钙及活性氧在大鼠肾缺血再灌流损伤中的作用
作者：沙继宏 叶煦亭 吴莉丽 吴越 杨勇骥 郑尊
单位：(第二军医大学细胞生物学教研室，上海 200433)
关键词：局部缺血；再灌注；钙；氧
中国病理生理杂志000614 [摘 要] 目的和方法：应用电镜细胞化学方法，对缺血-再灌流损伤过程中活性氧的产生及细胞内钙变化情况进行研究。结果：缺血期，细胞内钙明显增多，而此时尚无H2O2产生；缺血后再灌流早期H2O2大量产生，细胞内钙与缺血期类似；再灌流晚期H2O2产生有所减少，而细胞内钙持续增高。结论：钙及活性氧都参与缺血再灌流损伤，但其参与时机及作用并不相同。
[中图分类号] R363 R363 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0531-04
The effects of calcium and reactive oxygen species in rat kidney during ischemia and reperfusion period
SHA Ji-hong, YE Xu-ting, WU Li-li, WU Yue, YAN Yong-ji, ZHEN Zun
(Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
[Abstract] AIM and METHODS: Electron cytochemical methods were used to study the changes of calcium and reactive oxygen species in rat kidney during ischemia and reperfusion period.RESULTS:By the end of 1h ischemia, intra-cellular calcium increased. There were no H2O2 generation at this time. In the early reperfusion period, large amount of H2O2 generated. At this time, there were no evident changes of intra-cellular calcium compare with 1h ischemia group. In the later reperfusion period, less H2O2 generated. Intra-cellular calcium increased continuously.CONCLUSION:Calcium and reactive oxygen species all participated in ischemia-reperfusion injury, but the time they participated and their effects were different.
, 百拇医药
[MeSH] Ischemia; Reperfusion; Calcium; Oxygen
关于缺血-再灌注损伤，涉及到许多因素，其中活性氧的产生及钙代谢紊乱占有很重要的位置[1、2]。但其相互关系尚未彻底明了，对此，本实验以大鼠肾缺血再灌流损伤为模型，应用电镜细胞化学方法定位H2O2(活性氧之一)产生情况，应用电镜细胞化学显示细胞内钙并对其进行EDX微区分析，对H2O2及钙在缺血-再灌流损伤中的作用进行讨论。
材 料 和 方 法
一、实验动物与模型
雄性SD大鼠，体重200～250 g，1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，打开腹腔，分离左肾蒂，用小动脉夹夹住肾血管造成肾缺血。动物分组如下：(1)正常对照组；(2)缺血1 h组；(3)缺血1 h再灌流组，又分为再灌流0.5 h、1 h、2 h、4 h、12 h组。每组6只大鼠。
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二、实验方法
(一) 氧自由基细胞化学 模型制备后，从动脉向肾脏灌流含铈生理溶液5 min(溶液配方：CeCl3 1 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，KCl 4 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，使用前向其中吹氧)，再用3%多聚甲醛灌流固定。也可不用灌流固定，在含铈生理溶液中将肾脏切成小块浸泡5 min，然后再用多聚甲醛固定。固定后漂洗、锇酸后固定、脱水，Epon-812包埋，切片染色后在日立H-800电镜下观察。该细胞化学为定位过氧化氢(H2O2)，实则代表了活性氧产生情况[3，4]。
(二)细胞内钙分布定位 取肾脏皮质部分切成小块，用3%戊二醛-90 mmol/L草酸钾浸泡固定4 h以上，含90 mmol/L草酸钾溶液漂洗，1%锇酸-2%焦锑酸钾后固定2 h，脱水、包埋、切片同前[5]，切片不染色。
, 百拇医药
(三)EDX分析 将载有钙细胞化学定位切片(厚100 nm)的尼龙网在高真空镀膜机内喷镀碳膜，用H-800高透射扫描系统(9100/60)进行能谱分析，扫描面积为2 μm2在15 000放大倍率下进行，计数时间为100 s。
(四)统计处理 数据以
±s表示，均数差异的显著性以t检验和方差分析进行检验。
结 果
活性氧细胞化学显示：正常对照组为阴性；缺血1 h组，有少量电子致密沉积物位于肿胀的血管内皮细胞血管腔面(图1)；再灌流0.5 h组，可见有大量电子致密沉积物，主要位于血管内皮细胞血管腔面、基底层(图2)；再灌流1～2 h，电子致密沉积物存在情况基本同再灌流0.5 h组，有时毛细血管旁肾小管上皮细胞基底部也可见有大量电子致密沉积物。再灌流4～12 h，血管内皮细胞血管腔面及其附近仍有电子致密物沉积，但明显减少，虽然此时血管内皮细胞及肾小管上皮细胞损伤进一步加重。
, 百拇医药
细胞内钙显示：正常对照组，钙以细小颗粒状态存在于肾小管上皮细胞线粒体、核、胞浆中(图3)，血管内皮细胞线粒体、核内也可见有细小颗粒沉淀。缺血1 h组，肾小管上皮细胞及血管内皮细胞内钙颗粒沉积明显增多，主要位于线粒体及胞浆(图4)。缺血后再灌流0.5～2 h，与缺血1 h类似，明显高于正常。再灌流4～24 h，细胞内钙颗粒沉积持续增高，部分区域可钙化。
Fig 1 1 h after ischemia, there was little dense materials on the luminal face of endothelium(bar=0.5 μm)
图1 缺血1 h组，有少量电子致密沉积物位于肿胀的血管内皮细胞血管腔面(标尺=0.5 μm)
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Fig 2 0.5 h after reperfusion, there were large amount of dense materials on the luminal face of endothelium and endothelium lumina(bar=0.5 μm)
图2 再灌流0.5 h组，血管内皮细胞血管腔面、基底层有大量电子致密沉积物(标尺=0.5 μm)
Fig 3 In normal control group, there were a little calcium position in mitochondria of proximal tubule cells(bar=0.5 μm).
图3 正常对照组，肾小管上皮细胞线粒体内可见有少量细小钙颗粒沉淀(标尺=0.5 μm)
, 百拇医药
Fig 4 1 h after ischemia, calcium position, mainly in mitochondria and cytoplasm, increased in proximal tubule cells (bar=0.5 μm)
图4 缺血1 h组，肾小管上皮细胞内钙颗粒沉积增多，主要位于线粒体及胞浆(标尺=0.5 μm)
EDX分析：以肾近曲小管上皮细胞为观察对象，对典型正常及缺血损伤细胞进行扫描分析，每组分析9～12个区域，部位为胞浆及线粒体，显示钙重量百分比，钙半定量统计结果为：缺血及缺血后再灌流导致线粒体及胞浆内钙含量明显高于正常，再灌流晚期升高尤为明显(表1)。
表1 线粒体及胞浆中钙含量半定量分析
Tab 1 Semi-quantitative analysis of calcium in
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mitochondria and cytoplasm (wt%,±s) Group
n
Mitochondria
Cytoplasm
Normal control
10
0.61±0.10
0.57±0.11
1 h-ischemia
11
, 百拇医药
1.77±0.17**
2.13±0.26**
0.5 h-reflow
10
1.75±0.20**
2.00±0.21**
1 h-reflow
10
1.74±0.23**
1.88±0.27**
, 百拇医药
2 h-reflow
10
1.73±0.27**
1.56±0.20**
4 h-reflow
12
2.02±0.31**
1.81±0.22**
12 h-reflow
10
2.81±0.36**
, 百拇医药
2.57±0.31**
24 h-reflow
9
3.21±0.43**
2.78±0.35**
**P<0.01, vs normal control group讨 论
本实验结果表明缺血期即可导致细胞内钙大量增多，这与有关文献报道一致，一般认为缺血时ATP缺乏，导致Ca2+-ATPase活性下降，Ca2+外排减少，另外Ca2+内流可能也增多，从而细胞内钙含量增高。缺血期基本没有过氧化氢(活性氧之一)产生，因为活性氧的产生需要条件之一就是氧，而缺血自然基本无氧的供给。
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活性氧包括氧自由基及过氧化氢，氧自由基可转变为过氧化氢，过氧化氢对细胞及组织也有明显损伤作用。本实验结果表明再灌流早期，过氧化氢即大量产生，尤其在最初几小时内，但在再灌流后期，过氧化氢的产生有所减少，这与有关实验报道再灌流期组织活性氧代谢产物逐渐增高的现象并不矛盾，因为活性氧之一过氧化氢的产生虽然有所减少，但损伤效果可以累加起来。通常氧自由基的半衰期很短，故检测较难。过氧化氢的半衰期相对较长，本实验就是检测过氧化氢。过氧化氢可与铈离子反应形成Ce(OH)2OOH，该物质在电镜下观察为电子致密物质[3，4]。过氧化氢与铈离子反应很快，反应之后过氧化氢含量下降，又有利于其他氧自由基转化为过氧化氢，故该方法基本可反映整个活性氧产生情况。关于氧自由基的来源，可能为血管内皮细胞及粒细胞所产生[6]。因为血管内皮细胞含有黄嘌呤氧化酶系，在缺血状态下，首先形成超氧阴离子自由基，进一步转化为过氧化氢。另外，缺血再灌流可使粒细胞激活，粒细胞激活后，也可产生氧自由基。缺血后再灌流期细胞内钙的变化与氧自由基的产生却不同，再灌流早期比缺血期有所减少，这可能是与Ca2+-ATPase活性的一定程度恢复有关，再灌流后期逐渐增高，则可能是由于细胞膜结构的破坏所致[7]。
, 百拇医药
综上所述，钙及活性氧都参与缺血再灌流损伤，但其参与时机及作用并不相同。
[参 考 文 献]
[1] 尤家禄. 缺血-再灌注损伤[M]. 见：王迪浔，金惠铭主编. 病理生理学. 北京：人民卫生出版社，1994. 366～380.
[2] Kaneko M, Matsumoto Y, Hayashi H. Oxygen free radicals and calcium homeostasis in the heart[J]. Mol Cell Biochem, 1994, 139:91～100.
[3] Shlafer M, Brosamer K, Forder JR, et al. Cerium chloride as a histochemical marker of hydrogen peroxide in reperfused ischemic hearts[J]. J Mol Cell Cardiol, 1990, 22:83～87.
, 百拇医药
[4] Karnovsky MJ. Cytochemistry and reactive oxygen species: a retrospective[J]. Histochemistry, 1994, 102:15～27.
[5] Borgers M, Thone F, Verheyen A, et al. Localization of calcium in skeletal and cardiac muscle[J]. Histochem J, 1984, 16:295～309.
[6] 沙继宏，叶煦亭，郑尊，等. 大鼠肾缺血再灌流时近曲小管上皮细胞内钙含量变化[J]. 基础医学与临床，1997，17(1)：50～53.
[收稿日期]1999-03-18 [修回日期]1999-07-14, 百拇医药
单位：(第二军医大学细胞生物学教研室，上海 200433)
关键词：局部缺血；再灌注；钙；氧
中国病理生理杂志000614 [摘 要] 目的和方法：应用电镜细胞化学方法，对缺血-再灌流损伤过程中活性氧的产生及细胞内钙变化情况进行研究。结果：缺血期，细胞内钙明显增多，而此时尚无H2O2产生；缺血后再灌流早期H2O2大量产生，细胞内钙与缺血期类似；再灌流晚期H2O2产生有所减少，而细胞内钙持续增高。结论：钙及活性氧都参与缺血再灌流损伤，但其参与时机及作用并不相同。
[中图分类号] R363 R363 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0531-04
The effects of calcium and reactive oxygen species in rat kidney during ischemia and reperfusion period
SHA Ji-hong, YE Xu-ting, WU Li-li, WU Yue, YAN Yong-ji, ZHEN Zun
(Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
[Abstract] AIM and METHODS: Electron cytochemical methods were used to study the changes of calcium and reactive oxygen species in rat kidney during ischemia and reperfusion period.RESULTS:By the end of 1h ischemia, intra-cellular calcium increased. There were no H2O2 generation at this time. In the early reperfusion period, large amount of H2O2 generated. At this time, there were no evident changes of intra-cellular calcium compare with 1h ischemia group. In the later reperfusion period, less H2O2 generated. Intra-cellular calcium increased continuously.CONCLUSION:Calcium and reactive oxygen species all participated in ischemia-reperfusion injury, but the time they participated and their effects were different.
, 百拇医药
[MeSH] Ischemia; Reperfusion; Calcium; Oxygen
关于缺血-再灌注损伤，涉及到许多因素，其中活性氧的产生及钙代谢紊乱占有很重要的位置[1、2]。但其相互关系尚未彻底明了，对此，本实验以大鼠肾缺血再灌流损伤为模型，应用电镜细胞化学方法定位H2O2(活性氧之一)产生情况，应用电镜细胞化学显示细胞内钙并对其进行EDX微区分析，对H2O2及钙在缺血-再灌流损伤中的作用进行讨论。
材 料 和 方 法
一、实验动物与模型
雄性SD大鼠，体重200～250 g，1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，打开腹腔，分离左肾蒂，用小动脉夹夹住肾血管造成肾缺血。动物分组如下：(1)正常对照组；(2)缺血1 h组；(3)缺血1 h再灌流组，又分为再灌流0.5 h、1 h、2 h、4 h、12 h组。每组6只大鼠。
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二、实验方法
(一) 氧自由基细胞化学 模型制备后，从动脉向肾脏灌流含铈生理溶液5 min(溶液配方：CeCl3 1 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，KCl 4 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，使用前向其中吹氧)，再用3%多聚甲醛灌流固定。也可不用灌流固定，在含铈生理溶液中将肾脏切成小块浸泡5 min，然后再用多聚甲醛固定。固定后漂洗、锇酸后固定、脱水，Epon-812包埋，切片染色后在日立H-800电镜下观察。该细胞化学为定位过氧化氢(H2O2)，实则代表了活性氧产生情况[3，4]。
(二)细胞内钙分布定位 取肾脏皮质部分切成小块，用3%戊二醛-90 mmol/L草酸钾浸泡固定4 h以上，含90 mmol/L草酸钾溶液漂洗，1%锇酸-2%焦锑酸钾后固定2 h，脱水、包埋、切片同前[5]，切片不染色。
, 百拇医药
(三)EDX分析 将载有钙细胞化学定位切片(厚100 nm)的尼龙网在高真空镀膜机内喷镀碳膜，用H-800高透射扫描系统(9100/60)进行能谱分析，扫描面积为2 μm2在15 000放大倍率下进行，计数时间为100 s。
(四)统计处理 数据以
±s表示，均数差异的显著性以t检验和方差分析进行检验。结 果
活性氧细胞化学显示：正常对照组为阴性；缺血1 h组，有少量电子致密沉积物位于肿胀的血管内皮细胞血管腔面(图1)；再灌流0.5 h组，可见有大量电子致密沉积物，主要位于血管内皮细胞血管腔面、基底层(图2)；再灌流1～2 h，电子致密沉积物存在情况基本同再灌流0.5 h组，有时毛细血管旁肾小管上皮细胞基底部也可见有大量电子致密沉积物。再灌流4～12 h，血管内皮细胞血管腔面及其附近仍有电子致密物沉积，但明显减少，虽然此时血管内皮细胞及肾小管上皮细胞损伤进一步加重。
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细胞内钙显示：正常对照组，钙以细小颗粒状态存在于肾小管上皮细胞线粒体、核、胞浆中(图3)，血管内皮细胞线粒体、核内也可见有细小颗粒沉淀。缺血1 h组，肾小管上皮细胞及血管内皮细胞内钙颗粒沉积明显增多，主要位于线粒体及胞浆(图4)。缺血后再灌流0.5～2 h，与缺血1 h类似，明显高于正常。再灌流4～24 h，细胞内钙颗粒沉积持续增高，部分区域可钙化。
Fig 1 1 h after ischemia, there was little dense materials on the luminal face of endothelium(bar=0.5 μm)
图1 缺血1 h组，有少量电子致密沉积物位于肿胀的血管内皮细胞血管腔面(标尺=0.5 μm)
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Fig 2 0.5 h after reperfusion, there were large amount of dense materials on the luminal face of endothelium and endothelium lumina(bar=0.5 μm)
图2 再灌流0.5 h组，血管内皮细胞血管腔面、基底层有大量电子致密沉积物(标尺=0.5 μm)
Fig 3 In normal control group, there were a little calcium position in mitochondria of proximal tubule cells(bar=0.5 μm).
图3 正常对照组，肾小管上皮细胞线粒体内可见有少量细小钙颗粒沉淀(标尺=0.5 μm)
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Fig 4 1 h after ischemia, calcium position, mainly in mitochondria and cytoplasm, increased in proximal tubule cells (bar=0.5 μm)
图4 缺血1 h组，肾小管上皮细胞内钙颗粒沉积增多，主要位于线粒体及胞浆(标尺=0.5 μm)
EDX分析：以肾近曲小管上皮细胞为观察对象，对典型正常及缺血损伤细胞进行扫描分析，每组分析9～12个区域，部位为胞浆及线粒体，显示钙重量百分比，钙半定量统计结果为：缺血及缺血后再灌流导致线粒体及胞浆内钙含量明显高于正常，再灌流晚期升高尤为明显(表1)。
表1 线粒体及胞浆中钙含量半定量分析
Tab 1 Semi-quantitative analysis of calcium in
, http://www.100md.com
mitochondria and cytoplasm (wt%,
±s) Groupn
Mitochondria
Cytoplasm
Normal control
10
0.61±0.10
0.57±0.11
1 h-ischemia
11
, 百拇医药
1.77±0.17**
2.13±0.26**
0.5 h-reflow
10
1.75±0.20**
2.00±0.21**
1 h-reflow
10
1.74±0.23**
1.88±0.27**
, 百拇医药
2 h-reflow
10
1.73±0.27**
1.56±0.20**
4 h-reflow
12
2.02±0.31**
1.81±0.22**
12 h-reflow
10
2.81±0.36**
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2.57±0.31**
24 h-reflow
9
3.21±0.43**
2.78±0.35**
**P<0.01, vs normal control group讨 论
本实验结果表明缺血期即可导致细胞内钙大量增多，这与有关文献报道一致，一般认为缺血时ATP缺乏，导致Ca2+-ATPase活性下降，Ca2+外排减少，另外Ca2+内流可能也增多，从而细胞内钙含量增高。缺血期基本没有过氧化氢(活性氧之一)产生，因为活性氧的产生需要条件之一就是氧，而缺血自然基本无氧的供给。
, http://www.100md.com
活性氧包括氧自由基及过氧化氢，氧自由基可转变为过氧化氢，过氧化氢对细胞及组织也有明显损伤作用。本实验结果表明再灌流早期，过氧化氢即大量产生，尤其在最初几小时内，但在再灌流后期，过氧化氢的产生有所减少，这与有关实验报道再灌流期组织活性氧代谢产物逐渐增高的现象并不矛盾，因为活性氧之一过氧化氢的产生虽然有所减少，但损伤效果可以累加起来。通常氧自由基的半衰期很短，故检测较难。过氧化氢的半衰期相对较长，本实验就是检测过氧化氢。过氧化氢可与铈离子反应形成Ce(OH)2OOH，该物质在电镜下观察为电子致密物质[3，4]。过氧化氢与铈离子反应很快，反应之后过氧化氢含量下降，又有利于其他氧自由基转化为过氧化氢，故该方法基本可反映整个活性氧产生情况。关于氧自由基的来源，可能为血管内皮细胞及粒细胞所产生[6]。因为血管内皮细胞含有黄嘌呤氧化酶系，在缺血状态下，首先形成超氧阴离子自由基，进一步转化为过氧化氢。另外，缺血再灌流可使粒细胞激活，粒细胞激活后，也可产生氧自由基。缺血后再灌流期细胞内钙的变化与氧自由基的产生却不同，再灌流早期比缺血期有所减少，这可能是与Ca2+-ATPase活性的一定程度恢复有关，再灌流后期逐渐增高，则可能是由于细胞膜结构的破坏所致[7]。
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综上所述，钙及活性氧都参与缺血再灌流损伤，但其参与时机及作用并不相同。
[参 考 文 献]
[1] 尤家禄. 缺血-再灌注损伤[M]. 见：王迪浔，金惠铭主编. 病理生理学. 北京：人民卫生出版社，1994. 366～380.
[2] Kaneko M, Matsumoto Y, Hayashi H. Oxygen free radicals and calcium homeostasis in the heart[J]. Mol Cell Biochem, 1994, 139:91～100.
[3] Shlafer M, Brosamer K, Forder JR, et al. Cerium chloride as a histochemical marker of hydrogen peroxide in reperfused ischemic hearts[J]. J Mol Cell Cardiol, 1990, 22:83～87.
, 百拇医药
[4] Karnovsky MJ. Cytochemistry and reactive oxygen species: a retrospective[J]. Histochemistry, 1994, 102:15～27.
[5] Borgers M, Thone F, Verheyen A, et al. Localization of calcium in skeletal and cardiac muscle[J]. Histochem J, 1984, 16:295～309.
[6] 沙继宏，叶煦亭，郑尊，等. 大鼠肾缺血再灌流时近曲小管上皮细胞内钙含量变化[J]. 基础医学与临床，1997，17(1)：50～53.
[收稿日期]1999-03-18 [修回日期]1999-07-14, 百拇医药