IL-1β对培养大鼠胆碱能神经元的影响及机制探讨
作者：康劲松 祝世功 商战平 Li Yue-kui Griffin WST
单位：康劲松 祝世功(白求恩医科大学病理生理教研室， 吉林 长春 130021)；商战平(内蒙古蒙医医学院，内蒙通辽市 028000)；Li Yue-kui Griffin WST(美国阿肯色州立大学医学院)
关键词：白细胞介素-1；乙酰胆碱酯酶；胆碱乙酰基转移酶；细胞，培养的；大鼠
中国病理生理杂志000712 [摘 要] 目的：探讨IL-1β对大鼠胆碱能神经元的影响及机理。方法：检测不同时相、不同脑区的培养神经细胞AChE、BuchE及ChAT的活性和前脑基底、皮层中胆碱酯酶阳性细胞数目。 结果：IL-1β对AChE活性的最大促进作用时相为24 h,皮层、前脑基底和海马部位的AChE活性明显高于对照组(P<0.01)，且能够完全被IL-1ra所阻断； 而小脑、脊髓、基底神经节部位的AChE活性则未见明显变化，同时各组BuchE、ChAT的活性均无明显变化，前脑基底、皮层中胆碱酯酶阳性细胞数目亦未见明显变化。结论：IL-1β能够明显升高特定脑区AChE活性，使乙酰胆碱的生成减少；而AChE活性的增高可能与其基因的转录和翻译增加有关。
, 百拇医药
[中图分类号] R338.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0619-04
Study on the effect and mechanism of IL-1β on cultured cholinergic
neuron in the rat
KANG Jin-song, ZHU Shi-gong
(Department of Pathophysiology, Norman Bethune University of Medical Sciences，Changchun 130021, China)
SHANG Zhan-ping
, 百拇医药
(Nei Monggol traditional Mongolian Medical College, Tongliao 028000)
LI Yue-kui, Griffin WST
(University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock 72205, USA.)
[Abstract] AIM: The effect and mechanism of IL-1β on cultured cholinergic neuron in the rat was studied. METHODS: The acetylcholinesterase (AChE), choline acetyltransferase (ChAT), butyrylcholinesterase (BuchE) activities in different time-phase and different parts of brain were measured. The count number of positive AChE cell in basal forebrain and cortex was also measured. RESULT: It proved that the maximum effect of IL-1β on AChE activity is 24 hour. The AChE activity increased significantly in cortex, basal forebrain and hippocampus, comparing with control (P<0.01,P<0.01,P<0.05), and its effect can be blocked completely by IL-1ra;but there is no change of AChE activity in cerebellum, spinal and basal ganglia. In the same time, the activity of BuchE and ChAT has no change in every group. It was also found that there is no difference in percent of positive AChE cell in cortex and basal forebrain cell . CONCLUSION: IL-1β can only increase the AChE activity of specific parts in brain so that the synthesis of acetylcholine decrease. The increasing activity of AChE maybe related to the transcription and translation of AChE gene.
, 百拇医药
[MeSH] Interleukin-1; Acetylcholinesterase; Choline acetyltransferase; Cells, culture; Rat
老年性痴呆(senile dementia, SD)包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种神经元退变性疾病，主要特征是老年斑和神经纤维缠结形成以及智力障碍，并与中枢胆碱能神经元的大量缺失密切相关。此病的发病机制十分复杂，至今仍未完全阐明。近年研究表明，炎症介质、细胞因子及它们的相互反应环路参与老年性痴呆的发病学，并认为IL-1是其中的一个关键性细胞因子，在细胞因子环路中起核心作用[1]。IL-1过度表达,使星形胶质细胞中的S100β(一种可促进轴突生长的蛋白质)和神经元中的淀粉样蛋白(amyloid protein,AP)过度表达,造成神经元的损伤，而神经元的损伤又可进一步激活小胶质细胞, 促使IL-1更加过度表达，形成恶性循环，最终导致神经元变性死亡。但IL-1与中枢胆碱能系统受损之间的关系,尚未见国内外研究报道。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、主要仪器
Olympus BH-2 倒置显微镜(日本)；CO2 培养箱(美国)； 分光光度仪(美国)；超声碎膜仪(美国)；Tri-carbR液闪分析仪(美国)；神经细胞培养所用试剂为Gibco公司产品，生化测定及组化染色所用试剂均为Sigma公司产品。IL-1β与IL-1ra为 Boehringer Mannheim公司产品。
二、神经细胞培养
按照Paul等的方法[2]，采用Sprague-Dawley胎鼠或子鼠进行原代神经细胞培养。培养皮层、海马、基底神经节和前脑基底神经元选用17～18 d的胎鼠；培养脊髓细胞选用13 d胎鼠；培养小脑神经细胞选用出生5～7 d的仔鼠。将分离出的神经组织加入0.125% 胰酶消化30 min后， 用含10%胎牛血清的DMEM中止酶反应。用吸管吹打制成细胞悬液,以1.0×106个cells/mL的密度接种于多聚-D-赖氨酸包被的60 mm、35 mm的培养皿内。第5 d加入10 μmol/L阿糖胞苷抑制非神经细胞的生长。培养两周的细胞用于实验。实验时将培养液换为无血清培养液,分别加入IL-1β(100 ng/mL)或IL-1ra(500 ng/mL)。 24 h后提取细胞并超声打碎,用BCA法测定蛋白浓度后,-70℃保存备用。
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三、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)及丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,BuchE)活性测定
参照Ellman的方法[3], 将含50 μg 蛋白质的样品分别加入到反应总体积为1 mL的反应体系中。AChE的反应体系为：0.1 mol/L Tris-HCl (pH 7.2),75 mmol/L碘化硫代乙酰胆碱,0.3 mmol/L 5,5'-二硫代双(2'-硝基苯甲酸)(5,5'-dithiobisnitrobenzoic acid),0.1mmol/L 四异丙基焦磷酸酰胺(tetraisopropylpyrophosphoramide, Iso-OMPA)。 BuchE的反应体系为：0.1 mol/L Tris-HCl( pH 7.2), 5 mmol/L 碘化丁酰胆碱,10 μmol/L 1,5-bis(4-allyldimethyl-ammoniumphenyl)pentan-3-one dibromide,BW284c51。然后置37℃水浴中培育30 min，冰浴终止反应。在波长412 nm读取光密度值。
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四、 乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)生物活性测定
按照Fonnum 的放免方法[4]，将含蛋白质200 μg的样品加入到总体积为200 μL的体系中,其内含有 150 mmol/L氯化钠, 5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L 胆碱, 0.1 mmol/L 毒扁豆碱, 0.925×104 Bq[3H]-乙酰辅酶A，孵育30 min。然后加入含 1.5% 四苯硼钠的3-庚酮,震荡混匀, 静止后取75 μL上层液(含有[3H]Ach),放入装有5 mL ScintiVerse Ⅱ的闪烁杯中。用 Tri-carbR液闪分析仪测定counts/min值。
五、 胆碱酯酶细胞化学染色
根据Tago 等的方法并略作改动[5]，将培养细胞用4%多聚甲醛,0.2%戊二醛固定后，用蒸馏水漂洗2次，加入胆碱酯酶孵育液(将0.5 mg/mL碘化硫代乙酰胆碱溶于7.5 mL 0.2mol/L醋酸缓冲液(pH5.8)中，然后加入0.1 mol/L枸橼酸钠 0.5 mL，0.03 mol/L 硫酸铜1 mL，0.005 mol/L 铁氰化钾1 mL)， 37℃孵育2 h，用0.05 mol/L Tris-HCl(pH 7.6) 漂洗2次，加入0.04%DAB显色。
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六、 统计分析
实验数据均以
±s表示，组间差异显著性采用双侧t检验。
结 果
一、IL-1β作用不同时间对胆碱能活性的影响
IL-1β作用12 h、24 h,AChE的活性均明显高于对照组(P<0.01)；而作用48 h,AChE 的活性明显低于12 h和24 h组(P<0.01)，接近对照组水平。表明IL-1β刺激24 h后，AChE的活性最高，而在3个时点对ChAT及BuchE活性未见明显改变(表1)。
表1 IL-1β作用不同时间后大脑皮层胆碱能酶类活性的变化
Tab 1 Changes of cholinergic enzymes activity in cortex treated with IL-1β in different time course(±s) Time
, 百拇医药
Control
Enzyme activity (% of control)
IL-1β
AChE
ChAT
BuchE
12h
1.0000±0.0307
1.5350±0.0675* *
1.0780±0.0245
0.9750±0.0345
, 百拇医药
(6)
(9)
(6)
(6)
24h
1.0000±0.0426
1.6050±0.0580* *
1.0980±0.0109
0.8710±0.0671
(19)
(19)
(6)
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(9)
48h
1.0000±0.0226
1.0420±0.0426##
1.0210±0.0367
0.9010±0.0231
(12)
(9)
(6)
(6)
* * P<0.01, vs control； ## P<0.01, vs IL-1β
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二、IL-1β对不同部位原代神经细胞AChE活性的影响表2 IL-1β作用后不同脑区乙酰胆碱酯酶活性变化
Tab 2 Changes of AChE activity in different part brain
treated with IL-1β(±s) Parts
AChE activity (% of control)
n
Control
n
IL-1β
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Cortex
16
1.0000±0.0426
19
1.6050±0.0580* *
Basal forebrain
6
1.0000±0.1656
4
2.0880±0.0835* *
Hippocampus
, 百拇医药
6
1.0000±0.0106
6
1.2080±0.0334*
Basal ganglia
9
1.0000±0.0492
9
1.0730±0.0492
Spinal
9
1.0000±0.0750
, 百拇医药
9
0.9538±0.1210
Cerebellum
9
1.0000±0.0574
9
1.1111±0.1203
*P<0.05, * * P<0.01, vs control
从表2可以看出：IL-1β分别与不同部位的大鼠原代神经细胞共同培养24 h，基底神经节、脊髓和小脑的AChE活性未见明显改变；而皮层、前脑基底及海马神经细胞的AChE活性均明显高于对照组(P<0.01、 P<0.01、 P<0.05)，以前脑基底和皮层更为显著。
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三、IL-1ra对IL-1β作用的影响
表3显示IL-1 受体阻断剂IL-1ra 对IL-1β引起AChE活性增高变化的影响。用IL-1β直接刺激培养脑皮层细胞后,AChE的活性明显高于对照组(P<0.01)；若同时加入IL-1ra, AChE的活性则明显低于单纯IL-1β组(P<0.01)，而与对照组比较则无显著差异。表3 加入IL-1ra后皮层中乙酰胆碱酯酶活性的变化
Tab 3 Changes of AChE activity in cortex treated
with IL-1ra(±s) Group
n
AChE activity (% of control)
, 百拇医药
Control
9
1.0000±0.0143
IL-1β
12
1.4970±0.0516* *
IL-1β+IL-1ra
9
0.9048±0.0446##
* * P<0.01, vs control； ## P<0.01, vs IL-1β
四、IL-1β对AChE阳性细胞数目的影响
, 百拇医药
为确定AChE活性的增高是否与细胞数目的增多有关,进行AChE阳性细胞组化染色,计算阳性细胞占总细胞数的百分比。结果表明: IL-1 β刺激皮层及前脑基底细胞后,AChE阳性细胞数目与对照组比较无显著差异(P>0.05)(见表4)。表4 IL-1β作用后前脑基底及皮层中乙酰胆碱酯酶
阳性细胞数目的变化
Tab 4 Changes of positive AChE cell in basal forebrain，cortex treated with IL-1β(±s) Group
Positive AChE cell (%)
Cortex
Basal forebrain
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Control
5.770±1.224
8.455±1.400
(14)
(13)
IL-1β
6.072±0.863
7.995±1.394
(20)
(12)
讨 论
近年来，IL-1在神经疾病中的作用引起了学者广泛重视，脑内IL-1的主要来源是神经元和胶质细胞，其中来源于神经元的IL-1作为调节神经元生长的递质或调质，与外周的信息传递有关；而胶质细胞产生的IL-1主要参与介导神经损伤的修复[6]。研究发现AD病人的脑脊液和脑组织中IL-1均增高，并与AD病变的脑中分布特征相一致[7]。但AD病人脑中IL-1表达增加与脑内胆碱能系统的关系，未见文献报道。本实验将IL-1与胆碱能系统联系起来,研究IL-1与中枢胆碱能系统的关系，并探讨其作用机制。
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AChE和ChAT是反映中枢胆碱能系统代谢的一对特异性酶，两者活性直接影响脑内兴奋性递质乙酰胆碱的含量,其中AChE可分解乙酰胆碱,而ChAT则催化乙酰辅酶A和胆碱形成乙酰胆碱。BuchE 是体内一种非特异性酯酶,亦具有水解乙酰胆碱的作用，因而对乙酰胆碱的含量亦会产生一定的影响。目前观点普遍认为，脑内乙酰胆碱的减少与认知障碍和记忆力减退密切相关。本实验首先观察并确定IL-1β刺激24 h时AChE的活性最高；而12 h、24 h、48 h三个时点对ChAT及BuchE活性无明显影响。从作用部位看，皮层、前脑基底、海马神经元AChE的活性明显增高,而基底神经节、小脑、脊髓部位神经元的AChE的活性无明显变化，这与AD患者脑内胆碱能系统损害的分布是一致的。ChAT活性无改变而AChE活性增高说明乙酰胆碱含量明显减少的主要原因是分解的增加,而不是合成的减少。可见IL-1β对AchE活性的影响远远大于对BuchE和 ChAT活性的影响，推测病理条件下脑内乙酰胆碱含量减少与此有关，这一研究结果尚未见文献报道。进一步实验表明IL-1β受体拮抗剂(IL-1ra)可有效抑制IL-1β引起的AChE活性增加，说明IL-1β是通过其受体来调控胆碱能系统的。尽管文献报道IL-1具有促进培养的神经元存活和增殖的作用[8],但本实验通过AChE阳性细胞计数率分析证明，所用IL-1β剂量只是增加AChE的活性,并不增加胆碱能细胞的数目。作者认为IL-1β引起AChE 活性的增强不是通过增加胆碱能神经元数目实现的，可能与其基因的转录和翻译增加有关。
, 百拇医药
[参 考 文 献]
[1] Griffin WS, Sheng JG, Royston MC, et al. Glial-neuronal interactions in Alzheimer's disease: the potential role of a 'cytokine cycle' in disease progression[J]. Brain Pathol, 1998，8(1)：65～72.
[2] Strijbos PJ, Rothwell NJ. Interleukin-1β attenuates excitatory amino acid-induced neurodegeneration in vitro: Involvement of nerve growth factor[J].J Neurosci, 1995， 15(5)：3468～3474.
[3] Ellman G L, Courtney K D,Andres V, et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity[J]. Biochem Pharmacol, 1961，147：393～406.
, 百拇医药
[4] Fonnum F. A rapid radiochemical method for the determination of choline acetyltransferase[J]. J Neurochem, 1975，24：407～409.
[5] Tago H, Kimura H, Maeda T. Visualization of detailed acetylcholinesterase fiber and neuron staining in rat brain by a sensitive histochemical procedure[J]. J Histochem Cytochem,1986，34：1431～1438.
[6] Berkenbosch F, Robakis N, Blum M. Peripheral signalling of the brain[M]. In: Frederickson R C A, McGaugh J L,Felten D L. eds. Role in neural immune interactions and learning and memory. Hogrefe Huber, 1991. 131～145.
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[7] Griffin WST, Stanley LC, Ling C, et al. Brain interleukin 1 and S-100 immunoreactivity are elevated in down syndrome and Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA, 1989，86：7611～7615.
[8] Brenneman DE, Schultzberg M, Bartfai T, et al. Cytokine regulation of neuronal survival[J]. J Neurochem, 1992，59：1183～1186.
[收稿日期] 1999-05-04
[修回日期] 1999-08-26, http://www.100md.com
单位：康劲松 祝世功(白求恩医科大学病理生理教研室， 吉林 长春 130021)；商战平(内蒙古蒙医医学院，内蒙通辽市 028000)；Li Yue-kui Griffin WST(美国阿肯色州立大学医学院)
关键词：白细胞介素-1；乙酰胆碱酯酶；胆碱乙酰基转移酶；细胞，培养的；大鼠
中国病理生理杂志000712 [摘 要] 目的：探讨IL-1β对大鼠胆碱能神经元的影响及机理。方法：检测不同时相、不同脑区的培养神经细胞AChE、BuchE及ChAT的活性和前脑基底、皮层中胆碱酯酶阳性细胞数目。 结果：IL-1β对AChE活性的最大促进作用时相为24 h,皮层、前脑基底和海马部位的AChE活性明显高于对照组(P<0.01)，且能够完全被IL-1ra所阻断； 而小脑、脊髓、基底神经节部位的AChE活性则未见明显变化，同时各组BuchE、ChAT的活性均无明显变化，前脑基底、皮层中胆碱酯酶阳性细胞数目亦未见明显变化。结论：IL-1β能够明显升高特定脑区AChE活性，使乙酰胆碱的生成减少；而AChE活性的增高可能与其基因的转录和翻译增加有关。
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[中图分类号] R338.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0619-04
Study on the effect and mechanism of IL-1β on cultured cholinergic
neuron in the rat
KANG Jin-song, ZHU Shi-gong
(Department of Pathophysiology, Norman Bethune University of Medical Sciences，Changchun 130021, China)
SHANG Zhan-ping
, 百拇医药
(Nei Monggol traditional Mongolian Medical College, Tongliao 028000)
LI Yue-kui, Griffin WST
(University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock 72205, USA.)
[Abstract] AIM: The effect and mechanism of IL-1β on cultured cholinergic neuron in the rat was studied. METHODS: The acetylcholinesterase (AChE), choline acetyltransferase (ChAT), butyrylcholinesterase (BuchE) activities in different time-phase and different parts of brain were measured. The count number of positive AChE cell in basal forebrain and cortex was also measured. RESULT: It proved that the maximum effect of IL-1β on AChE activity is 24 hour. The AChE activity increased significantly in cortex, basal forebrain and hippocampus, comparing with control (P<0.01,P<0.01,P<0.05), and its effect can be blocked completely by IL-1ra;but there is no change of AChE activity in cerebellum, spinal and basal ganglia. In the same time, the activity of BuchE and ChAT has no change in every group. It was also found that there is no difference in percent of positive AChE cell in cortex and basal forebrain cell . CONCLUSION: IL-1β can only increase the AChE activity of specific parts in brain so that the synthesis of acetylcholine decrease. The increasing activity of AChE maybe related to the transcription and translation of AChE gene.
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[MeSH] Interleukin-1; Acetylcholinesterase; Choline acetyltransferase; Cells, culture; Rat
老年性痴呆(senile dementia, SD)包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种神经元退变性疾病，主要特征是老年斑和神经纤维缠结形成以及智力障碍，并与中枢胆碱能神经元的大量缺失密切相关。此病的发病机制十分复杂，至今仍未完全阐明。近年研究表明，炎症介质、细胞因子及它们的相互反应环路参与老年性痴呆的发病学，并认为IL-1是其中的一个关键性细胞因子，在细胞因子环路中起核心作用[1]。IL-1过度表达,使星形胶质细胞中的S100β(一种可促进轴突生长的蛋白质)和神经元中的淀粉样蛋白(amyloid protein,AP)过度表达,造成神经元的损伤，而神经元的损伤又可进一步激活小胶质细胞, 促使IL-1更加过度表达，形成恶性循环，最终导致神经元变性死亡。但IL-1与中枢胆碱能系统受损之间的关系,尚未见国内外研究报道。
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材 料 和 方 法
一、主要仪器
Olympus BH-2 倒置显微镜(日本)；CO2 培养箱(美国)； 分光光度仪(美国)；超声碎膜仪(美国)；Tri-carbR液闪分析仪(美国)；神经细胞培养所用试剂为Gibco公司产品，生化测定及组化染色所用试剂均为Sigma公司产品。IL-1β与IL-1ra为 Boehringer Mannheim公司产品。
二、神经细胞培养
按照Paul等的方法[2]，采用Sprague-Dawley胎鼠或子鼠进行原代神经细胞培养。培养皮层、海马、基底神经节和前脑基底神经元选用17～18 d的胎鼠；培养脊髓细胞选用13 d胎鼠；培养小脑神经细胞选用出生5～7 d的仔鼠。将分离出的神经组织加入0.125% 胰酶消化30 min后， 用含10%胎牛血清的DMEM中止酶反应。用吸管吹打制成细胞悬液,以1.0×106个cells/mL的密度接种于多聚-D-赖氨酸包被的60 mm、35 mm的培养皿内。第5 d加入10 μmol/L阿糖胞苷抑制非神经细胞的生长。培养两周的细胞用于实验。实验时将培养液换为无血清培养液,分别加入IL-1β(100 ng/mL)或IL-1ra(500 ng/mL)。 24 h后提取细胞并超声打碎,用BCA法测定蛋白浓度后,-70℃保存备用。
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三、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)及丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,BuchE)活性测定
参照Ellman的方法[3], 将含50 μg 蛋白质的样品分别加入到反应总体积为1 mL的反应体系中。AChE的反应体系为：0.1 mol/L Tris-HCl (pH 7.2),75 mmol/L碘化硫代乙酰胆碱,0.3 mmol/L 5,5'-二硫代双(2'-硝基苯甲酸)(5,5'-dithiobisnitrobenzoic acid),0.1mmol/L 四异丙基焦磷酸酰胺(tetraisopropylpyrophosphoramide, Iso-OMPA)。 BuchE的反应体系为：0.1 mol/L Tris-HCl( pH 7.2), 5 mmol/L 碘化丁酰胆碱,10 μmol/L 1,5-bis(4-allyldimethyl-ammoniumphenyl)pentan-3-one dibromide,BW284c51。然后置37℃水浴中培育30 min，冰浴终止反应。在波长412 nm读取光密度值。
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四、 乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)生物活性测定
按照Fonnum 的放免方法[4]，将含蛋白质200 μg的样品加入到总体积为200 μL的体系中,其内含有 150 mmol/L氯化钠, 5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L 胆碱, 0.1 mmol/L 毒扁豆碱, 0.925×104 Bq[3H]-乙酰辅酶A，孵育30 min。然后加入含 1.5% 四苯硼钠的3-庚酮,震荡混匀, 静止后取75 μL上层液(含有[3H]Ach),放入装有5 mL ScintiVerse Ⅱ的闪烁杯中。用 Tri-carbR液闪分析仪测定counts/min值。
五、 胆碱酯酶细胞化学染色
根据Tago 等的方法并略作改动[5]，将培养细胞用4%多聚甲醛,0.2%戊二醛固定后，用蒸馏水漂洗2次，加入胆碱酯酶孵育液(将0.5 mg/mL碘化硫代乙酰胆碱溶于7.5 mL 0.2mol/L醋酸缓冲液(pH5.8)中，然后加入0.1 mol/L枸橼酸钠 0.5 mL，0.03 mol/L 硫酸铜1 mL，0.005 mol/L 铁氰化钾1 mL)， 37℃孵育2 h，用0.05 mol/L Tris-HCl(pH 7.6) 漂洗2次，加入0.04%DAB显色。
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六、 统计分析
实验数据均以
±s表示，组间差异显著性采用双侧t检验。结 果
一、IL-1β作用不同时间对胆碱能活性的影响
IL-1β作用12 h、24 h,AChE的活性均明显高于对照组(P<0.01)；而作用48 h,AChE 的活性明显低于12 h和24 h组(P<0.01)，接近对照组水平。表明IL-1β刺激24 h后，AChE的活性最高，而在3个时点对ChAT及BuchE活性未见明显改变(表1)。
表1 IL-1β作用不同时间后大脑皮层胆碱能酶类活性的变化
Tab 1 Changes of cholinergic enzymes activity in cortex treated with IL-1β in different time course(
±s) Time, 百拇医药
Control
Enzyme activity (% of control)
IL-1β
AChE
ChAT
BuchE
12h
1.0000±0.0307
1.5350±0.0675* *
1.0780±0.0245
0.9750±0.0345
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(6)
(9)
(6)
(6)
24h
1.0000±0.0426
1.6050±0.0580* *
1.0980±0.0109
0.8710±0.0671
(19)
(19)
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(9)
48h
1.0000±0.0226
1.0420±0.0426##
1.0210±0.0367
0.9010±0.0231
(12)
(9)
(6)
(6)
* * P<0.01, vs control； ## P<0.01, vs IL-1β
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二、IL-1β对不同部位原代神经细胞AChE活性的影响表2 IL-1β作用后不同脑区乙酰胆碱酯酶活性变化
Tab 2 Changes of AChE activity in different part brain
treated with IL-1β(
±s) PartsAChE activity (% of control)
n
Control
n
IL-1β
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Cortex
16
1.0000±0.0426
19
1.6050±0.0580* *
Basal forebrain
6
1.0000±0.1656
4
2.0880±0.0835* *
Hippocampus
, 百拇医药
6
1.0000±0.0106
6
1.2080±0.0334*
Basal ganglia
9
1.0000±0.0492
9
1.0730±0.0492
Spinal
9
1.0000±0.0750
, 百拇医药
9
0.9538±0.1210
Cerebellum
9
1.0000±0.0574
9
1.1111±0.1203
*P<0.05, * * P<0.01, vs control
从表2可以看出：IL-1β分别与不同部位的大鼠原代神经细胞共同培养24 h，基底神经节、脊髓和小脑的AChE活性未见明显改变；而皮层、前脑基底及海马神经细胞的AChE活性均明显高于对照组(P<0.01、 P<0.01、 P<0.05)，以前脑基底和皮层更为显著。
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三、IL-1ra对IL-1β作用的影响
表3显示IL-1 受体阻断剂IL-1ra 对IL-1β引起AChE活性增高变化的影响。用IL-1β直接刺激培养脑皮层细胞后,AChE的活性明显高于对照组(P<0.01)；若同时加入IL-1ra, AChE的活性则明显低于单纯IL-1β组(P<0.01)，而与对照组比较则无显著差异。表3 加入IL-1ra后皮层中乙酰胆碱酯酶活性的变化
Tab 3 Changes of AChE activity in cortex treated
with IL-1ra(
±s) Groupn
AChE activity (% of control)
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Control
9
1.0000±0.0143
IL-1β
12
1.4970±0.0516* *
IL-1β+IL-1ra
9
0.9048±0.0446##
* * P<0.01, vs control； ## P<0.01, vs IL-1β
四、IL-1β对AChE阳性细胞数目的影响
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为确定AChE活性的增高是否与细胞数目的增多有关,进行AChE阳性细胞组化染色,计算阳性细胞占总细胞数的百分比。结果表明: IL-1 β刺激皮层及前脑基底细胞后,AChE阳性细胞数目与对照组比较无显著差异(P>0.05)(见表4)。表4 IL-1β作用后前脑基底及皮层中乙酰胆碱酯酶
阳性细胞数目的变化
Tab 4 Changes of positive AChE cell in basal forebrain，cortex treated with IL-1β(
±s) GroupPositive AChE cell (%)
Cortex
Basal forebrain
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Control
5.770±1.224
8.455±1.400
(14)
(13)
IL-1β
6.072±0.863
7.995±1.394
(20)
(12)
讨 论
近年来，IL-1在神经疾病中的作用引起了学者广泛重视，脑内IL-1的主要来源是神经元和胶质细胞，其中来源于神经元的IL-1作为调节神经元生长的递质或调质，与外周的信息传递有关；而胶质细胞产生的IL-1主要参与介导神经损伤的修复[6]。研究发现AD病人的脑脊液和脑组织中IL-1均增高，并与AD病变的脑中分布特征相一致[7]。但AD病人脑中IL-1表达增加与脑内胆碱能系统的关系，未见文献报道。本实验将IL-1与胆碱能系统联系起来,研究IL-1与中枢胆碱能系统的关系，并探讨其作用机制。
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AChE和ChAT是反映中枢胆碱能系统代谢的一对特异性酶，两者活性直接影响脑内兴奋性递质乙酰胆碱的含量,其中AChE可分解乙酰胆碱,而ChAT则催化乙酰辅酶A和胆碱形成乙酰胆碱。BuchE 是体内一种非特异性酯酶,亦具有水解乙酰胆碱的作用，因而对乙酰胆碱的含量亦会产生一定的影响。目前观点普遍认为，脑内乙酰胆碱的减少与认知障碍和记忆力减退密切相关。本实验首先观察并确定IL-1β刺激24 h时AChE的活性最高；而12 h、24 h、48 h三个时点对ChAT及BuchE活性无明显影响。从作用部位看，皮层、前脑基底、海马神经元AChE的活性明显增高,而基底神经节、小脑、脊髓部位神经元的AChE的活性无明显变化，这与AD患者脑内胆碱能系统损害的分布是一致的。ChAT活性无改变而AChE活性增高说明乙酰胆碱含量明显减少的主要原因是分解的增加,而不是合成的减少。可见IL-1β对AchE活性的影响远远大于对BuchE和 ChAT活性的影响，推测病理条件下脑内乙酰胆碱含量减少与此有关，这一研究结果尚未见文献报道。进一步实验表明IL-1β受体拮抗剂(IL-1ra)可有效抑制IL-1β引起的AChE活性增加，说明IL-1β是通过其受体来调控胆碱能系统的。尽管文献报道IL-1具有促进培养的神经元存活和增殖的作用[8],但本实验通过AChE阳性细胞计数率分析证明，所用IL-1β剂量只是增加AChE的活性,并不增加胆碱能细胞的数目。作者认为IL-1β引起AChE 活性的增强不是通过增加胆碱能神经元数目实现的，可能与其基因的转录和翻译增加有关。
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[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-05-04
[修回日期] 1999-08-26, http://www.100md.com