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编号:10271753
自发性高血压大鼠肾脏L-精氨酸/一氧化氮系统与红细胞L-精氨酸转运*
http://www.100md.com 《中国病理生理杂志》 2000年第7期
     作者:郑惠珍 王晓红 唐朝枢 刘锡仪

    单位:郑惠珍 刘锡仪(广东医学院生理学教研室, 广东 湛江 524023);王晓红 唐朝枢(北京大学第一医院心血管病研究所, 北京 100034)

    关键词:精氨酸;一氧化氮;肾;红细胞;高血压

    中国病理生理杂志000710 [摘 要] 目的:研究自发性高血压大鼠(SHR)肾脏(L-精氨酸/一氧化氮)L-Arg/NO系统的改变及其与红细胞L-Arg转运的关系。方法:检测16周龄SHR、卡托普利治疗4周的16周龄SHR(CAP)和16周龄WKY大鼠肾脏L-Arg转运、NOS活性、NO-2和cGMP含量,红细胞L-Arg转运。结果:SHR肾脏高低亲和L-Arg转运体的Vmax均低于WKY组(P<0.01,P<0.05),Km值则无明显差异。NOS活性、NO-2、cGMP含量分别较WKY组低35.4%、36.2%和85.2%(P<0.05或P<0.01)。CAP组高亲和L-Arg转运体的Vmax、NOS活性均高于SHR组(+90%,P<0.01;+58.6%,P<0.05)。NOS活性与高亲和L-Arg转运体的Vmax呈正相关,r=0.585,P<0.05。红细胞L-Arg转运的改变与肾脏相似, SHR组的Vmax低于WKY组(-30%,P<0.01),CAP组高于SHR组(+26.5%,P<0.01),Km值组间比较无明显差异。红细胞L-Arg转运的Vmax与肾脏高或低亲和L-Arg转运体的Vmax均呈正相关,r=0.8434,P<0.01(高亲和)和r=0.5255,P<0.05(低亲和)。结论:SHR肾脏L-Arg/NO系统活动抑制,卡托普利治疗明显解除此抑制状态。肾脏L-Arg转运的改变与红细胞L-Arg转运的改变基本一致。
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    [中图分类号] R541.1 [文献标识码] A

    [文章编号] 1000-4718(2000)07-0610-05

    The renal L-arginine/nitric oxide pathway and erythrocyte

    L-arginine transport in spontaneously hypertensive rats

    ZHENG Hui-zhen, LIU Xi-yi

    (Department of Physiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)

    WANG Xiao-hong, TANG Chao-shu
, 百拇医药
    (Institute of Cardiovascular Diseases, the First Hospital, Beijing University, Beijing 100034, China)

    [Abstract] AIM: To investigate the changes of the renal L-arginine /nitric oxide pathway and the relationship of L-arginine transport between kidney and erythrocytes in spontaneously hypertensive rat (SHR). METHODS: Sixteen week old SHR, 16 week old SHR with captopril (CAP) treated for four weeks and 16 week old WKY rats were used in the experiment. L-arginine transport, NO synthase(NOS) activity, nitrite and cyclic GMP (cGMP) content were measured in renal tissue or erythrocytes. RESULTS: In the renal tissue, compared with that of WKY group, the Vmax of high-or low-affinity L-arginine transporter, NOS activity, NO-2 and cGMP content of SHR group were significantly decreased (P<0.01 or P<0.05). The Vmax of high-affinity L-arginine transporter and NOS activity of CAP group were significantly enhanced as compared with SHR group (+90%, P<0.01; +58.6%, P<0.05). The NOS activity had significant positive correlation with the Vmax of high-affinity L-arginine transporter (r=0.585, P<0.05). The changes of erythrocyte L-arginine transport were the same as that of kidney. The Vmax of SHR group was lower than that of WKY group (-30%, P<0.01), and the Vmax of CAP group was higher than that of SHR group (+26.5%, P<0.01). Km was not significantly changed. There is a positive correlation between the Vmax of L-arginine transport in erythrocyte and the Vmax of high- or low-affinity L-arginine transporter in renal tissue, (r=0.8434, P<0.01, high-affinity; r=0.5255, P<0.05, low-affinity). CONCLUSION: There existed a functional inhibition in L-arginine/nitric oxide pathway in the kidney of SHR. It can be recovered obviously by captopril treatment. The changes of L-arginine transport in kidney coincide with that in erythrocyte.
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    [MeSH] Arginine; Nitric oxide; Kidney; Erythrocytes; Hypertension

    近年研究表明,一氧化氮(nitric oxide, NO)在高血压发病机制中有重要意义,高血压时血管内皮细胞损伤,NO合成释放减少,参与增加体循环外周阻力,升高血压。自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)心、脑、肾等靶器官一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)基因表达减少、活性降低,环磷酸鸟苷(cGMP)含量减少[1]。而长期抑制NOS活性,减少NO生成,不但导致动物高血压,而且动物出现血管壁肥厚、心肌细胞肥大,肾小球滤过率、肾血浆流量和对利尿利尿钠的反应降低[2]。SHR细胞膜物质转运功能紊乱,血管平滑肌细胞L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)转运障碍[3]。红细胞含L-Arg/NO系统[4],能合成自己的NO,红细胞膜上存在Y+和Y+L两种类型的阳离子氨基酸转运体[5],L-Arg主要通过Y+转运体的介导跨膜转运,红细胞Y+转运体的特征与体内其他组织细胞的L-Arg转运体的特征一致。高血压时红细胞L-Arg转运的改变如何?与肾脏L-Arg/NO系统的改变是否一致?本文用SHR模型,观察肾脏L-Arg/NO系统的改变及其与红细胞L-Arg转运的关系,以探讨红细胞L-Arg转运在高血压引起的肾L-Arg/NO 系统活动改变中的意义。
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    材 料 和 方 法

    一、动物模型复制

    实验分为3组:①SHR组,选用16周龄SHR;②卡托普利治疗(CAP)组,SHR自12周龄起,用卡托普利(captopril tablets 北京曙光制药厂)100 mg/kg体重灌胃,每日1次,连续四周。③WKY组,选用16周龄Wistar-Kyoto大鼠。大鼠由北京协和医科大学心血管研究所动物科及中国科学院实验动物研究中心提供。

    二、肾脏组织[3H]-L-Arg转运的测定

    参照我室以往的方法[6],每例取肾脏皮质部组织约600 mg,制备1 mm厚组织薄片,均分为10管,每管加KH液1 mL,37℃预孵育30 min后,加L-(2,3-[3H])-arginine ([3H]-L-Arg,浓度范围在0.01~0.2 mmol/L,37 kBq/μmol;浓度范围在0.5~10 mmol/L,18.5 kBq/μmol),终浓度为0.01~10 mmol/L。37℃孵育1 min,迅速置冰浴,用冷KH液终止反应并冲洗3次。组织经甲酸消化,考马斯亮蓝法测定蛋白含量,取0.2 mL消化液加入闪烁液,在β-液闪计数仪上测定[3H]放射活性,同时做非特异转运管。计算组织摄入[3H]-L-Arg的量,以nmol/(mg pr*min-1)表示。
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    三、红细胞[3H]-L-Arg转运的测定[7]

    颈总动脉取血5ml置含有肝素钠生理盐水的试管中,4℃、3 000 r/min、离心10 min,弃上清,加4倍体积的缓冲液(含mmol/L: NaCl 140, KCl 5,D-glucose 5, MOPS 10, pH 7.4)洗涤,离心,弃上清,并吸出沉淀上层15%的细胞,用红细胞缓冲液反复洗涤3次后,悬浮在改良的Hanks平衡盐溶液中(含mmol/L: CaCl2 1, KCl 55.3, KH2PO4 0.45, MgSO4 0.5, NaCl 1.25, Na2HPO4 0.8, NaCO3 4.2, glucose 5.6, EDTA 1, DTT 1),将各管红细胞数调至5×107/mL。
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    红细胞悬液置37℃孵育3 h,分装于Eppendof管中,每管1 mL(细胞数为4×107/mL)加入[3H]-L-Arg(240.5 kBq/μmol),浓度范围为5~400 μmol/L,37℃孵育5 min,置冰浴,并迅速用冷等渗盐溶液(含mmol:MgCl2 107,MOPS 10, pH 7.4)冲洗,加0.1% Triton X-100 0.5 mL,冻融,以溶解细胞。加5%三氯醋酸1 mL沉淀蛋白质。取上清10 μL,用考马斯亮蓝法行蛋白定量,其余上清,经Millipore抽滤装置抽滤(微孔滤膜孔径0.45 μm),在β-液闪计数仪上测量[3H]的放射活性,同时做非特异转运管,计算[3H]-L-Arg跨膜转运的量,以nmol/4×107 cells*min-1表示。

    四、肾脏组织cGMP含量测定
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    取肾脏组织约50 mg,加冷醋酸缓冲液(50 mmol,pH 4.75)2 mL,冰浴匀浆,以无水乙醇2 mL洗匀浆管,合并匀浆液,60℃水浴中吹干,测定前用300 μL醋酸缓冲液复溶。cGMP测定用放射免疫分析法,按试剂盒说明书进行,以pmol/mg pr表示。 cGMP放免试剂盒由上海中医药大学同位素室提供。

    五、肾脏组织NOS活性、NO-2含量测定

    制备10%肾组织匀浆,取匀浆0.1 mL用于测定NOS, 0.5 mL用于测定NO-2, NOS、 NO-2测定方法按试剂盒说明书进行,试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

    六、材料

    L-(2,3-[3H])-arginine 为美国NEN LIFE SCIENCE产品,MOPS,Triton X-100,Tris/HCl 购自美国Sigma公司,其余试剂为市售分析纯产品。
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    实验结果以±s表示,以方差分析,组间q检验及相关与回归分析方法作统计学处理。

    结 果

    一、大鼠肾脏组织L-Arg转运的变化

    大鼠肾脏组织L-Arg 转运的动力学特性见图1,表1。Eadie-Hofstee 作图显示,肾脏组织L-Arg 转运存在两种形式,即高亲和和低亲和转运。SHR组肾脏组织L-Arg转运能力低于WKY组,高低亲和转运体的最大转运速率(Vmax)分别较WKY组低58.3%和29.43%(P<0.01,P<0.05)。米氏常数(Km)略微降低,但其变化值无明显差异。CAP组肾脏组织L-Arg转运抑制的状况明显改善,与WKY组比较,分别仅低21%(高亲和)和25.9%(低亲和),均P>0.05;与SHR组相比,则高亲和转运体的Vmax增加90%(P<0.01),低亲和转运体的Vmax也稍高,但P>0.05,Km值的改变无明显差异。
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    Fig 1 [3H]-L-arginine transport of kidney in spontaneously hypertensive rat

    图1 自发性高血压大鼠肾脏L-精氨酸转运

    二、SHR肾组织NOS活性、NO-2、cGMP含量的变化

    SHR肾组织NOS活性较WKY组低35.4%(P<0.05),CAP组则较SHR组高58.6% (P<0.05)。肾组织NOS活性与高亲和L-Arg转运体的Vmax呈正相关,r=0.585, P<0.05,与低亲和转运体的Vmax无相关关系, r=0.043, P>0.05。SHR组NO-2、cGMP含量分别较WKY组低36.2%(P<0.05,NO-2)和85.2%(P<0.01,cGMP)。CAP组NO-2和cGMP含量略高于SHR组,但仍低于WKY组,与SHR组比较,P>0.05,与WKY比较cGMP含量低81%,P<0.01(表2)。
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    表1 自发性高血压大鼠肾脏L-精氨酸转运的最大转运速率及米氏常数

    Tab 1 Maximal velocity and Michaelis constant of kidney [3H]-L-arginine transport

    in spontaneously hypertensive rat (±s) Group

    High affinity

    Low affinity

    Vmax

    (nmol/mg pr.min-1)
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    Km

    (μmol/L)

    Vmax

    (nmol/mg pr.min-1)

    Km

    (μmol/ L)

    WKY

    (n=5)

    15.20±3.90

    120.26 ±60.00

    55.58±13.80

, 百拇医药     1 965.1±742.4

    SHR

    (n=8)

    6.34±2.70* *

    89.38 ±37.80

    39.22± 8.80*

    1 816.7±657.6

    CAP

    (n=5)

    12.04±2.90△ △

    79.60 ±13.90
, 百拇医药
    41.20±13.40

    1 015.7 ±245.9

    * P<0.05, * * P<0.01, vs WKY group; △△ P<0.01, vs SHR group表2 自发性高血压大鼠肾组织一氧化氮

    合酶活性、亚硝酸盐、cGMP含量

    Tab 2 NOS activity, nitrite- and cGMP content of kidney in

    spontaneously hypertensive rat and WKY rat (±s) Group

, 百拇医药     NOS

    (U/mg pr)

    NO-2

    (μmol/mg pr)

    cGMP

    (pmol/mg pr)

    WKY

    (n=5)

    0.96±0.21

    0.47±0.17

    4.46±1.34

    SHR
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    (n=8)

    0.58±0.28*

    0.30±0.08*

    0.66±0.20* *

    CAP

    (n=5)

    0.92±0.11

    0.39±0.16

    0.84±0.22* *

    *P<0.05, **P<0.01, vs WKY group; △P<0.05, vs SHR group
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    三、SHR红细胞L-Arg 转运的改变及其与肾脏L-Arg 转运的关系

    大鼠红细胞L-Arg转运的Eadie-Hofstee plot呈现单亲和转运方式(表3)。与肾脏的改变相似,SHR L-Arg转运能力降低,Vmax较WKY组低30.59%(P<0.01)。Captopril治疗提高L-Arg转运能力,Vmax较SHR组高26.5%(P<0.01)。Km值组间比较无明显差异。Vmax与肾脏高、低亲和L-Arg转运体的Vmax比较均呈正相关,r=0.8434(P<0.01,高亲和)和r=0.5255(P<0.05,低亲和)。Km值与肾脏高或低亲和L-Arg转运体的Km值比较均无相关关系,r=0.1210(P>0.05)和r=0.3699(P>0.05)。表3 大鼠红细胞L-精氨酸转运

    的最大转运速率及米氏常数

    Tab 3 Maximal velocity and Michaelis constant of
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    [3H]-L-arginine transport of erythrocyte in spontaneously

    hypertensive rat and WKY rat (±s) Group

    Vmax(nmol/4×107cells.min-1)

    Km(μmol/L)

    WKY(n=6)

    1028.63±41.10

    30.99±1.90
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    SHR(n=6)

    713.93±12.50**

    32.22±2.10

    CAP(n=5)

    903.32±24.10**△△

    29.71±2.90

    * P<0.05, **P<0.01, vs WKY group; △△P<0.01, vs SHR group讨 论

    细胞膜上转运L-Arg的载体蛋白[8]为Na+-非依赖、pH不敏感的转运体,主要为Y+型。本实验结果,大鼠肾组织L-Arg 转运存在高、低亲和两种转运形式,高亲和转运体的Km值为(120.26±27.3) μmol/L,低亲和转运体的Km值为(1 970±740) μmol/L ,文献报道,大鼠血浆L-Arg浓度约为50~100 μmol/L[9],提示生理条件下以高亲和转运形式为主发挥生物学效应。原发性高血压病程发展到一定阶段,可出现心、脑、肾等靶器官损伤,肾脏细小动脉硬化,入球小动脉玻璃样变性和纤维化,引起肾单位萎缩、消失,严重者导致肾功能衰竭。高血压致肾损伤与NO缺乏有关。SHR肾脏NOS/cGMP系统抑制。本实验观察到,SHR肾组织L-Arg转运障碍,高、低亲和转运体的Vmax均明显低于正常血压的WKY大鼠(P<0.01, P<0.05),Km值则无明显差异。SHR肾脏L-Arg转运障碍的主要原因是转运体数量下调,而转运体与底物的亲和力改变不大。L-Arg转运体数量下调是否与转运体基因表达减少,转运蛋白合成减少等因素有关,有待进一步研究。本文观察到,SHR肾组织NOS活性、NO-2、cGMP含量均低于WKY组,而且NOS活性与高亲和L-Arg转运体的Vmax呈正相关。目前已知,L-Arg跨膜转运为细胞内NOS提供底物[8],是经L-Arg/NO途径合成NO的重要环节,可以认为,SHR肾组织NOS/cGMP系统的抑制与L-Arg转运体数量下调,转运能力下降有关。
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    肾素-血管紧张素系统在高血压致肾损伤中也有重要意义。用血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利治疗可增加肾皮质NOS活性和cNOS基因表达[10],改善NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)所致的高血压动物的肾血流动力学,恢复肾小球滤过率和肾血浆流量[2]。本实验用SHR,从12周起,用卡托普利连续治疗4周,结果可见,L-Arg高亲和转运体的Vmax、NOS活性均明显高于SHR组,接近WKY组,提示卡托普利治疗可消除SHR肾L-Arg/NO系统受抑制的状况。

    红细胞含L-Arg/NO系统,红细胞膜上存在Y+和Y+L两种类型的阳离子氨基酸转运体。L-Arg 主要通过Y+转运体跨膜转运,当膜电位超极化时,该转运体被激活,而当膜电位去极化时,该转运体被抑制,此特征与体内其他系统观察到的现象一致[8]。Hassen等报道,人类慢性心衰[11]、慢性肾衰[7]病人静脉血中红细胞L-Arg转运增加,与心脏、肾脏L-Arg/NO信号途径失衡的反应一致。本结果表明,大鼠红细胞L-Arg转运为单亲和转运形式。SHR红细胞L-Arg转运的改变与肾脏L-Arg转运的改变基本一致,即Vmax明显低于WKY组,Km值无明显差异,卡托普利治疗明显提高Vmax,其Vmax明显高于SHR组,接近WKY组。此外,红细胞L-Arg转运的Vmax与肾脏L-Arg转运高或低亲和转运体的Vmax均呈正相关,这些结果说明,红细胞L-Arg转运在一定程度上可以反映肾脏L-Arg转运的概况。
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    (本工作得到北京医科大学心血管基础研究所刘乃奎教授实验室的大力支持,特此致谢)

    [基金项目]广东省高教厅高校科技三项资助

    [参 考 文 献]

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    [2] Fortepiani LA, Rodrigo E, Ortiz MC, et al. Pressure natriuresis in nitric oxide-deficient hypertensive rats: effect of antihypertensive treatment[J]. J Am Soc Nephrol, 1999, 10(1):21~27.
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    [3] 姚兴海,吕小燕,张灵芝,等.自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞的精氨酸转运和脂质体对转运的影响. 生理学报,1997,49(1):67~72.

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    [6] 郑惠珍,唐朝枢,苏加林,等.大鼠心脏缺血-再灌注损伤对心肌L-Arg/No途径的影响[J].生理学报,1999,52(1):25~30.

    [7] Ribeiro A C M, Hassen H, Kiessling K, et al. Transport of L-arginine and the nitric oxide inhibitor NG-monomethyl-L-arginine in human erythrocytes in chronic renal failure[J]. Clin Sci, 1997,93:57~64.

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    [收稿日期] 1999-12-22

    [修回日期] 2000-04-03, http://www.100md.com