瓜蒌注射液对兔血管平滑肌细胞增殖细胞核抗原表达的影响
作者：李自成 常青
单位：李自成(暨南大学医学院第一附属医院心内科， 广东 广州 510630)；常青(暨南大学医学院组织学与胚胎学教研室)
关键词：瓜蒌；中草药；肌,平滑，血管；细胞；抗原
中国病理生理杂志000610
[摘 要] 目的：观察瓜蒌注射液对血管平滑肌细胞(SMC)增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法：用免疫组织化学LSAB法检测培养的兔主动脉SMC中PCNA的表达，液闪法测定SMC氚-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入量，同时测定培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物(LPO)、前列环素(PGI2)及环磷酸腺苷(cAMP)的含量。结果：瓜蒌注射液能增加SOD活性，降低LPO和升高PGI2、cAMP水平，抑制SMC的[3H]-TdR掺入量和PCNA的表达(P均<0.05，0.01)。结论：瓜蒌有抑制SMC增殖的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R543.5 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0516-03
Effect of trichosanthes injection on expression of proliferating cell nuclear antigen of vascular smooth muscle cell in rabbit
LI Zi-cheng, CHANG Qing
(Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital,Medical College of Jinan University, Guangzhou 510630，China)
, 百拇医药 [Abstract] AIM: To observe the effect of thichosanthes injection on the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) of vascular smooth muscle cell (SMC). METHODS: The expression of PCNA of cultured rabbit aortic SMC was examined with LSAB immunohistochemical technique, and [3H]-thymidine([3H]-TdR) incorporation data of SMC and the contents of superoxide dismutase (SOD), lipid peroxide (LPO), prostacyclin (PGI2) and cyclic AMP (cAMP) in medium were simultaneously determined. RESULTS: Thichosanthes injection has an effects of increasing SOD activity, decreasing LPO, elevating PGI2 and cAMP, reducing [3H]-TdR incorporation and expression of PCNA (all P<0.05,P<0.01). CONCLUSION: Thichosanthes could inhibit SMC proliferation.
, http://www.100md.com
[MeSH] Thichosanthes； Drugs, Chinese herbal; Muscle, smooth, vascular； Cells； Antigens
血管平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)的增殖是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)形成和经皮冠状动脉腔内血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)后再狭窄发生的关键因素[1]。为了防治AS及PTCA后再狭窄，人们不断地寻找抑制SMC增殖的药物。瓜蒌是临床上常用的中药，实验研究表明，瓜蒌有降血脂、抑制血小板、抗血栓和抗氧化等作用[2,3]。本文通过免疫组织化学LSAB法检测培养的兔主动脉SMC的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表达，液闪法测定SMC的氚-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入量，同时测定培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物(LPO)、前列环素(PGI2)及环磷酸腺苷(cAMP)的含量，观察瓜蒌注射液对SMC的PCNA表达的影响，进一步探讨瓜蒌抑制SMC增殖的机制。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、实验材料
胎牛血清和M199培养基(均为美国Gibco公司产品)。PCNA抗血清和LSAB试剂盒(均为丹麦Dako公司产品)。纯种日本大耳白家兔，体重1.4～1.5 kg，雌雄不限。瓜蒌注射液为上海第一制药厂产品，批号870327, 每支2 mL含生药10 g, 系从生药葫芦科植物栝楼的干燥果皮中提取制成。LPO
测试盒(本院病理生理教研室提供)。[3H]-TdR 、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)和cAMP测试盒(分别由中国原子能科学研究院和上海中医药大学核医学研究室提供)。Tiger 920G图象分析仪(重庆大学ICT研究所)。
二、兔主动脉SMC培养
, 百拇医药
原代培养采用组织贴块法，培养液为20% 胎牛血清的M199培养基。颈动脉放血处死兔，无菌条件下取出主动脉弓、胸段，放入D-Hanks液中清洗，剥净外膜后用弯头吸管轻轻刮除内膜，撕取内2/3层中膜组织，剪成约1 mm×1 mm×1 mm的小组织块接种于培养瓶内，让其贴壁1 h后加培养液1 mL， 置37℃、 5%CO2培养箱内培养24 h后补液至2 mL，然后每隔3～5 d换液，倒置显微镜下动态观察细胞生长情况。待细胞生长融合出现“峰与谷”结构后，用含0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液消化、传代培养。
三、[3H]-TdR掺入量测定
液闪法。选用生长良好的第3至第4代SMC，用培养液调整细胞密度为5×104个/mL，接种于24孔培养板，每孔0.5 mL。培养48 h后更换培养液，对照组不加药，瓜蒌组加瓜蒌注射液，分为6个浓度组，终浓度分别为每毫升培养液中瓜蒌生药含量20 mg、 10 mg、 5 mg、 1 mg、 0.5 mg、 0.1 mg。培养24 h后收样，于收样前6 h每孔内加[3H]-TdR 3.7×104 Bq用0.1 mol/L氢氧化钠溶解细胞后，将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，液体闪烁计数仪测定各样本的[3H]-TdR每分钟放射脉冲数(CPM, counts/min)。
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四、PCNA检测
免疫组化LSAB法。选用生长良好的第4至第5代SMC，用培养液调整细胞密度为2×105个/mL，接种在小培养皿内的盖玻片上，每片0.1 mL，让其贴壁后从培养皿周边加培养液至1.5 mL，置培养箱中培养，待细胞生长成片状时，分为两组给以不同条件培养，对照组不加药, 瓜蒌组加瓜蒌注射液(终浓度为每毫升培养液中生药含量10 mg)，培养24 h后取出盖片，用D-Hanks液洗去培养液，普通滤纸吸去盖片上的液体，冷丙酮∶甲醇(1∶1)混合液固定20 min，吹干。将盖片用透明胶带固定在洁净的载玻片上(注意细胞面朝上)，按下列步骤染色：①实验片滴加抗PCNA血清(1∶80)，阴性对照片滴加0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS)，4℃过夜。②上述PBS洗3次，每次5 min(以下均同)。③滴加生物素化抗兔IgG，37 ℃下作用30 min。④PBS洗。⑤3% H2O2，37℃下作用30 min后，弃H2O2。⑥滴加LSAB复合物，37℃下作用30 min。⑦PBS洗。⑧联苯二胺(DAB)显色，约5 min 。⑨自来水冲洗。⑩常规脱水、透明、封片。PCNA阳性细胞核染成棕黄色，阴性细胞核为无色。每张细胞片在Tiger 920 G图象分析仪上用交互测量法随机计算10个高倍视野中PCNA阳性细胞数及SMC总数，求出PCNA阳性细胞百分率。
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五、培养液中SOD活性、LPO、PGI2和cAMP含量测定
收集上述培养皿中的培养液，离心10 min(1 000 r/min)，取上清液作为待测样品。SOD测定采用邻苯三酚自氧化抑制法，以每毫升培养液中SOD活性单位(U/mL)表示。LPO测定采用改良TBA微量法，以LPO的稳定终产物丙二醛(MDA)浓度(nmol/L)表示。PGI2的稳定代谢产物6-keto-PGF1α和cAMP含量测定采用放免法。
六、 统计学处理
计量资料以
±s表示，采用两组均数比较的t检验。计数资料以率(%)表示，采用χ2检验。
结 果
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一、瓜蒌注射液对培养的兔主动脉SMC [3H]-TdR掺入量的影响(表1)。
表1 瓜蒌注射液对培养的兔主动脉SMC [3H]-TdR
掺入量的影响
Tab 1 Effect of thichosanthes injection on ([3H]-TdR)
incorporation data of cultured rabbit aortic SMC Group
Concentration
(mg/mL)
n
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Counts/min
(±s)
Inhibitory
rate(%)
Control
─
12
554.5±151.1
—
Thichosanthes
20
, 百拇医药
10
384.3±107.5**
30.7
10
10
407.1±118.1*
26.6
5
10
425.4±103.8*
23.3
1
, 百拇医药
10
437.6±100.2*
21.1
0.5
10
457.7±135.7
17.5
0.1
10
503.4±137.2
9.2
* P< 0.05，** P< 0.01， vs control group
, 百拇医药
二、瓜蒌对SMC中PCNA表达的影响
结果显示，瓜蒌组PCNA阳性细胞百分率为57.1%，对照组为62.2%，有显著差异(χ2=5.40, P<0.05)。
三、瓜蒌对培养液中SOD活性、LPO、PGI2和cAMP含量的影响(表2)
结果显示，瓜蒌组SOD、PGI2和cAMP水平均显著高于对照组，而MDA则显著低于对照组。
表2 瓜蒌注射液对培养液中SOD、LPO、PGI2和cAMP水平的影响
Tab 2 Effect of thichosanthes injection on levels of superoxide dismutase (SOD)
, 百拇医药
lipid peroxide (LPO), prostacyclin (PGI2) and cyclic AMP (cAMP) in medium(±s,n=10) Group
SOD(U/mL)
MDA(nmol/L)
6-keto-PGF1α(pg/mL)
cAMP(pg/mL)
Control
68.8±16.8
2.98±0.81
, 百拇医药
354.8±134.5
1.599±0.567
Thichosanthes
85.4±18.4*
2.27±0.65*
516.2±169.1*
2.453±0.746**
* P<0.05，** P< 0.01, vs control group讨 论
胸腺嘧啶核苷是脱氧核糖核酸(DNA)合成的原料，如果SMC增殖快速，DNA合成活跃，摄取[3H]-TdR增多，则细胞中的CPM值升高；反之，SMC增殖受抑制，则CPM值降低。因此，测定[3H]-TdR掺入量能反映SMC的增殖状态。本文结果显示，瓜蒌组中，20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL和1 mg/mL 4个浓度组的CPM值均显著低于对照组；结果说明，瓜蒌注射液有抑制SMC增殖的作用。
, http://www.100md.com
PCNA是一种核内蛋白质，它的表达与细胞增殖有关。PCNA的含量在细胞周期的G1期开始增加，S期达到高峰，G2、M期降低，G0期不能测到，其量的变化与DNA合成一致，静止细胞PCNA表达极低，增殖活跃细胞PCNA表达明显增加[4]。因此，检测PCNA是评价细胞增殖状态的可靠指标。Speir等认为[5]，引起细胞增殖的多种信号途径必须汇集在G1/S期交界处并具有一个DNA复制的共同机制。PCNA是DNA聚合酶δ的辅助因子[4]。实验证明，PCNA表达为细胞进入细胞周期进行DNA复制和分裂所必须，应用反义PCNA寡核苷酸能有效抑制SMC的PCNA表达和SMC增殖[5]。本文显示，瓜蒌注射液能显著抑制SMC的PCNA表达，结果与[3H]-TdR掺入量一致，从两个不同的方面证明了瓜蒌注射液有抑制SMC增殖的作用。
cAMP是细胞内重要的第二信使物质，参与细胞增殖的调控。cAMP水平升高，可通过阻止细胞由G1期向M期的进程，从而抑制细胞的增殖[6]。现已证明，SMC可合成PGI2，PGI2能直接激活腺苷酸环化酶，使cAMP水平增加。近来研究发现，氧自由基能明显增加SMC的sis基因表达，促使SMC增殖[7]。氧自由基介导产生的LPO能抑制PGI2合成酶，减少PGI2的生成。实验表明，瓜蒌有增加SOD活性， 清除氧自由基，降低MDA ，升高PGI2的作用[8～10]。本文结果提示，瓜蒌可能通过增加SOD活性，降低LPO , 升高PGI2和cAMP水平，抑制SMC增殖。瓜蒌的上述作用最终是否通过影响PCNA表达来抑制SMC增殖，还有待进一步研究。本文结果表明，瓜蒌抑制SMC的PCNA表达和SMC增殖的作用为瓜蒌防治AS和PTCA后再狭窄提供了理论依据。
, 百拇医药
[基金项目] 国务院侨办重点基金和广东省中医药管理局科研基金资助 国务院侨办重点基金和广东省中医药管理局科研基金资助
[参 考 文 献]
[1] Ross R. Atherosclerosis—— an inflammatory disease[J]. N Engl J Med, 1999, 340(2): 115～126.
[2] 贝伟剑，赵 一. 瓜蒌薤白汤的药理作用[J]. 中国医药学报, 1989, 4(5): 21～23.
[3] 巢志茂，何 波，敖 平. 瓜蒌的化学成分研究进展[J]. 国外医学中医中药分册, 1998, 20(2):7～10.
[4] 李自成，李庚山，黄从新，等. 大蒜素对血管平滑肌细胞增殖细胞核抗原表达的影响[J]. 中国中西医结合杂志，1997，17(10)：614～615.
, 百拇医药
[5] Speir E, Epstein SE. Inhibition of smooth muscle cell proliferation by an antisense oligodeoxynucleotide targeting the mRNA encoding PCNA[J]. Circulation, 1992, 86:538～547.
[6] 郑广华，主编. 细胞内信使系统[M]. 广州: 广东高等教育出版社, 1988.48～86.
[7] Gadiparthi NR, Bradford CB. Active oxygen species stimulate vascular smooth muscle cell growth and proto-oncogene expression[J]. Circ Res, 1992， 70: 593～599.
[8] 鲁 翔, 凌 宏, 董传仁, 等. 瓜蒌和心得安对家兔急性心肌梗塞后血小板聚集性及PGI2-TXA2平衡的影响[J]. 中国病理生理杂志, 1988， 4(1): 43～46.
[9] 谌 辉, 凌 宏, 董传仁. 布洛芬、瓜蒌对急性心肌梗塞再灌注损伤的保护作用[J]. 中国循环杂志, 1989， 4(2): 143～145.
[10] 欧阳静萍, 涂淑珍, 刘金保, 等. 瓜蒌对大鼠缺血心肌膜酶、膜脂和膜脂质过氧化作用的研究[J]. 起搏与心脏, 1990， 4(4): 188～191.
[收稿日期] 1999-09-06 [修回日期] 1999-10-20
, 百拇医药
单位：李自成(暨南大学医学院第一附属医院心内科， 广东 广州 510630)；常青(暨南大学医学院组织学与胚胎学教研室)
关键词：瓜蒌；中草药；肌,平滑，血管；细胞；抗原
中国病理生理杂志000610
[摘 要] 目的：观察瓜蒌注射液对血管平滑肌细胞(SMC)增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法：用免疫组织化学LSAB法检测培养的兔主动脉SMC中PCNA的表达，液闪法测定SMC氚-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入量，同时测定培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物(LPO)、前列环素(PGI2)及环磷酸腺苷(cAMP)的含量。结果：瓜蒌注射液能增加SOD活性，降低LPO和升高PGI2、cAMP水平，抑制SMC的[3H]-TdR掺入量和PCNA的表达(P均<0.05，0.01)。结论：瓜蒌有抑制SMC增殖的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R543.5 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0516-03
Effect of trichosanthes injection on expression of proliferating cell nuclear antigen of vascular smooth muscle cell in rabbit
LI Zi-cheng, CHANG Qing
(Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital,Medical College of Jinan University, Guangzhou 510630，China)
, 百拇医药 [Abstract] AIM: To observe the effect of thichosanthes injection on the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) of vascular smooth muscle cell (SMC). METHODS: The expression of PCNA of cultured rabbit aortic SMC was examined with LSAB immunohistochemical technique, and [3H]-thymidine([3H]-TdR) incorporation data of SMC and the contents of superoxide dismutase (SOD), lipid peroxide (LPO), prostacyclin (PGI2) and cyclic AMP (cAMP) in medium were simultaneously determined. RESULTS: Thichosanthes injection has an effects of increasing SOD activity, decreasing LPO, elevating PGI2 and cAMP, reducing [3H]-TdR incorporation and expression of PCNA (all P<0.05,P<0.01). CONCLUSION: Thichosanthes could inhibit SMC proliferation.
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[MeSH] Thichosanthes； Drugs, Chinese herbal; Muscle, smooth, vascular； Cells； Antigens
血管平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)的增殖是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)形成和经皮冠状动脉腔内血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)后再狭窄发生的关键因素[1]。为了防治AS及PTCA后再狭窄，人们不断地寻找抑制SMC增殖的药物。瓜蒌是临床上常用的中药，实验研究表明，瓜蒌有降血脂、抑制血小板、抗血栓和抗氧化等作用[2,3]。本文通过免疫组织化学LSAB法检测培养的兔主动脉SMC的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表达，液闪法测定SMC的氚-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入量，同时测定培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物(LPO)、前列环素(PGI2)及环磷酸腺苷(cAMP)的含量，观察瓜蒌注射液对SMC的PCNA表达的影响，进一步探讨瓜蒌抑制SMC增殖的机制。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、实验材料
胎牛血清和M199培养基(均为美国Gibco公司产品)。PCNA抗血清和LSAB试剂盒(均为丹麦Dako公司产品)。纯种日本大耳白家兔，体重1.4～1.5 kg，雌雄不限。瓜蒌注射液为上海第一制药厂产品，批号870327, 每支2 mL含生药10 g, 系从生药葫芦科植物栝楼的干燥果皮中提取制成。LPO
测试盒(本院病理生理教研室提供)。[3H]-TdR 、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)和cAMP测试盒(分别由中国原子能科学研究院和上海中医药大学核医学研究室提供)。Tiger 920G图象分析仪(重庆大学ICT研究所)。
二、兔主动脉SMC培养
, 百拇医药
原代培养采用组织贴块法，培养液为20% 胎牛血清的M199培养基。颈动脉放血处死兔，无菌条件下取出主动脉弓、胸段，放入D-Hanks液中清洗，剥净外膜后用弯头吸管轻轻刮除内膜，撕取内2/3层中膜组织，剪成约1 mm×1 mm×1 mm的小组织块接种于培养瓶内，让其贴壁1 h后加培养液1 mL， 置37℃、 5%CO2培养箱内培养24 h后补液至2 mL，然后每隔3～5 d换液，倒置显微镜下动态观察细胞生长情况。待细胞生长融合出现“峰与谷”结构后，用含0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液消化、传代培养。
三、[3H]-TdR掺入量测定
液闪法。选用生长良好的第3至第4代SMC，用培养液调整细胞密度为5×104个/mL，接种于24孔培养板，每孔0.5 mL。培养48 h后更换培养液，对照组不加药，瓜蒌组加瓜蒌注射液，分为6个浓度组，终浓度分别为每毫升培养液中瓜蒌生药含量20 mg、 10 mg、 5 mg、 1 mg、 0.5 mg、 0.1 mg。培养24 h后收样，于收样前6 h每孔内加[3H]-TdR 3.7×104 Bq用0.1 mol/L氢氧化钠溶解细胞后，将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，液体闪烁计数仪测定各样本的[3H]-TdR每分钟放射脉冲数(CPM, counts/min)。
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四、PCNA检测
免疫组化LSAB法。选用生长良好的第4至第5代SMC，用培养液调整细胞密度为2×105个/mL，接种在小培养皿内的盖玻片上，每片0.1 mL，让其贴壁后从培养皿周边加培养液至1.5 mL，置培养箱中培养，待细胞生长成片状时，分为两组给以不同条件培养，对照组不加药, 瓜蒌组加瓜蒌注射液(终浓度为每毫升培养液中生药含量10 mg)，培养24 h后取出盖片，用D-Hanks液洗去培养液，普通滤纸吸去盖片上的液体，冷丙酮∶甲醇(1∶1)混合液固定20 min，吹干。将盖片用透明胶带固定在洁净的载玻片上(注意细胞面朝上)，按下列步骤染色：①实验片滴加抗PCNA血清(1∶80)，阴性对照片滴加0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS)，4℃过夜。②上述PBS洗3次，每次5 min(以下均同)。③滴加生物素化抗兔IgG，37 ℃下作用30 min。④PBS洗。⑤3% H2O2，37℃下作用30 min后，弃H2O2。⑥滴加LSAB复合物，37℃下作用30 min。⑦PBS洗。⑧联苯二胺(DAB)显色，约5 min 。⑨自来水冲洗。⑩常规脱水、透明、封片。PCNA阳性细胞核染成棕黄色，阴性细胞核为无色。每张细胞片在Tiger 920 G图象分析仪上用交互测量法随机计算10个高倍视野中PCNA阳性细胞数及SMC总数，求出PCNA阳性细胞百分率。
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五、培养液中SOD活性、LPO、PGI2和cAMP含量测定
收集上述培养皿中的培养液，离心10 min(1 000 r/min)，取上清液作为待测样品。SOD测定采用邻苯三酚自氧化抑制法，以每毫升培养液中SOD活性单位(U/mL)表示。LPO测定采用改良TBA微量法，以LPO的稳定终产物丙二醛(MDA)浓度(nmol/L)表示。PGI2的稳定代谢产物6-keto-PGF1α和cAMP含量测定采用放免法。
六、 统计学处理
计量资料以
±s表示，采用两组均数比较的t检验。计数资料以率(%)表示，采用χ2检验。结 果
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一、瓜蒌注射液对培养的兔主动脉SMC [3H]-TdR掺入量的影响(表1)。
表1 瓜蒌注射液对培养的兔主动脉SMC [3H]-TdR
掺入量的影响
Tab 1 Effect of thichosanthes injection on ([3H]-TdR)
incorporation data of cultured rabbit aortic SMC Group
Concentration
(mg/mL)
n
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Counts/min
(
±s)Inhibitory
rate(%)
Control
─
12
554.5±151.1
—
Thichosanthes
20
, 百拇医药
10
384.3±107.5**
30.7
10
10
407.1±118.1*
26.6
5
10
425.4±103.8*
23.3
1
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10
437.6±100.2*
21.1
0.5
10
457.7±135.7
17.5
0.1
10
503.4±137.2
9.2
* P< 0.05，** P< 0.01， vs control group
, 百拇医药
二、瓜蒌对SMC中PCNA表达的影响
结果显示，瓜蒌组PCNA阳性细胞百分率为57.1%，对照组为62.2%，有显著差异(χ2=5.40, P<0.05)。
三、瓜蒌对培养液中SOD活性、LPO、PGI2和cAMP含量的影响(表2)
结果显示，瓜蒌组SOD、PGI2和cAMP水平均显著高于对照组，而MDA则显著低于对照组。
表2 瓜蒌注射液对培养液中SOD、LPO、PGI2和cAMP水平的影响
Tab 2 Effect of thichosanthes injection on levels of superoxide dismutase (SOD)
, 百拇医药
lipid peroxide (LPO), prostacyclin (PGI2) and cyclic AMP (cAMP) in medium(
±s,n=10) GroupSOD(U/mL)
MDA(nmol/L)
6-keto-PGF1α(pg/mL)
cAMP(pg/mL)
Control
68.8±16.8
2.98±0.81
, 百拇医药
354.8±134.5
1.599±0.567
Thichosanthes
85.4±18.4*
2.27±0.65*
516.2±169.1*
2.453±0.746**
* P<0.05，** P< 0.01, vs control group讨 论
胸腺嘧啶核苷是脱氧核糖核酸(DNA)合成的原料，如果SMC增殖快速，DNA合成活跃，摄取[3H]-TdR增多，则细胞中的CPM值升高；反之，SMC增殖受抑制，则CPM值降低。因此，测定[3H]-TdR掺入量能反映SMC的增殖状态。本文结果显示，瓜蒌组中，20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL和1 mg/mL 4个浓度组的CPM值均显著低于对照组；结果说明，瓜蒌注射液有抑制SMC增殖的作用。
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PCNA是一种核内蛋白质，它的表达与细胞增殖有关。PCNA的含量在细胞周期的G1期开始增加，S期达到高峰，G2、M期降低，G0期不能测到，其量的变化与DNA合成一致，静止细胞PCNA表达极低，增殖活跃细胞PCNA表达明显增加[4]。因此，检测PCNA是评价细胞增殖状态的可靠指标。Speir等认为[5]，引起细胞增殖的多种信号途径必须汇集在G1/S期交界处并具有一个DNA复制的共同机制。PCNA是DNA聚合酶δ的辅助因子[4]。实验证明，PCNA表达为细胞进入细胞周期进行DNA复制和分裂所必须，应用反义PCNA寡核苷酸能有效抑制SMC的PCNA表达和SMC增殖[5]。本文显示，瓜蒌注射液能显著抑制SMC的PCNA表达，结果与[3H]-TdR掺入量一致，从两个不同的方面证明了瓜蒌注射液有抑制SMC增殖的作用。
cAMP是细胞内重要的第二信使物质，参与细胞增殖的调控。cAMP水平升高，可通过阻止细胞由G1期向M期的进程，从而抑制细胞的增殖[6]。现已证明，SMC可合成PGI2，PGI2能直接激活腺苷酸环化酶，使cAMP水平增加。近来研究发现，氧自由基能明显增加SMC的sis基因表达，促使SMC增殖[7]。氧自由基介导产生的LPO能抑制PGI2合成酶，减少PGI2的生成。实验表明，瓜蒌有增加SOD活性， 清除氧自由基，降低MDA ，升高PGI2的作用[8～10]。本文结果提示，瓜蒌可能通过增加SOD活性，降低LPO , 升高PGI2和cAMP水平，抑制SMC增殖。瓜蒌的上述作用最终是否通过影响PCNA表达来抑制SMC增殖，还有待进一步研究。本文结果表明，瓜蒌抑制SMC的PCNA表达和SMC增殖的作用为瓜蒌防治AS和PTCA后再狭窄提供了理论依据。
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[基金项目] 国务院侨办重点基金和广东省中医药管理局科研基金资助 国务院侨办重点基金和广东省中医药管理局科研基金资助
[参 考 文 献]
[1] Ross R. Atherosclerosis—— an inflammatory disease[J]. N Engl J Med, 1999, 340(2): 115～126.
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[收稿日期] 1999-09-06 [修回日期] 1999-10-20
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