老年学习记忆减退大鼠脑线粒体DNA缺失
作者：项平 高国全 周丽华 姚志彬
单位：项平(蚌埠医学院解剖教研室，安徽 蚌埠 233000)；高国全 周丽华 姚志彬(中山医科大学脑研究室，广东 广州 510089)
关键词：学习；记忆；DNA， 线粒体；衰老；聚合酶链式反应；大鼠
中国病理生理杂志000615
[摘 要] 目的和方法：测定老年大鼠脑mtDNA缺失型(以下简称缺失型)，缺失mtDNA比例，探讨mtDNA缺失与老年性学习记忆减退的关系，为研究其分子机制提供基础资料。用Morris水迷宫将老年大鼠(24个月)筛选为老年学习记忆正常和学习记忆减退两组。用稀释PCR法测定大鼠大脑皮质、海马和小脑缺失型mtDNA比例。结果：青老年鼠大脑皮质、海马和小脑均存在mtDNA缺失，片段为4834 bp；青年鼠的缺失比例约为0.00018%。老年记忆正常鼠上述3个脑区缺失型mtDNA缺失比例分别是青年鼠的6倍、6倍和2倍；老年记忆减退大鼠上述脑区的缺失型mtDNA比例分别是老年记忆正常鼠的2倍、1.8倍和3倍。结论：衰老时脑组织缺失型mtDNA增多，而老年学习记忆减退鼠较老年学习记忆正常鼠mtDNA缺失进一步成倍增加，表明相关脑区的mtDNA缺失在老年学习记忆减退的细胞分子机制中发挥重要作用。
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[中图分类号] R338.64 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0535-05
Mitochondrial DNA deletion of the brain tissue of aged rats with learning and memory deficit
XIANG Ping, GAO Guo-quan, ZHOU Li-hua, YAO Zhi-bin
(Department of Anatomy and Neurobiology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
[Abstract] AIM and METHODS: The ratio of mitochondrial DNA (mtDNA) deletion was measured to find the relationship between mtDNA deletion and aged learning and memory deficit. The aged rats were divided into two groups, aged learning and memory deficit group and aged learning and memory normal group. The ratio of mtDNA deletion was measured by dilution polymerase chain reaction. RESULTS: There are deleted mtDNA (about 4834 bp) in the cerebral cortex, hippocampus and cerebellum of both young and aged rats. The ratios of deleted mtDNA were similar in the cerebral cortex,hippocampus and cerebellum of young rats (about 0.00018%). The ratio mtDNA of aged learning and memory normal rats had increased by five-fold in the cerebral cortex and hippocampus, or one-fold in the cerebellum over young rats. The ratio of aged learning and memory dificit rats had increased by one-fold in the cerebral cortex or 0.8-fold in the hippocampus or two-fold in the cerebellum over aged learning and memory normal rats.CONCLUSIONS: There was really the increase of mtDNA in aging rat brain. And this increase was double in amount in aged learning and memory deficit rats compared to the normal learning and memory aged rats. It is suggested that the mtDNA deletions in the brain regions associated with learning and memory may be contributed to the cellular and molecular mechanism of learning and memory deicit with aged rats.
, 百拇医药
[MeSH] Learning; Memory; DNA, mitochondrial; Aging; Polymerase chain reaction; Rats
线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)是一双链环状分子，大约有16 kb，占细胞总DNA的0.1%～1%。虽然mtDNA转录的mRNA只编码线粒体内膜中呼吸酶复合体的6个亚单位共13个多肽，但是这6个亚单位都参与了细胞内电子传递和氧化磷酸化的作用。mtDNA易发生突变，点突变和缺失突变是其突变的两种主要形式，mtDNA缺失碱基片段通常在1.3～7.6 kb[1]，即所谓“普通缺失”。此缺失在8482位碱基至13459位碱基，共缺失4977个碱基，包括编码部分ATP合酶亚单位8、ATP合酶亚单位6和COⅢ以及ND1-ND5基因。大鼠mtDNA序列与人类相似，也存在类似缺失，缺失片段为4.8 kb[2]。近年来研究发现正常衰老和某些疾病如Alzheimer's disease, Parkinson, CPEO,Ⅱ型糖尿病等患者的mtDNA存在缺失，且病变程度与缺失量有关[3～5]。因而认为mtDNA缺失突变是导致这些疾病的直接或间接因素。学习记忆能力减退是脑衰老的主要表现之一，其细胞分子机制尚不清楚。由于mtDNA缺失突变与衰老和疾病有密切联系，本研究通过Morris水迷宫行为检测筛选，用PCR方法检测老年性学习记忆减退大鼠的脑组织mtDNA缺失突变，以探讨老年性学习记忆减退的分子机制。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、实验动物
雄性健康SD大鼠，青年鼠(3月龄)10只，老年鼠(24月龄)20只，同一环境饲养，动物由中山医科大学动物中心提供。
二、Morris水迷宫行为检测参照文献[6]。
三、线粒体DNA提取
断头杀死大鼠，立即取出大脑，用GTE缓冲液(50 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mol/L Tris-HCl,pH 8.0)匀浆，匀浆液离心500×g,5 min,取上清离心800×g,10 min沉淀物为线粒体。用NS溶液(0.2 mol/L NaOH、1% SDS)裂解线粒体，加入3 mol/L乙酸钾，1000×g离心20 min，去除沉淀。上清液等体积苯酚-氯仿抽提两次，加入RNase Ⅰ (100 μg/L)去除RNA。用含150 mmol/L NaCl的乙醇沉淀mtDNA，沉淀物真空干燥后，溶解在适量的TE(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0，1 mmol/L EDTA)中。
, 百拇医药
四、稀释PCR
参照大鼠线粒体DNA全序列[7]自行设计，由中国科学院上海细胞所合成两对引物(表1)。引物P1、P2横跨mtDNA常见缺失区，扩增出5430 bp产物为正常mtDNA以及596 bp产物为缺失型mtDNA。引物P3、P4位于无缺失区，扩增出657 bp产物代表总的mtDNA。
引物P1、P2 PCR 50 μL反应体系：mtDNA 100 ng，引物浓度各为100 pmol，dNTPs 200 μmol/L,Mg2+ 1.8 mmol/L,Taq酶2.5U(加拿大真达公司)，10×buffer 5.0 μL,石蜡油40 μL。引物P3、P4及596 bp PCR反应体系基本同上仅mtDNA 量为50 ng，而且为了消除5430 bp带对扩增596 bp带的影响，模板必须先用Taq Ⅰ酶(Promega公司)消化，Taq Ⅰ酶切点为TCGA，位于mtDNA缺失区。PCR反应条件：94℃变性10 min，加Taq酶。94℃ 1min→56℃ 1 min→72℃ 5 min，共30次循环，末次5～10 min延伸。
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表1 大鼠mtDNA引物设计参数
Tab 1 The standard of the primer of rat mtDNA Primer
Position
Sequence(5'-3')
Product(bp)
P1
L7687-7709
GCTTAGAGCGTTAACCTTTTAAG
5430(normal)
P2
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H13117-13099
AAGCCTGCTAGGATGCTTC
596(deletion)
P3
L15758-15777
ACAGGCATCTGGTTCTTACT
657(products of non-deletion)
P4
H117-98
CATGTCTAATCTTACCTCCA
, 百拇医药
取PCR扩增产物(8.0 μL)经含EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下观察并拍照记录实验结果。用IBAS Rel 2.0全自动图像分析系统(德国OPTON公司)，对底片进行定量分析，计量单位为积分光密度(nitregrated optical density,OPTDI)。
稀释PCR法对缺失型mtDNA比例定量是以同一样本mtDNA为模板，按一定浓度稀释梯度稀释，分别用P1、P2和P3、P4两对引物行PCR扩增。P1、P2扩增产物596 bp代表缺失型mtDNA含量，P3、P4扩增产物657 bp代表总mtDNA含量，二者扩增产物光密度相等时的最小mtDNA模板量的比例即代表缺失型mtDNA比例。计算能扩增出596 bp和657 bp带的最小mtDNA浓度比例以及它们的条带积分光密度比例，从而得出缺失型mtDNA的比例。结 果
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一、行为学测试结果
测得青年鼠平均逃避潜伏期为(13.8±5.6)s，以青年组平均逃避潜伏期的95%和99%正常值 的上限值为界[6]，潜伏期大于99%上限值的老年大鼠为老年学习记忆损害鼠，小于95%上限值的为老年学习记忆正常鼠，潜伏期在两上限值之间的鼠为可疑鼠，从实验中弃去。
空间探索试验显示青年组和老年学习记忆正常大鼠的游泳轨迹主要集中在平台象限，其在平台象限的游泳距离占总距离百分比分别为67.7%和50.2%，明显高于非平台象限(P<0.01)。老年记忆损害鼠的游泳轨迹呈随机分布，其在原平台象限游泳距离占总距离百分比为28.7%，与其它非平台象限无显著差异。本实验还同时检测了老年正常鼠和老年记忆损害鼠的游泳速度，分别为1.29 m/s和1.31 m/s，两者无显著差异。
二、3组大鼠各脑区缺失型mtDNA片段和PCR产物积分光密度
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青年鼠、老年正常鼠和老年学习记忆减退鼠脑组织(大脑皮质、海马和小脑)均可检测出mtDNA的缺失存在(图1)。缺失片段为4834 bp(5430-596=4834)。
Fig 1 The electrophoresis of the PCR amplification products of mtDNA primer P1, P2 of rat brain
M1： DNA marker (1543,994,695,515,377,237), M2: λ DNA/Hind Ⅲ marker (23130,9416,6557,4361,2322,2027,564,125). cerebral cortex 1: hippocampus 2; cerebellum 3 of young rat; cerebral cortex 4; hippocampus 5; cerebellum 6 of control aged rat; cerebral cortex 7; hippocampus 8; cerebellum 9 of memory deficit aged rat
, 百拇医药
图1 大鼠脑mtDNA引物P1、P2、PCR扩增产物电泳图谱
取50 ng mtDNA，PCR扩增596 bp产物 (图2)，测得各脑区的PCR产物积分光密度(表2)，可见老年记忆正常大鼠大脑皮质、海马和小脑缺失型mtDNA明显多于青年鼠，而老年记忆减退大鼠缺失型mtDNA又明显多于老年记忆正常大鼠。老年正常和老年学习记忆减退大鼠小脑缺失型mtDNA明显少于大脑皮质和海马，但青年组3个脑区间无显著差异。
表2 大鼠脑mtDNA缺失产物积分光密度比较(单位：OPTDI)
Tab 2 The comparison of the OPTDI of PCR products of deleted mtDNA of the rats (
±s)
, 百拇医药
Young rat
(n=10)
Control aged rat
(n=10)
Memory dificit aged rat
(n=7)
Cerebral cortex
8.04±0.48
31.13±1.89
118.43±5.24△
Hippocampus
, 百拇医药
7.41±0.25
30.41±1.95*
87.47±4.67△
Cerebellum
8.01±0.47
11.87±0.83▲
38.75±2.89△▲
P<0.01， vs young rat; △ P<0.01， vs control aged rat; ▲P<0.01, vs hippocampus or cerebral cortex in the same group
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Fig 2 The electrophoresis of PCR products of deleted mtDNA of rat brain
M1: DNA marker, M2: λ DNA/Hind Ⅲ marker. cerebral cortex 1; hippocampus 2; cerebellum 3 of young rat; cerebral cortex 4; hippocampus 5; cerebellum 6 of control aged rat; cerebral cortex 7; hippocampus 8; cerebellum 9 of memory deficit aged rat
图2 大鼠脑缺失型mtDNA PCR产物电泳图谱
用上述各脑区缺失型mtDNA PCR产物积分光密度接近均数的模板行稀释PCR(图3)，算出各脑区缺失型mtDNA的比例(表3)，结果老年鼠大脑皮质、海马和小脑缺失型mtDNA比例明显增高，分别是青年鼠6倍、6倍和2倍，老年学习记忆减退鼠缺失型mtDNA比例较老年学习记忆正常鼠进一步增高，分别是它们的2倍、1.8倍和3倍。
, 百拇医药
表3 大鼠脑mtDNA缺失比例
Tab 3 The ratios of delete mtDNA of rat brain(%)
Young rat
Control
aged rat
Memory dificit
aged rat
Cerebral cortex
0.000181
0.001063
, 百拇医药 0.002252
Hippocampus
0.000174
0.001045
0.001834
Cerebellum
0.000180
0.000378
0.001175
讨 论
衰老过程中mtDNA缺失突变与学习记忆减退的关系，目前国内、外未见有大量报道。学习记忆是脑神经元复杂活动过程，它包括多个神经元组成的环路以及突触递质作用等。已有实验证实老年空间记忆减退鼠神经元数量减少，突触传递的效能减弱等[6]。老年性痴呆(AD)病人脑出现大量突触丢失以及线粒体能量产生有关的氧化磷酸化途径障碍，而且顶叶、颞叶代谢降低出现在AD病早期症状-学习记忆减退之前[8]。这些提示了学习记忆减退与脑神经元结构和功能衰退密切相关。最近Morrisal等[9]发表AD病人顶叶、颞叶、枕叶以及小脑mtDNA缺失比例较正常老年人明显增高，提示mtDNA缺失与AD病发病机制有密切联系。
, 百拇医药
Fig 3 The electrophoresis of the dilution PCR products
of mtDNA of rat cerebral cortex
M1: DNA marker. The diluted concentration of mtDNA is 1∶250 ng; 2∶25 ng; 3∶2.5 ng; 4∶0.25 ng; 5,7∶0.025 ng; 6,8∶0.0025 ng; 9∶0.00025 ng;10∶0.000025 ng; 11∶0.0000025 ng; 12∶0.00000025 ng. A. The OPTDI of young rats is 1∶29.62; 2∶17.99;7∶127.32; 8∶20.32; 9∶11.62; 10∶9.93; B. The OPTDI of control aged rats is 1∶26.03; 2∶14.19; 3∶10.15; 7∶376.85; 8∶18.48; 9∶17.16; 10∶9.55; C. The OPTDI of memory dificit rats is 1∶4.84; 2∶27.21; 3∶21.73; 7∶219.15;8∶16.85;9∶16.95;10∶9.65.
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图3 大鼠大脑皮质mtDNA模板稀释PCR产物电泳图谱
本研究发现老年记忆减退鼠大脑皮质、海马和小脑缺失型mtDNA比例均比老年记忆正常鼠增高约2～3倍，提示脑线粒体DNA缺失与老年学习记忆减退密切相关。老年记忆减退鼠缺失型mtDNA比例增高可能是由于氧自由基累积增多，对mtDNA损伤而引起的。脑神经元的线粒体呼吸链是脑内氧自由基生成的主要场所，正常情况下氧自由基一边生成，一边被清除。当氧自由基累积后，氧自由基就“攻击”神经元的生命物质(膜、蛋白质和核酸等)，导致线粒体DNA缺失突变、线粒体膜结构破坏以及其他亚细胞结构损害[10]。由于mtDNA缺失编码的大多是细胞电子传递和氧化磷酸化酶复合物，线粒体DNA发生缺失突变，必将导致呼吸链功能进一步损害，出现氧自由基增多和ATP生成减少，增多的氧自由基又“攻击”mtDNA和其他物质，结果缺失型mtDNA比例增高，神经元的功能和结构损害。老年记忆正常鼠皮质、海马缺失型mtDNA比例虽已是青年鼠6倍，但学习记忆水平较青年鼠下降不明显。可能此时这些个体损伤程度尚处于神经元的代偿机制可补偿范围内，如通过线粒体增大、自由基清除酶的活性增高和神经突起抽芽等机制以代偿衰老引起的退变，因此尚不至于引起行为学的改变。老年学习记忆损害鼠脑缺失型mtDNA比例进一步增加时，这些老年个体脑缺失型mtDNA所带来的损伤，就超过其神经元的代偿能力，此时线粒体能量代谢降低以及线粒体和其他亚细胞结构损伤加重，导致神经元的信息加工功能严重障碍，从而引起学习记忆能力下降。可见海马及皮质在衰老记忆减退的分子机制中发挥重要作用。小脑的缺失型mtDNA比例在老年学习记忆正常组增加较海马和皮质明显要低，但在老年学习记忆减退鼠小脑的缺失型mtDNA比例较老年学习记忆正常鼠明显增高，其幅度超过了海马和皮质，提示小脑的衰老性退变可能与学习记忆减退有一定的关系。
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以上结果显示衰老时脑组织缺失型mtDNA增多，而老年学习记忆减退鼠较老年学习记忆正常鼠mtDNA缺失进一步成倍增加。表明相关脑区的mtDNA缺失在老年学习记忆减退的细胞分子机制中发挥重要作用。
[基金项目] 国家自然科学基金资助
[参 考 文 献]
[1] Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Deletion of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies [J]. Nature,1988,331:717～719.
[2] Gadaleta MN, Rainaldi G, Lessa AMS, et al. Mitochondrial DNA copy number and mitochondrial DNA deletion in adult and senescent rats [J]. Mutation Res,1992,275:181～193.
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[3] Luft R, Luthman H. Physiopathology of mitochondrial. From Luft's disease to aging and diabetes [J]. Lakartidningn,1993,90:2770～2775.
[4] Zeviani M, Morases CT, Dimauro S, et al. Deletion of mitochondrial DNA in Kearnsesayre syndromes [J]. Neurology,1988,38:1339～1346.
[5] Shoffner JM, Lott MT, Voljavec A, et al. Spontaneous Kearns-sayre/chronic external ophthalmoplegia plus synrome associated with a mitochondrial DNA deletion: a slipreplication model and metaboic therapy [J]. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:7952～7956.
, 百拇医药
[6] 洪 岸，姚志彬.老年大鼠学习记忆减退与海马结构的突触改变[J].解剖学报，1996，27(2)：164～168.
[7] Gadaleta P, Pepe G, Candia D, et al. The complete nucleotid sequence of the Rattus norvegicus mitochondrial genome: cryptic signals revealed by comparative analysis between verebrates [J]. J Mol Evol,1989,28:497～516.
[8] Horwitz B, Grady CL, Schlagetor NL, et al. Intercorrelation of regional cerebral glucose metablic rates in Alzheimer's disease [J]. Brain Res, 1987,407:294～306.
[9] Morrisol CD, Terzah H, Marie TL, et al. Marked changes in mitochondrial DNA deletion levels in Alzheimer brains[J]. Genomics,1994,23:417～476.
[10] 姚志彬.海马神经元和神经递质的衰老性变化及自由基分析[J].中山医科大学学报，1988，9：5～9.
[收稿日期]1999-03-19 [修回日期]1999-09-14
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单位：项平(蚌埠医学院解剖教研室，安徽 蚌埠 233000)；高国全 周丽华 姚志彬(中山医科大学脑研究室，广东 广州 510089)
关键词：学习；记忆；DNA， 线粒体；衰老；聚合酶链式反应；大鼠
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[摘 要] 目的和方法：测定老年大鼠脑mtDNA缺失型(以下简称缺失型)，缺失mtDNA比例，探讨mtDNA缺失与老年性学习记忆减退的关系，为研究其分子机制提供基础资料。用Morris水迷宫将老年大鼠(24个月)筛选为老年学习记忆正常和学习记忆减退两组。用稀释PCR法测定大鼠大脑皮质、海马和小脑缺失型mtDNA比例。结果：青老年鼠大脑皮质、海马和小脑均存在mtDNA缺失，片段为4834 bp；青年鼠的缺失比例约为0.00018%。老年记忆正常鼠上述3个脑区缺失型mtDNA缺失比例分别是青年鼠的6倍、6倍和2倍；老年记忆减退大鼠上述脑区的缺失型mtDNA比例分别是老年记忆正常鼠的2倍、1.8倍和3倍。结论：衰老时脑组织缺失型mtDNA增多，而老年学习记忆减退鼠较老年学习记忆正常鼠mtDNA缺失进一步成倍增加，表明相关脑区的mtDNA缺失在老年学习记忆减退的细胞分子机制中发挥重要作用。
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[中图分类号] R338.64 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0535-05
Mitochondrial DNA deletion of the brain tissue of aged rats with learning and memory deficit
XIANG Ping, GAO Guo-quan, ZHOU Li-hua, YAO Zhi-bin
(Department of Anatomy and Neurobiology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
[Abstract] AIM and METHODS: The ratio of mitochondrial DNA (mtDNA) deletion was measured to find the relationship between mtDNA deletion and aged learning and memory deficit. The aged rats were divided into two groups, aged learning and memory deficit group and aged learning and memory normal group. The ratio of mtDNA deletion was measured by dilution polymerase chain reaction. RESULTS: There are deleted mtDNA (about 4834 bp) in the cerebral cortex, hippocampus and cerebellum of both young and aged rats. The ratios of deleted mtDNA were similar in the cerebral cortex,hippocampus and cerebellum of young rats (about 0.00018%). The ratio mtDNA of aged learning and memory normal rats had increased by five-fold in the cerebral cortex and hippocampus, or one-fold in the cerebellum over young rats. The ratio of aged learning and memory dificit rats had increased by one-fold in the cerebral cortex or 0.8-fold in the hippocampus or two-fold in the cerebellum over aged learning and memory normal rats.CONCLUSIONS: There was really the increase of mtDNA in aging rat brain. And this increase was double in amount in aged learning and memory deficit rats compared to the normal learning and memory aged rats. It is suggested that the mtDNA deletions in the brain regions associated with learning and memory may be contributed to the cellular and molecular mechanism of learning and memory deicit with aged rats.
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[MeSH] Learning; Memory; DNA, mitochondrial; Aging; Polymerase chain reaction; Rats
线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)是一双链环状分子，大约有16 kb，占细胞总DNA的0.1%～1%。虽然mtDNA转录的mRNA只编码线粒体内膜中呼吸酶复合体的6个亚单位共13个多肽，但是这6个亚单位都参与了细胞内电子传递和氧化磷酸化的作用。mtDNA易发生突变，点突变和缺失突变是其突变的两种主要形式，mtDNA缺失碱基片段通常在1.3～7.6 kb[1]，即所谓“普通缺失”。此缺失在8482位碱基至13459位碱基，共缺失4977个碱基，包括编码部分ATP合酶亚单位8、ATP合酶亚单位6和COⅢ以及ND1-ND5基因。大鼠mtDNA序列与人类相似，也存在类似缺失，缺失片段为4.8 kb[2]。近年来研究发现正常衰老和某些疾病如Alzheimer's disease, Parkinson, CPEO,Ⅱ型糖尿病等患者的mtDNA存在缺失，且病变程度与缺失量有关[3～5]。因而认为mtDNA缺失突变是导致这些疾病的直接或间接因素。学习记忆能力减退是脑衰老的主要表现之一，其细胞分子机制尚不清楚。由于mtDNA缺失突变与衰老和疾病有密切联系，本研究通过Morris水迷宫行为检测筛选，用PCR方法检测老年性学习记忆减退大鼠的脑组织mtDNA缺失突变，以探讨老年性学习记忆减退的分子机制。
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材 料 和 方 法
一、实验动物
雄性健康SD大鼠，青年鼠(3月龄)10只，老年鼠(24月龄)20只，同一环境饲养，动物由中山医科大学动物中心提供。
二、Morris水迷宫行为检测参照文献[6]。
三、线粒体DNA提取
断头杀死大鼠，立即取出大脑，用GTE缓冲液(50 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mol/L Tris-HCl,pH 8.0)匀浆，匀浆液离心500×g,5 min,取上清离心800×g,10 min沉淀物为线粒体。用NS溶液(0.2 mol/L NaOH、1% SDS)裂解线粒体，加入3 mol/L乙酸钾，1000×g离心20 min，去除沉淀。上清液等体积苯酚-氯仿抽提两次，加入RNase Ⅰ (100 μg/L)去除RNA。用含150 mmol/L NaCl的乙醇沉淀mtDNA，沉淀物真空干燥后，溶解在适量的TE(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0，1 mmol/L EDTA)中。
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四、稀释PCR
参照大鼠线粒体DNA全序列[7]自行设计，由中国科学院上海细胞所合成两对引物(表1)。引物P1、P2横跨mtDNA常见缺失区，扩增出5430 bp产物为正常mtDNA以及596 bp产物为缺失型mtDNA。引物P3、P4位于无缺失区，扩增出657 bp产物代表总的mtDNA。
引物P1、P2 PCR 50 μL反应体系：mtDNA 100 ng，引物浓度各为100 pmol，dNTPs 200 μmol/L,Mg2+ 1.8 mmol/L,Taq酶2.5U(加拿大真达公司)，10×buffer 5.0 μL,石蜡油40 μL。引物P3、P4及596 bp PCR反应体系基本同上仅mtDNA 量为50 ng，而且为了消除5430 bp带对扩增596 bp带的影响，模板必须先用Taq Ⅰ酶(Promega公司)消化，Taq Ⅰ酶切点为TCGA，位于mtDNA缺失区。PCR反应条件：94℃变性10 min，加Taq酶。94℃ 1min→56℃ 1 min→72℃ 5 min，共30次循环，末次5～10 min延伸。
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表1 大鼠mtDNA引物设计参数
Tab 1 The standard of the primer of rat mtDNA Primer
Position
Sequence(5'-3')
Product(bp)
P1
L7687-7709
GCTTAGAGCGTTAACCTTTTAAG
5430(normal)
P2
, http://www.100md.com
H13117-13099
AAGCCTGCTAGGATGCTTC
596(deletion)
P3
L15758-15777
ACAGGCATCTGGTTCTTACT
657(products of non-deletion)
P4
H117-98
CATGTCTAATCTTACCTCCA
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取PCR扩增产物(8.0 μL)经含EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下观察并拍照记录实验结果。用IBAS Rel 2.0全自动图像分析系统(德国OPTON公司)，对底片进行定量分析，计量单位为积分光密度(nitregrated optical density,OPTDI)。
稀释PCR法对缺失型mtDNA比例定量是以同一样本mtDNA为模板，按一定浓度稀释梯度稀释，分别用P1、P2和P3、P4两对引物行PCR扩增。P1、P2扩增产物596 bp代表缺失型mtDNA含量，P3、P4扩增产物657 bp代表总mtDNA含量，二者扩增产物光密度相等时的最小mtDNA模板量的比例即代表缺失型mtDNA比例。计算能扩增出596 bp和657 bp带的最小mtDNA浓度比例以及它们的条带积分光密度比例，从而得出缺失型mtDNA的比例。结 果
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一、行为学测试结果
测得青年鼠平均逃避潜伏期为(13.8±5.6)s，以青年组平均逃避潜伏期的95%和99%正常值 的上限值为界[6]，潜伏期大于99%上限值的老年大鼠为老年学习记忆损害鼠，小于95%上限值的为老年学习记忆正常鼠，潜伏期在两上限值之间的鼠为可疑鼠，从实验中弃去。
空间探索试验显示青年组和老年学习记忆正常大鼠的游泳轨迹主要集中在平台象限，其在平台象限的游泳距离占总距离百分比分别为67.7%和50.2%，明显高于非平台象限(P<0.01)。老年记忆损害鼠的游泳轨迹呈随机分布，其在原平台象限游泳距离占总距离百分比为28.7%，与其它非平台象限无显著差异。本实验还同时检测了老年正常鼠和老年记忆损害鼠的游泳速度，分别为1.29 m/s和1.31 m/s，两者无显著差异。
二、3组大鼠各脑区缺失型mtDNA片段和PCR产物积分光密度
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青年鼠、老年正常鼠和老年学习记忆减退鼠脑组织(大脑皮质、海马和小脑)均可检测出mtDNA的缺失存在(图1)。缺失片段为4834 bp(5430-596=4834)。
Fig 1 The electrophoresis of the PCR amplification products of mtDNA primer P1, P2 of rat brain
M1： DNA marker (1543,994,695,515,377,237), M2: λ DNA/Hind Ⅲ marker (23130,9416,6557,4361,2322,2027,564,125). cerebral cortex 1: hippocampus 2; cerebellum 3 of young rat; cerebral cortex 4; hippocampus 5; cerebellum 6 of control aged rat; cerebral cortex 7; hippocampus 8; cerebellum 9 of memory deficit aged rat
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图1 大鼠脑mtDNA引物P1、P2、PCR扩增产物电泳图谱
取50 ng mtDNA，PCR扩增596 bp产物 (图2)，测得各脑区的PCR产物积分光密度(表2)，可见老年记忆正常大鼠大脑皮质、海马和小脑缺失型mtDNA明显多于青年鼠，而老年记忆减退大鼠缺失型mtDNA又明显多于老年记忆正常大鼠。老年正常和老年学习记忆减退大鼠小脑缺失型mtDNA明显少于大脑皮质和海马，但青年组3个脑区间无显著差异。
表2 大鼠脑mtDNA缺失产物积分光密度比较(单位：OPTDI)
Tab 2 The comparison of the OPTDI of PCR products of deleted mtDNA of the rats (
±s), 百拇医药
Young rat
(n=10)
Control aged rat
(n=10)
Memory dificit aged rat
(n=7)
Cerebral cortex
8.04±0.48
31.13±1.89
118.43±5.24△
Hippocampus
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7.41±0.25
30.41±1.95*
87.47±4.67△
Cerebellum
8.01±0.47
11.87±0.83▲
38.75±2.89△▲
P<0.01， vs young rat; △ P<0.01， vs control aged rat; ▲P<0.01, vs hippocampus or cerebral cortex in the same group
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Fig 2 The electrophoresis of PCR products of deleted mtDNA of rat brain
M1: DNA marker, M2: λ DNA/Hind Ⅲ marker. cerebral cortex 1; hippocampus 2; cerebellum 3 of young rat; cerebral cortex 4; hippocampus 5; cerebellum 6 of control aged rat; cerebral cortex 7; hippocampus 8; cerebellum 9 of memory deficit aged rat
图2 大鼠脑缺失型mtDNA PCR产物电泳图谱
用上述各脑区缺失型mtDNA PCR产物积分光密度接近均数的模板行稀释PCR(图3)，算出各脑区缺失型mtDNA的比例(表3)，结果老年鼠大脑皮质、海马和小脑缺失型mtDNA比例明显增高，分别是青年鼠6倍、6倍和2倍，老年学习记忆减退鼠缺失型mtDNA比例较老年学习记忆正常鼠进一步增高，分别是它们的2倍、1.8倍和3倍。
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表3 大鼠脑mtDNA缺失比例
Tab 3 The ratios of delete mtDNA of rat brain(%)
Young rat
Control
aged rat
Memory dificit
aged rat
Cerebral cortex
0.000181
0.001063
, 百拇医药 0.002252
Hippocampus
0.000174
0.001045
0.001834
Cerebellum
0.000180
0.000378
0.001175
讨 论
衰老过程中mtDNA缺失突变与学习记忆减退的关系，目前国内、外未见有大量报道。学习记忆是脑神经元复杂活动过程，它包括多个神经元组成的环路以及突触递质作用等。已有实验证实老年空间记忆减退鼠神经元数量减少，突触传递的效能减弱等[6]。老年性痴呆(AD)病人脑出现大量突触丢失以及线粒体能量产生有关的氧化磷酸化途径障碍，而且顶叶、颞叶代谢降低出现在AD病早期症状-学习记忆减退之前[8]。这些提示了学习记忆减退与脑神经元结构和功能衰退密切相关。最近Morrisal等[9]发表AD病人顶叶、颞叶、枕叶以及小脑mtDNA缺失比例较正常老年人明显增高，提示mtDNA缺失与AD病发病机制有密切联系。
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Fig 3 The electrophoresis of the dilution PCR products
of mtDNA of rat cerebral cortex
M1: DNA marker. The diluted concentration of mtDNA is 1∶250 ng; 2∶25 ng; 3∶2.5 ng; 4∶0.25 ng; 5,7∶0.025 ng; 6,8∶0.0025 ng; 9∶0.00025 ng;10∶0.000025 ng; 11∶0.0000025 ng; 12∶0.00000025 ng. A. The OPTDI of young rats is 1∶29.62; 2∶17.99;7∶127.32; 8∶20.32; 9∶11.62; 10∶9.93; B. The OPTDI of control aged rats is 1∶26.03; 2∶14.19; 3∶10.15; 7∶376.85; 8∶18.48; 9∶17.16; 10∶9.55; C. The OPTDI of memory dificit rats is 1∶4.84; 2∶27.21; 3∶21.73; 7∶219.15;8∶16.85;9∶16.95;10∶9.65.
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图3 大鼠大脑皮质mtDNA模板稀释PCR产物电泳图谱
本研究发现老年记忆减退鼠大脑皮质、海马和小脑缺失型mtDNA比例均比老年记忆正常鼠增高约2～3倍，提示脑线粒体DNA缺失与老年学习记忆减退密切相关。老年记忆减退鼠缺失型mtDNA比例增高可能是由于氧自由基累积增多，对mtDNA损伤而引起的。脑神经元的线粒体呼吸链是脑内氧自由基生成的主要场所，正常情况下氧自由基一边生成，一边被清除。当氧自由基累积后，氧自由基就“攻击”神经元的生命物质(膜、蛋白质和核酸等)，导致线粒体DNA缺失突变、线粒体膜结构破坏以及其他亚细胞结构损害[10]。由于mtDNA缺失编码的大多是细胞电子传递和氧化磷酸化酶复合物，线粒体DNA发生缺失突变，必将导致呼吸链功能进一步损害，出现氧自由基增多和ATP生成减少，增多的氧自由基又“攻击”mtDNA和其他物质，结果缺失型mtDNA比例增高，神经元的功能和结构损害。老年记忆正常鼠皮质、海马缺失型mtDNA比例虽已是青年鼠6倍，但学习记忆水平较青年鼠下降不明显。可能此时这些个体损伤程度尚处于神经元的代偿机制可补偿范围内，如通过线粒体增大、自由基清除酶的活性增高和神经突起抽芽等机制以代偿衰老引起的退变，因此尚不至于引起行为学的改变。老年学习记忆损害鼠脑缺失型mtDNA比例进一步增加时，这些老年个体脑缺失型mtDNA所带来的损伤，就超过其神经元的代偿能力，此时线粒体能量代谢降低以及线粒体和其他亚细胞结构损伤加重，导致神经元的信息加工功能严重障碍，从而引起学习记忆能力下降。可见海马及皮质在衰老记忆减退的分子机制中发挥重要作用。小脑的缺失型mtDNA比例在老年学习记忆正常组增加较海马和皮质明显要低，但在老年学习记忆减退鼠小脑的缺失型mtDNA比例较老年学习记忆正常鼠明显增高，其幅度超过了海马和皮质，提示小脑的衰老性退变可能与学习记忆减退有一定的关系。
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以上结果显示衰老时脑组织缺失型mtDNA增多，而老年学习记忆减退鼠较老年学习记忆正常鼠mtDNA缺失进一步成倍增加。表明相关脑区的mtDNA缺失在老年学习记忆减退的细胞分子机制中发挥重要作用。
[基金项目] 国家自然科学基金资助
[参 考 文 献]
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[收稿日期]1999-03-19 [修回日期]1999-09-14
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