兔髂动脉内膜损伤后PDGF-B mRNA在血管壁原位表达增强
作者：季军 方卫华 司履生 令文萍
单位：(深圳市孙逸仙心血管医院病理科， 广东 深圳 518001)
关键词：肌，平滑，血管；细胞；血小板源生长因子；杂交
中国病理生理杂志000708
[摘 要] 目的：探讨内膜损伤后血管平滑肌细胞(VSMCS)增殖的体内机制。方法：用球囊导管损伤兔髂动脉内膜建立VSMCS增殖模型，以自行设计、合成的血小板源性生长因子β(PDGF-B)cDNA探针和原位杂交方法检测了损伤后不同时期VSMCS表达PDGF-B mRNA与VSMCS表达增殖细胞核抗原和内膜横断面积增加关系。 结果：血管损伤后VSMCS 表达PDGF-B mRNA增强，计数内膜(0.25 mm×mm)×4面积中PDGF-B mRNA阳性细胞数分别为1、2和4周的31.93±14.63，26.50±9.25和24.85±13.65。其表达与VSMCS表达增殖细胞核抗原和内膜面积的增加密切相关。结论： 血管内膜损伤后VSMCS自泌性产生PDGF-B 是VSMCS增殖和内膜增生的主要原因之一。我们设计的探针为原位研究兔VSMCS PDGF-B mRNA的表达提供方便。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R331.3+2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0603-03
The in situ expression of PDGF-B mRNA increased after the denudation of
rabbit iliac arteries
JI Jun, FANG Wei-hua, SI Lu-sheng, LING Wen-ping
(Department of Pathology, Shenzhen Cardiovascular Hospital, Shenzhen 518001， China)
, http://www.100md.com
[Abstract] AIM: To elucidate the in vivo mechanisms of the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCS) in injuried arteries. METHODS: A VSMCS proliferative model was constructed by injury of rabbit iliac arteries with balloon catheters and a probe designed for rabbit platelet-derived growth factor B chain (PDGF-B ) mRNA was used to detect the expression of it by intimal VSMCS on the vascular cross sections using an in situ hybridization technique at the indicated times. The relation of this expression to the proliferation of VSMCS by their expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and vascular intimal areas were estimated. RESULTS: The expression of PDGF-B mRNA of intimal VSMCS was increased when calculating the intimal PDGF-B mRNA positive cells per millimetre area at ×400 magnification with average numbers of 31.93±14.64 in 1 week group, 26.50±9.25 in 2 weeks group and 24.85±13.65 in 4 weeks group. This was in accordance with the expression of PCNA by VSMCS and the increase of intimal areas. CONCLUSION: The local production of PDGF-B by VSMCS via an autocrine mechanism is responsible for the continuous proliferation of these cells and formation of neointima after the injury. The probe designed is very useful for detecting rabbit PDGF-B mRNA.
, http://www.100md.com
[MeSH] Muscle, smooth, vascular; Cells; Platelet-derived growth factor;Hybridization
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCS)增殖涉及动脉粥样硬化、再狭窄、高血压病的多种病理过程，受血小板源性生长因子β(platelet-derived growth factor B chain，PDGF-B)的刺激[1] 。已证实，体外培养的血管壁细胞亦可产生PDGF-B[2]。然而，原位检测球囊损伤的小鼠或大鼠血管壁PDGF-B mRNA表达较为困难。为此，我们以兔为对象建立其髂动脉球囊损伤模型，用自行设计、合成的PDGF-B cDNA探针和原位杂交方法检测内皮损伤后血管内膜细胞表达PDGF-B mRNA及其与VSMCS增生的关系。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、 建立血管模型、分组和标本制备
新西兰纯种兔40只，体重2.3～2.5 kg，雄性(第一军医大学动物中心提供)，经5%戊巴比妥(25～35 mg*kg-1,iv)麻醉，向股浅动脉逆行插入直径2.5 mm×20的球囊导管至腹主动脉造成髂动脉内皮剥脱。术后普通饮食喂养。将动物分1、2 和4周观察组每组10只；正常对照10只。各组于观察结束后处死，立刻经静脉加压滴注4%多聚甲醛固定后，无菌取出髂动脉，将每条髂动脉标本分为近端段、中段和远端段，每段约8～10 mm， 常规石蜡包埋。将每个标本的近、中、远各段分别作连续切片，切片厚度4 μm，每段约切片200张，每隔10 张取切片做常规HE 染色、特殊染色(弹力纤维染色、 VG染色和Masson三色染色)、免疫组化和原位杂交。
二、免疫组织化学染色
采用标记抗生蛋白链菌素生物素染色法(labelled streptavidin biotin method，LSAB，DAKO 公司)。 一抗分别为鼠抗SMCα-actin单克隆抗体(稀释度为1∶200，DAKO)和鼠抗增殖细胞核抗原单克隆抗体(稀释度为1∶400，DAKO)。按试剂盒说明操作。 分别选择兔正常髂动脉中层VSMCS (α-actin)和人肺低分化腺癌(增殖细胞核抗原)作为阳性对照，用PBS取代一抗体作阴性对照。计数各段动脉横切面内膜中200个细胞所占的增殖细胞核抗原阳性细胞数，求其平均值作为实际计数。
, 百拇医药
三、形态测量
应用多功能真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学图像中心产品)直接测量动脉近、中和远段各横切面内膜面积，求出平均数作为实际测量值。
四、寡核苷酸探针的设计、合成与标记
兔PDGF-B cDNA序列在文献中未见报道。我们对比分析了大鼠、猫、猪和人PDGF-B cDNA序列，根据其同源性和探针设计原则自行设计和人工合成了检测兔PDGF-B mRNA的探针。其序列如下：5’-GAT CGC ACC AAT GCC AAC TTC CTG GTG TGG CCG CCC TGC GTG GAG GTG CAG-3’。采用Dig-11-ddUTP/dATP 3’加尾法(试剂盒：Boehringer mannheim)标记寡核苷酸探针。用斑点杂交方法估计探针标记的效率和特异性(图1)。
五、原位杂交及阳性产物判断
, 百拇医药
将常规原位杂交方法进行部分改良，方法简述如下：切片经常规杂交前处理后行DNA复性(42 ℃，10 min)；杂交(探针浓度1.5 ng*μL-1)后行2×、0.5×和0.1×SSC粗洗，正常羊血清封闭，加抗地高辛抗体碱性磷酸酶复合物，NBT/BCIP避光显色，常规封片。阳性信号为紫兰色颗粒状沉淀物分布在VSMCS胞浆内(图2)。 为排除非特异性显色及背景，设组织对照：正常兔髂动脉壁细胞杂交反应为阴性；探针对照：省去标记探针杂交为阴性反应；标记探针与未标记探针竞争试验：加足量(10倍量)未标记探针孵育后再加标记探针杂交反应为阴性。高倍视野(400×)下计数内膜中(0.25 mm×mm)×4 面积中阳性细胞数，计算均数作为实际计数。
各组实验数据均以
±s表示， 用t 检验判断均数差异显著性。
结 果
, 百拇医药
一、损伤后血管壁病理改变
损伤造成内皮及部分内膜坏死脱落，内弹力板断裂，血栓形成。1周时，内膜增厚并主要由细胞构成，大多为SMCα-actin阳性，偶见巨噬细胞、淋巴细胞和少许中性白细胞。之后数周，内膜间质增多加宽，管腔明显狭窄，仅靠近腔面1～2层细胞仍保持增生肥大。内膜面积测量结果见表1。 结果显示，随着损伤后时间延长内膜面积逐渐增加， 2周前增加较明显，之后逐渐变缓。
表1 血管损伤后不同时期内膜面积的变化
Tab 1 Vascular intimal area measurement after injury(±s,n=10) Group
Intimal area (mm2)
, 百拇医药
1 week
0.52±0.18*
2 weeks
1.44±1.04
4 weeks
1.74±1.13△
*P<0.05, vs 2 weeks group; △ P<0.05, vs 1 week group
二、增殖细胞核抗原表达与分布
正常血管壁不表达或仅见中层少数VSMCS和内皮细胞微弱的表达。受损1周时，阳性细胞明显增多并分布于内膜全层，占内膜细胞的43%～73%(平均58.65%)(图3) ；之后数周，阳性细胞减少，主要分布靠近管腔的内膜，2和4周分别为44%～49% (平均20.30%)和10%～38% (平均18%)。 动脉中层持续有少数散在弱阳性细胞。结果见表2。
, 百拇医药
表2 血管损伤后不同时期内膜细胞PCNA的表达
Tab 2 PCNA expression of intimal VSMCS after injury(±s,n=10) Group
PCNA-positive cell numbers
1 week
117.30±21.73*
2 weeks
40.60±20.26
3 weeks
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36.00±15.91△
*P<0.05, vs 2 weeks group;△ P<0.05, vs 1 week group
三、PDGF-B mRNA在血管壁的表达和分布
正常血管壁未见阳性信号；损伤后增生的内膜中见较多阳性细胞；中膜亦见少量散在分布；计数损伤后不同时期内膜中阳性细胞的结果见表3。可见内膜表达PDGF-B mRNA持续至少4周(图4)且与VSMCS增殖关系密切(r=0.8900，P<0.05)。表3 损伤后不同时期内膜PDGF-B mRNA表达
Tab 2 PDGF-B mRNA expression of intimal cell after
injury(±s,n=10) Group
, 百拇医药
PDGF-B mRNA positive cells(1 mm2)
1 week
31.93±14.63
2 weeks
26.50± 9.29
4 weeks
24.85±13.65
讨 论
虽然球囊损伤后血管内膜病变持续发展与血管壁细胞产生PDGF-B等生长因子有关[3]，但检测小鼠受损的血管横断面未发现有PDGF-B mRNA表达；之后，Lindner等[4]以同样的方法检测大鼠血管壁PDGF-B mRNA， 仅发现新生内膜靠近腔面有散在少数的阳性细胞；改用特殊的an on face 技术展露全部腔面细胞，结果发现部分VSMCS亚群表达PDGF-B mRNA且与新生内膜的形成密切相关。对兔此方面的研究较少，主要是探针较难获得。我们首次根据不同种属PDGF-B cDNA序列的同源性自行设计合成了检测兔PDGF-B mRNA的特异性寡核苷酸探针，对损伤的兔髂动脉壁横切面进行了检测。 于损伤后1周增生的内膜中PDGF-B mRNA阳性细胞明显增多并达高峰，此时，亦是内膜增生快速期和VSMCS增殖的高峰阶段，相关分析显示PDGF-B mRNA表达与VSMCS增殖关系密切。此等表达的量和分布与增殖的一致性表明，它与VSMCS增殖和内膜增厚有关。之后数周，内膜仍维持一定PDGF-B mRNA表达水平并主要是靠近血管腔的内膜阳性细胞较多， 这恰与增殖的VSMCS分布一致，表明PDGF-B可能在维持VSMCS增殖和内膜病变的发展过程中起一定作用。我们观察到在内膜损伤后2周新生内膜中细胞基质开始增多并逐渐成为增生内膜的主要成分。是否PDGF-B mRNA持续表达与细胞间质的形成有关还有待进一步研究。我们设计的探针为原位研究PDGF-B mRNA表达及其调节和反义寡核苷酸治疗提供了方便。
, http://www.100md.com
[基金项目] 深圳市科技局科研基金资助
[参 考 文 献]
[1] 袁晋青.分子生物学与经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄的预防[J].中国循环杂志， 1996， 11(11)：697～700.
[2] Majesky MW, Reidy MA, Bowen-Pope DF, et al. PDGF ligand and receptor gene expression during repair of arterial injury[J]. J Cell Biol, 1990, 111:2149～2158.
[3] Wilcox JN. Molecular biology: Insight into the causes and prevention of restenosis after arterial intervention[J]. Am J Cardiol, 1993, 72:88E～95E.
[4] Lindner V, Giachelli CM, Schwartz SM, et al. A subpopulation of smooth muscle cells in injured rat arteries expresses platelet-derived growth factor-B chain mRNA[J]. Circ Res, 1995, 76(6):951～957.
[收稿日期] 1999-05-18
[修回日期] 2000-01-05, http://www.100md.com
单位：(深圳市孙逸仙心血管医院病理科， 广东 深圳 518001)
关键词：肌，平滑，血管；细胞；血小板源生长因子；杂交
中国病理生理杂志000708
[摘 要] 目的：探讨内膜损伤后血管平滑肌细胞(VSMCS)增殖的体内机制。方法：用球囊导管损伤兔髂动脉内膜建立VSMCS增殖模型，以自行设计、合成的血小板源性生长因子β(PDGF-B)cDNA探针和原位杂交方法检测了损伤后不同时期VSMCS表达PDGF-B mRNA与VSMCS表达增殖细胞核抗原和内膜横断面积增加关系。 结果：血管损伤后VSMCS 表达PDGF-B mRNA增强，计数内膜(0.25 mm×mm)×4面积中PDGF-B mRNA阳性细胞数分别为1、2和4周的31.93±14.63，26.50±9.25和24.85±13.65。其表达与VSMCS表达增殖细胞核抗原和内膜面积的增加密切相关。结论： 血管内膜损伤后VSMCS自泌性产生PDGF-B 是VSMCS增殖和内膜增生的主要原因之一。我们设计的探针为原位研究兔VSMCS PDGF-B mRNA的表达提供方便。
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[中图分类号] R331.3+2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0603-03
The in situ expression of PDGF-B mRNA increased after the denudation of
rabbit iliac arteries
JI Jun, FANG Wei-hua, SI Lu-sheng, LING Wen-ping
(Department of Pathology, Shenzhen Cardiovascular Hospital, Shenzhen 518001， China)
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[Abstract] AIM: To elucidate the in vivo mechanisms of the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCS) in injuried arteries. METHODS: A VSMCS proliferative model was constructed by injury of rabbit iliac arteries with balloon catheters and a probe designed for rabbit platelet-derived growth factor B chain (PDGF-B ) mRNA was used to detect the expression of it by intimal VSMCS on the vascular cross sections using an in situ hybridization technique at the indicated times. The relation of this expression to the proliferation of VSMCS by their expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and vascular intimal areas were estimated. RESULTS: The expression of PDGF-B mRNA of intimal VSMCS was increased when calculating the intimal PDGF-B mRNA positive cells per millimetre area at ×400 magnification with average numbers of 31.93±14.64 in 1 week group, 26.50±9.25 in 2 weeks group and 24.85±13.65 in 4 weeks group. This was in accordance with the expression of PCNA by VSMCS and the increase of intimal areas. CONCLUSION: The local production of PDGF-B by VSMCS via an autocrine mechanism is responsible for the continuous proliferation of these cells and formation of neointima after the injury. The probe designed is very useful for detecting rabbit PDGF-B mRNA.
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[MeSH] Muscle, smooth, vascular; Cells; Platelet-derived growth factor;Hybridization
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCS)增殖涉及动脉粥样硬化、再狭窄、高血压病的多种病理过程，受血小板源性生长因子β(platelet-derived growth factor B chain，PDGF-B)的刺激[1] 。已证实，体外培养的血管壁细胞亦可产生PDGF-B[2]。然而，原位检测球囊损伤的小鼠或大鼠血管壁PDGF-B mRNA表达较为困难。为此，我们以兔为对象建立其髂动脉球囊损伤模型，用自行设计、合成的PDGF-B cDNA探针和原位杂交方法检测内皮损伤后血管内膜细胞表达PDGF-B mRNA及其与VSMCS增生的关系。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、 建立血管模型、分组和标本制备
新西兰纯种兔40只，体重2.3～2.5 kg，雄性(第一军医大学动物中心提供)，经5%戊巴比妥(25～35 mg*kg-1,iv)麻醉，向股浅动脉逆行插入直径2.5 mm×20的球囊导管至腹主动脉造成髂动脉内皮剥脱。术后普通饮食喂养。将动物分1、2 和4周观察组每组10只；正常对照10只。各组于观察结束后处死，立刻经静脉加压滴注4%多聚甲醛固定后，无菌取出髂动脉，将每条髂动脉标本分为近端段、中段和远端段，每段约8～10 mm， 常规石蜡包埋。将每个标本的近、中、远各段分别作连续切片，切片厚度4 μm，每段约切片200张，每隔10 张取切片做常规HE 染色、特殊染色(弹力纤维染色、 VG染色和Masson三色染色)、免疫组化和原位杂交。
二、免疫组织化学染色
采用标记抗生蛋白链菌素生物素染色法(labelled streptavidin biotin method，LSAB，DAKO 公司)。 一抗分别为鼠抗SMCα-actin单克隆抗体(稀释度为1∶200，DAKO)和鼠抗增殖细胞核抗原单克隆抗体(稀释度为1∶400，DAKO)。按试剂盒说明操作。 分别选择兔正常髂动脉中层VSMCS (α-actin)和人肺低分化腺癌(增殖细胞核抗原)作为阳性对照，用PBS取代一抗体作阴性对照。计数各段动脉横切面内膜中200个细胞所占的增殖细胞核抗原阳性细胞数，求其平均值作为实际计数。
, 百拇医药
三、形态测量
应用多功能真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学图像中心产品)直接测量动脉近、中和远段各横切面内膜面积，求出平均数作为实际测量值。
四、寡核苷酸探针的设计、合成与标记
兔PDGF-B cDNA序列在文献中未见报道。我们对比分析了大鼠、猫、猪和人PDGF-B cDNA序列，根据其同源性和探针设计原则自行设计和人工合成了检测兔PDGF-B mRNA的探针。其序列如下：5’-GAT CGC ACC AAT GCC AAC TTC CTG GTG TGG CCG CCC TGC GTG GAG GTG CAG-3’。采用Dig-11-ddUTP/dATP 3’加尾法(试剂盒：Boehringer mannheim)标记寡核苷酸探针。用斑点杂交方法估计探针标记的效率和特异性(图1)。
五、原位杂交及阳性产物判断
, 百拇医药
将常规原位杂交方法进行部分改良，方法简述如下：切片经常规杂交前处理后行DNA复性(42 ℃，10 min)；杂交(探针浓度1.5 ng*μL-1)后行2×、0.5×和0.1×SSC粗洗，正常羊血清封闭，加抗地高辛抗体碱性磷酸酶复合物，NBT/BCIP避光显色，常规封片。阳性信号为紫兰色颗粒状沉淀物分布在VSMCS胞浆内(图2)。 为排除非特异性显色及背景，设组织对照：正常兔髂动脉壁细胞杂交反应为阴性；探针对照：省去标记探针杂交为阴性反应；标记探针与未标记探针竞争试验：加足量(10倍量)未标记探针孵育后再加标记探针杂交反应为阴性。高倍视野(400×)下计数内膜中(0.25 mm×mm)×4 面积中阳性细胞数，计算均数作为实际计数。
各组实验数据均以
±s表示， 用t 检验判断均数差异显著性。结 果
, 百拇医药
一、损伤后血管壁病理改变
损伤造成内皮及部分内膜坏死脱落，内弹力板断裂，血栓形成。1周时，内膜增厚并主要由细胞构成，大多为SMCα-actin阳性，偶见巨噬细胞、淋巴细胞和少许中性白细胞。之后数周，内膜间质增多加宽，管腔明显狭窄，仅靠近腔面1～2层细胞仍保持增生肥大。内膜面积测量结果见表1。 结果显示，随着损伤后时间延长内膜面积逐渐增加， 2周前增加较明显，之后逐渐变缓。
表1 血管损伤后不同时期内膜面积的变化
Tab 1 Vascular intimal area measurement after injury(
±s,n=10) GroupIntimal area (mm2)
, 百拇医药
1 week
0.52±0.18*
2 weeks
1.44±1.04
4 weeks
1.74±1.13△
*P<0.05, vs 2 weeks group; △ P<0.05, vs 1 week group
二、增殖细胞核抗原表达与分布
正常血管壁不表达或仅见中层少数VSMCS和内皮细胞微弱的表达。受损1周时，阳性细胞明显增多并分布于内膜全层，占内膜细胞的43%～73%(平均58.65%)(图3) ；之后数周，阳性细胞减少，主要分布靠近管腔的内膜，2和4周分别为44%～49% (平均20.30%)和10%～38% (平均18%)。 动脉中层持续有少数散在弱阳性细胞。结果见表2。
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表2 血管损伤后不同时期内膜细胞PCNA的表达
Tab 2 PCNA expression of intimal VSMCS after injury(
±s,n=10) GroupPCNA-positive cell numbers
1 week
117.30±21.73*
2 weeks
40.60±20.26
3 weeks
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36.00±15.91△
*P<0.05, vs 2 weeks group;△ P<0.05, vs 1 week group
三、PDGF-B mRNA在血管壁的表达和分布
正常血管壁未见阳性信号；损伤后增生的内膜中见较多阳性细胞；中膜亦见少量散在分布；计数损伤后不同时期内膜中阳性细胞的结果见表3。可见内膜表达PDGF-B mRNA持续至少4周(图4)且与VSMCS增殖关系密切(r=0.8900，P<0.05)。表3 损伤后不同时期内膜PDGF-B mRNA表达
Tab 2 PDGF-B mRNA expression of intimal cell after
injury(
±s,n=10) Group, 百拇医药
PDGF-B mRNA positive cells(1 mm2)
1 week
31.93±14.63
2 weeks
26.50± 9.29
4 weeks
24.85±13.65
讨 论
虽然球囊损伤后血管内膜病变持续发展与血管壁细胞产生PDGF-B等生长因子有关[3]，但检测小鼠受损的血管横断面未发现有PDGF-B mRNA表达；之后，Lindner等[4]以同样的方法检测大鼠血管壁PDGF-B mRNA， 仅发现新生内膜靠近腔面有散在少数的阳性细胞；改用特殊的an on face 技术展露全部腔面细胞，结果发现部分VSMCS亚群表达PDGF-B mRNA且与新生内膜的形成密切相关。对兔此方面的研究较少，主要是探针较难获得。我们首次根据不同种属PDGF-B cDNA序列的同源性自行设计合成了检测兔PDGF-B mRNA的特异性寡核苷酸探针，对损伤的兔髂动脉壁横切面进行了检测。 于损伤后1周增生的内膜中PDGF-B mRNA阳性细胞明显增多并达高峰，此时，亦是内膜增生快速期和VSMCS增殖的高峰阶段，相关分析显示PDGF-B mRNA表达与VSMCS增殖关系密切。此等表达的量和分布与增殖的一致性表明，它与VSMCS增殖和内膜增厚有关。之后数周，内膜仍维持一定PDGF-B mRNA表达水平并主要是靠近血管腔的内膜阳性细胞较多， 这恰与增殖的VSMCS分布一致，表明PDGF-B可能在维持VSMCS增殖和内膜病变的发展过程中起一定作用。我们观察到在内膜损伤后2周新生内膜中细胞基质开始增多并逐渐成为增生内膜的主要成分。是否PDGF-B mRNA持续表达与细胞间质的形成有关还有待进一步研究。我们设计的探针为原位研究PDGF-B mRNA表达及其调节和反义寡核苷酸治疗提供了方便。
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[基金项目] 深圳市科技局科研基金资助
[参 考 文 献]
[1] 袁晋青.分子生物学与经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄的预防[J].中国循环杂志， 1996， 11(11)：697～700.
[2] Majesky MW, Reidy MA, Bowen-Pope DF, et al. PDGF ligand and receptor gene expression during repair of arterial injury[J]. J Cell Biol, 1990, 111:2149～2158.
[3] Wilcox JN. Molecular biology: Insight into the causes and prevention of restenosis after arterial intervention[J]. Am J Cardiol, 1993, 72:88E～95E.
[4] Lindner V, Giachelli CM, Schwartz SM, et al. A subpopulation of smooth muscle cells in injured rat arteries expresses platelet-derived growth factor-B chain mRNA[J]. Circ Res, 1995, 76(6):951～957.
[收稿日期] 1999-05-18
[修回日期] 2000-01-05, http://www.100md.com