig 2 Immunohistochemistry of mice hippocampal neurons stained with NT-3 monoclonal(×100)
A. The increased number of greatly stained large NT-3 positive neurons can be seen
B. The number of NT-3 positive neurons decreased and the cell body stained less seen in D group mice
C. The NT-3 positive neurons in APP17p+D group stains similar as ones in group C, but the number of cell are greater than those in group C and group D
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图2 用NT-3单克隆抗体免疫组化法对小鼠海马神经元染色(×100)
讨 论
半乳糖性模型在国外主要用于白内障的研究，并认为半乳糖性白内障是代谢障碍在晶体产生的病理变化。我国学者龚国清，徐黻本，李文彬, 等人发现大剂量D-半乳糖不仅引起老年白内障，还会引起其他组织细胞包括脑神经元的一系列退行性变化[2～5，10]，符合人类自然衰老时所发生的变化。目前D-半乳糖所致亚急性衰老模型已得到认可。许多研究表明，D-半乳糖可引起小鼠出现脑老化，表现在水迷宫训练成绩下降；皮层神经元转录水平降低，脑组织中RNA含量减少 ,可溶性蛋白质含量减少，不可溶性蛋白增加；神经元数目减少；脑组织中SOD 活性下降， MDA、脂褐素水平升高；GSH-Px水平降低[2～5，10]。本实验结果显示小鼠腹腔注射D-半乳糖8周后D-半乳糖性脑老化模型小鼠出现了明显的行为学异常，即游出水迷宫的时间和错误反应次数均较正常对照组明显增多，说明D-半乳糖性脑老化模型小鼠存在学习记忆障碍。我们还发现8周模型组小鼠大脑海马超微结构的异常，表现在微管中微丝溶解消失，神经元突触减少(文章待发表)，说明8周模型组小鼠已表现出明显的脑功能和形态学的异常。研究表明海马与学习记忆功能密切相关，海马损伤直接影响其功能。本实验中D-半乳糖模型小鼠海马神经元中NT-3 、NGF的表达量明显低于对照组，提示D-半乳糖性脑老化模型小鼠学习记忆障碍与海马神经元中NT-3、NGF表达减少有关。APP17p是β-淀粉样肽前体蛋白中具有促进神经元存活和轴突生长的一个肽段，本实验中APP17p+D组小鼠游出水迷宫的时间及错误反应次数均低于D-半乳糖组和对照组，海马神经元中NT-3、NGF的表达明显高于D-半乳糖组和对照组。APP17p 可能通过增加海马神经元中NT-3、NGF的表达量来改善D-半乳糖性模型小鼠学习记忆障碍的。由此提示我们APP17p能够防治D-半乳糖所致的脑老化，但其内在机制尚不清楚，需继续研究。
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[参 考 文 献]
[1] Banchcr C, Brunner C,Lassmann H, et al. Accumulation of Alzheimer abnormally phosphorylated tau precedes the formation of neurofibrillary tangles in Alzheimers disease[J]. Brain Res 1989, 477:90～99.
[2] 龚国清，徐黻本.小鼠衰老模型的研究[J]. 中国药科大学学报, 1991, 22(2)：101～103.
[3] 李文彬, 韦 丰, 范 明, 等.D-半乳糖在小鼠上诱导的拟老化效应[J].中国药理学与毒理学杂志,1995, 9(2):93～95.
[4] 崔 旭, 李文彬, 张柄烈, 等.D-半乳糖对神经元和成纤维细胞拟老化作用的实验研究[J]. 中国应用生理学杂志,1997, 13(2):131～133.
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[5] 张 熙, 张葆樽, 扬新平, 等.D-半乳糖诱导大鼠操作性记忆巩固与再现障碍[J].中国应用生理杂志,1996，12(4):377～379.
[6] Roch JM, Masliah E, Rochlevecg AC, et al. Increase of synaptic density and memory retention by a peptide representing the trophic domain of the amyloid β/A4 protein precursor[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:7450～7454.
[7] Maisonpierre PC, Belluscio L, Squinto S, et al. Neurotrophin-3: a neurotrophic factor related to NGF and BDNF[J]. Science, 1990，247:1446～1451.
, http://www.100md.com
[8] Lachyankar MB, Condon PJ ,Quesenberry PJ, et al. Embryonic precursor cells that express TrK receptor: induction of different cell fates by NGF ,BDNF,NT-3 and CNTF[J]. Exp Neurol, 1997,144(2):350～360.
[9] Liou JC, Yang RS, Fu WM. Regulation secretion by neurotrophic factors at developing motoneurons in Xenopus cell cultures[J]. J Physiol Lond, 1997,503:129～139.
[10] 崔 旭, 李文彬, 张炳烈, 等D-半乳糖脑老化模型的脂质过氧化机理[J]. 中国老年学杂志,1998，18(2):38～40.
[收稿日期] 1999-09-08 [修回日期] 2000-02-09
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