大鼠容量超负荷早期心室压力变化和心肌原癌基因c-fos、c-jun、c-myc、egr-1的表达
作者：胡小萍 李贺 费俭 张国元 吴宗贵
单位：胡小萍(上海浦南医院病理科,上海 200125)；李贺 张国元 吴宗贵(上海长征医院心内科，上海 200003)；费俭(中国科学院上海细胞生物学研究所，上海 200031)
关键词：心室功能；原癌基因；基因表达
中国病理生理杂志000705 [摘 要] 目的：检测大鼠心脏容量超负荷(volume overload，VOL)时左心室内压变化诱导心肌原癌基因c-fos、c-jun、c-myc 、egr-1 mRNA表达的时间变化规律。方法：测定VOL 、假手术对照组大鼠术后30 min、1、4、6、12及48 h左心室收缩压(LVSP)和舒张末压(LVEDP)，用狭缝杂交检测2组各时间左室心肌原癌基因表达，用密度仪进行定量分析。结果:VOL大鼠术后LVSP显著低于假手术组(P<0.05)，48 h最低；术后30 min LVEDP高于假手术组(P<0.05)，12 h最高，48 h与假手术组相近(P>0.05)；假手术组和阴性对照各原癌基因无阳性表达，AVF后1 h检测到c-fos 、c-jun、egr-1 mRNA表达，4 h检测到c-myc表达，均于4 h出现表达峰值，此后减弱，48 h c-fos无表达，c-jun表达较弱，c-myc和egr-1仍有较高表达。结论：VOL大鼠LVEDP增加，首先诱导c-fos、c-jun、egr-1表达，c-myc表达较晚，c-myc、c-jun、 egr-1表达持续时间较长，可能反映了活体VOL刺激心肌原癌基因表达时间变化规律；当室壁受到一定程度和一定时间的负荷牵拉后心肌原癌基因即开始表达，负荷的强弱可能并非重要因素。
, 百拇医药
[中图分类号] Q754； K346.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0592-04
Correlation between intraventricular pressure and early
phase proto-oncogene expression in volume overload rats
HU Xiao-ping
(Department of Pathology, Punan Hospital, Shanghai 200125, China)
LI He，ZHANG Guo-yuan， WU Zong-gui
, 百拇医药
(Department of Cardiology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
FEI Jian
(Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Science, Shanghai 200031, China)
[Abstract] AIM: To investigate the effect of intraventricular pressure change by volume overload (VOL) on expression of proto-oncogene c-fos,c-jun,c-myc and egr-1. METHODS: Left ventricular systolic pressure(LVSP) and left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) of rat with VOL induced by aortacaval fistula operation and rats of control group were measured at 30 min, 1, 4, 6, 12 and 48 h after the operation,these mRNAs at the foregoing time points were measured by slot bloting method and quantified with densitometry. RESULTS: Be compared with the control group, VOL rats LVSP decreased (P<0.05) and declined most remarkably at 48 h,LVEDP elevated significantly at 30 min (P<0.05), reached a maximal value at 12 h and the levels of control group at 48 h (P>0.05) after the operation.The proto-oncogene expression signals were not detected in the control,negative controls and VOL rats at 30 min after the operation. The c-fos,c-jun and egr-1 mRNA signals appeared earlier,at 1 h, and c-myc mRNA increased later at 4 h.All reached peak value at 4 h and then declined gradually.The c-fos mRNA were not detected at 48 h. The c-myc,c-0jun and egr-1 mRNA persisted throught the entire observation period from 1 h to 48 h. CONCLUSIONS: During VOL early phase the overload have effect on expression of the proto-oncogene mRNA,c-fos,c-jun and egr-1 mRNA appear earlier, c-myc later, egr-1,c-jun and c-myc persist longer period, but the expressions do not strengthen with the ventricule wall load increase.This sequential induction pattern may reflect the time course regularity of the proto-oncogenes expression induced by VOL,and indicate the proto-oncogenes expression initiate while the heart load accumulate some extent and duration and the load magnitude may not play a critical role.
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[MeSH] Ventricular function; Proto-oncogenes; Gene expression
长期血流动力学负荷增加心脏将发生代偿性心肌肥厚，然而左心室肥厚又是发生心力衰竭、心肌梗塞和猝死的独立危险因素。原癌基因编码的蛋白—生长因子、生长因子受体、细胞内信息传递器及核转录因子对细胞生长、增殖、分化发挥重要作用。已经证明，心肌肥厚发生过程极早期多种原癌基因有短暂表达，对调节心脏特异性基因的转录及心肌肥厚的发生可能起重要作用。心脏对不同刺激的应答—心肌原癌基因表达表现出刺激特异性以及不同的时间、空间次序[1～4]，这对其下游特异性基因表达和心肌肥厚的发生可能有特殊意义。目前对心脏超负荷诱导成年哺乳动物心肌肥厚的早期分子和细胞变化还不完全清楚，对活体容量超负荷(VOL)诱导心肌原癌基因表达的研究较少，国内尚无研究报告。因此，我们用核酸杂交的方法检测大鼠活体心脏VOL早期左心室压力与3个不同家族的转录因子：亮氨酸拉链(leucine zipper)结构c-fos、c-jun，锌指(zinc finger)结构egr-1和螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)结构c-myc心肌原癌基因表达时间变化规律。
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材 料 和 方 法
一、大鼠容量超负荷模型建立
雄性Wistar大鼠(体重：200～250 g)，参照Garcia等的方法[6]，以18G针头进行腹主动脉-腔静脉穿刺建立动静脉瘘(aorta vena caval fistula，AVF)。为减少手术对原癌基因表达的影响，尽可能缩短手术时间 ，VOL大鼠(n=4)完成AVF时间为5～9 min。假手术对照组(n=4)除不进行穿刺外处理步骤相同。二组大鼠分别于术后30 min、1、4、6、12、48 h参照Litwin等的方法[7]左心室穿刺，用HP78560A型中心监测仪(Hewlett Packard CO,USA)检测左心室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)和舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)。心室压力检测后处死动物，迅速取出心脏，分离左心室，液氮中速冻后转移至-70℃冰箱中保存。
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二、mRNA检测
使用TRIzol(GibcoBRL)抽提左心室心肌总RNA，用紫外分光光度计以260 nm进行定量。按标准方法[8]进行狭缝杂交。以β-actin为内对照、酵母tRNA为阴性对照。大鼠c-fos、c-jun、c-myc、egr-1、β-actin mRNA寡核苷酸探针：c-fos 5′-CAAGT TGATC TGTCT CCGCT CGTAT CTGTC-3′；c-jun 5′-GATGT GCCCA TTGCT GGACT GGATG ATCAG-3′；c-myc 5′-TTGTT CTTCT TCAGA GTCGC TGCTG GTGGT -3′；egr-1 5′-TGGGA GGCAG AGGAA GACGA TGAAG CAGCT-3′；β-actin 5′-CCTAG AAGCA TTTGC GGTGC ACGAT GGAGG-3′(由中科院上海细胞生物学研究所基因工程实验室合成)。用T4多聚核苷酸激酶(Promega CO.)、[32 P-γ]ATP(Amersham CO.)进行5′端标记寡核苷酸探针，标记后比活性为109 counts*min-1*μg-1。用狭缝杂交板转膜(Hybond-N,Amersham)后，加入探针，55℃杂交16 h后洗膜、进行放射性自显影。用电脑图象分析仪检测杂交信号的相对光密度(IOD)。每组实验重复三次，计算上述原癌基因mRNA杂交信号与内对照β-actin mRNA IOD的比值，所有检测结果用此比值表示，以各组最早的阳性表达为100%。
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三、数据分析
试验数据以均值±标准差(
±s)表示，用Bonferroni t和Student t检验判断均数差异显著性。
结 果
一、AVF术后大鼠左心室LVSP和LVEDP变化时间过程(图1)
VOL组大鼠AVF后30 min LVSP低于对照组29%(P<0.05)， 48 h低于对照组42%(P<0.05)，LVEDP术后30 min高于对照组283%(P<0.05)，12 h为700%(P<0.05)，48h接近对照组水平(P>0.05)。
Fig 1 Showing the time point changes of LVP after the AVF±s, n=4; * P<0.05, vs control;
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# P<0.05, vs other after AVF
图1 AVF术后左心室压力变化
二、VOL大鼠心肌c-fos、c-jun、c-myc和egr-1 mRNA表达变化时间过程(表1、图2)
AVF后30 min未检测出各原癌基因表达，均于术后4 h出现表达峰值。术后1 h c-fos mRNA可见微弱表达，4 h表达增强，为1 h的547%(P<0.05)，6 h为234%(P<0.05)，12 h表达水平与1 h相近，48 h无表达；同样，AVF后1 h c-jun mRNA表达较弱，4 h表达为1 h的578%(P<0.05)，6 h为150%(P>0.05)，12 h表达水平与1 h接近，48 h为1 h的181%(P<0.05)；术后1 h检测到egr-1 mRNA表达，4 h表达为前者336%(P<0.05)，此后6、12、48 h表达水平增强分别为1 h的166%、297%(P<0.05)、259%(P<0.05)；术后30 min、1 h未检测到c-myc mRNA表达， 4 h开始表达，并与6、12 h水平相近(P>0.05)，48 h表达水平显著低于6 h(P<0.05)，较前平均水平低22%。
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三、假手术对照组和阴性对照无阳性表达。
Fig 2 Slot blot analysis showing changes of c-fos,c-myc,c-jun,egr-1 mRNA expression after AVF
图2 AVF术后c-fos\,c-myc\,c-jun\,egr-1 mRNA表达变化
表1 VOL大鼠心肌c-fos、c-jun、c-myc和egr-1 mRNA IOD
Tab 1 IOD of c-fos,c-jun,c-myc and egr-1 mRNA in myocardium of VOL rats (±s,n=4)
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Time point after VOL (h)
Control 0.5
1
4
6
12
48 h
c-fos
0.12±0.02#
0.62±0.12
0.28±0.02*#▲
0.12±0.03#
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c-jun
0.16±0.02#
0.99±0.06
0.24±0.09*#▲
0.10±0.01#
0.29±0.04*#
c-myc
0.22±0.03
0.26±0.04
0.21±0.06
0.17±0.01△
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egr-1
0.42±0.05#
1.38±0.22
0.68±0.09#▲
1.23±0.09*
1.07±0.10*△
*P<0.05， vs 1 h; #P<0.05， vs 4 h; ▲P<0.05, vs 12 h; △P<0.05, vs 6 h, 12 h讨 论
AVF模型为经典的VOL模型，回心血量、LVEDP显著增高，心排血量增加，而外周阻力下降[8]，可认为AVF模型心脏无后负荷增加。与大鼠离体灌注心脏VOL心肌原癌基因表达实验结果[3，4]基本相同，本实验观察到c-fos、c-jun、egr-1、 c-myc mRNA表达水平增加，说明活体左心室前负荷异常增高可以诱导心肌原癌基因表达。对心脏负荷刺激通过何种分子机制，如何启动心肌细胞肥厚的基因表达还不清楚。研究表明，牵拉心肌细胞可诱导c-fos基因表达，牵拉响应元件(stretch response element)位于c-fos基因DNA的5′-侧翼[9]；机械性负荷可使牵拉激活性离子通道(stretch-activated ion (SA) channel)开放，SA开放增加细胞内Ca2+浓度可诱导心肌c-fos、c-jun表达增高，SA可能有启动心肌肥厚信号的机械性感受器作用；整合蛋白(integrin) 可作用于多种细胞内信号分子，对介导牵拉诱导的细胞反应可能起关键作用，很可能是将机械性信号转变为细胞内第二信使信号的机械性感受器，但阻断整合蛋白仍不能抑制c-fos表达。因此其在诱导心肌肥厚中的作用仍需进一步阐明[2]。
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与离体心脏实验[3～5]不完全相同，本实验检测出原癌基因表达和出现峰值的时间较晚，持续时间长。本实验观察到c-fos、c-jun、egr-1首先表达，c-myc较晚，c-fos表达水平下降较快；c-jun、egr-1、c-myc mRNA表达持续时间较长，48 h仍有较高的表达，这种表达时间变化过程反映出心脏负荷诱导活体和离体心肌原癌基因表达变化的不同，原癌基因持续表达对VOL诱导心肌肥厚可能有重要意义。
VOL导致心肌肥厚是心室对舒张末室壁负荷增加的应答反应，最终导致心腔容积增加，室壁厚度增加将使室壁所受的负荷恢复正常。AVF后早期(24 h)心肌重量无明显变化，1周时则可见明显的心肌肥厚[8]。根据La Place定律(室壁负荷与心室内压力、心室内径呈正比，与室壁厚度呈反比)，应认为LVEDP增加时舒张末室壁负荷显著增加。本实验原癌基因表达峰值均出现于术后4 h，并非LVEDP增高最显著的术后12 h；c-fos 、c-jun mRNA表达峰值后较短时间内水平明显下降，而c-myc、egr-1 mRNA则持续较高水平地表达，未见随LVEDP变化的趋势。提示心脏VOL时，当室壁受到一定程度、和一定时间的负荷牵拉，心肌原癌基因即开始表达，并且负荷达到一定程度后其强弱可能并非重要影响因素。Slinker等[4]观察到，给离体兔左心室不同的负荷，仅30 min c-fos表达与左室舒张末容积(EDV)有密切关系，60 min时EDV对c-fos、egr-1表达无明显影响。Schunkert等[10]的实验观察到，当抑制心肌主动收缩时，给予左心室不同负荷使心肌被动牵拉，各种负荷诱导c-fos、c-jun mRNA表达水平无差异；当左室前负荷固定，c-fos、c-jun mRNA表达水平与左室单位重量心肌产生的主动左室收缩压的高低成正相关，提示LVEDP的变化不是诱导左室心肌c-fos、c-myc mRNA表达的主要因素。这些观察结果似乎还得到临床证据的支持，研究发现许多高血压患者仅轻度血压增高就出现左心室肥厚，并且高血压患者与正常人严格配对的研究表明实际所有高血压患者均有左心室肥厚[1] 。
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牵拉和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)均可激活多种第二信使信号分子、导致心肌细胞肥厚，由于大鼠VOL早期就可激活循环、心脏肾素血管紧张素系统[2] ，心脏AngⅡ增加是否通过影响心肌原癌基因表达对发生心肌肥厚起一定作用，本实验结果尚不能阐明。
[基金资助] 国家自然科学基金部分资助(39470838)
[参 考 文 献]
[1] Susic D, Frohlich ED.Left ventricular hypertrophy : pathophysiological and molecular biological [J].Hypert Res, 1993, 16: 163～177.
[2] Sadoshima J,Izumo S.The cellular and molecular response of cardiac myocytes to mechanical stress [J].Annu Rev Physiol, 1997,59:551～571.
, 百拇医药
[3] Kolbeck-Ruhmkorff C,Zimmer H.Proto-oncogene expression in the isolated working rat heart combination of pressure and volume overload with norepinephrine[J]. J Mol Cell Cardiol, 1995,27:501～511.
[4] Slinker BK,Stephens RL,Fisher SA,et al.Immediate-early gene responses to different cardiac loads in the ejecting rabbit left ventricule [J].J Mol Cell Cardiol, 1996,28:1565～1574.
[5] Garcia G,Diebold S. Simple, rapid and effective method of producing aortocaval shunt in the rat [J].Cardiovasc Res, 1990, 24: 430～432.
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[6] Litwin SE, Katz SE, Weiberg EO,et al. Serial echocardiographic -doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy.Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure[J]. Circulation, 1995,91:2642～2654.
[7] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning [M].New York:Coldspring Harbor Laboratory Press,1989.
[8] Ruzicka M,Yuan B,Harmsen E,et al.The renin-angiotensin system and volume overload-induced cardiac hypertrophy in rats. Effects of angiotensin converting enzyme inhibitor versus angiotensin Ⅱ receptor blocker [J].Circulation， 1993， 87: 921～930.
, 百拇医药
[9] Komuro I,Kaida T,Shibazaki Y,et al.Stretching cardiac myocytes stimulates protooncogene expression[J]. J Biol Chem， 1990，265:3595～3598.
[10] Schunkert H,Jahn L,Izumo S,et al.Localization and regulation of c-fos and c-jun protoocogene induction by systolic wall stress in normal and hypertrophied rats heart [J].Proc Natl Acad Sci USA， 1991，88:11480～11484.
[收稿日期]1999-02-01
[修回日期]1999-08-10, 百拇医药
单位：胡小萍(上海浦南医院病理科,上海 200125)；李贺 张国元 吴宗贵(上海长征医院心内科，上海 200003)；费俭(中国科学院上海细胞生物学研究所，上海 200031)
关键词：心室功能；原癌基因；基因表达
中国病理生理杂志000705 [摘 要] 目的：检测大鼠心脏容量超负荷(volume overload，VOL)时左心室内压变化诱导心肌原癌基因c-fos、c-jun、c-myc 、egr-1 mRNA表达的时间变化规律。方法：测定VOL 、假手术对照组大鼠术后30 min、1、4、6、12及48 h左心室收缩压(LVSP)和舒张末压(LVEDP)，用狭缝杂交检测2组各时间左室心肌原癌基因表达，用密度仪进行定量分析。结果:VOL大鼠术后LVSP显著低于假手术组(P<0.05)，48 h最低；术后30 min LVEDP高于假手术组(P<0.05)，12 h最高，48 h与假手术组相近(P>0.05)；假手术组和阴性对照各原癌基因无阳性表达，AVF后1 h检测到c-fos 、c-jun、egr-1 mRNA表达，4 h检测到c-myc表达，均于4 h出现表达峰值，此后减弱，48 h c-fos无表达，c-jun表达较弱，c-myc和egr-1仍有较高表达。结论：VOL大鼠LVEDP增加，首先诱导c-fos、c-jun、egr-1表达，c-myc表达较晚，c-myc、c-jun、 egr-1表达持续时间较长，可能反映了活体VOL刺激心肌原癌基因表达时间变化规律；当室壁受到一定程度和一定时间的负荷牵拉后心肌原癌基因即开始表达，负荷的强弱可能并非重要因素。
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[中图分类号] Q754； K346.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0592-04
Correlation between intraventricular pressure and early
phase proto-oncogene expression in volume overload rats
HU Xiao-ping
(Department of Pathology, Punan Hospital, Shanghai 200125, China)
LI He，ZHANG Guo-yuan， WU Zong-gui
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(Department of Cardiology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
FEI Jian
(Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Science, Shanghai 200031, China)
[Abstract] AIM: To investigate the effect of intraventricular pressure change by volume overload (VOL) on expression of proto-oncogene c-fos,c-jun,c-myc and egr-1. METHODS: Left ventricular systolic pressure(LVSP) and left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) of rat with VOL induced by aortacaval fistula operation and rats of control group were measured at 30 min, 1, 4, 6, 12 and 48 h after the operation,these mRNAs at the foregoing time points were measured by slot bloting method and quantified with densitometry. RESULTS: Be compared with the control group, VOL rats LVSP decreased (P<0.05) and declined most remarkably at 48 h,LVEDP elevated significantly at 30 min (P<0.05), reached a maximal value at 12 h and the levels of control group at 48 h (P>0.05) after the operation.The proto-oncogene expression signals were not detected in the control,negative controls and VOL rats at 30 min after the operation. The c-fos,c-jun and egr-1 mRNA signals appeared earlier,at 1 h, and c-myc mRNA increased later at 4 h.All reached peak value at 4 h and then declined gradually.The c-fos mRNA were not detected at 48 h. The c-myc,c-0jun and egr-1 mRNA persisted throught the entire observation period from 1 h to 48 h. CONCLUSIONS: During VOL early phase the overload have effect on expression of the proto-oncogene mRNA,c-fos,c-jun and egr-1 mRNA appear earlier, c-myc later, egr-1,c-jun and c-myc persist longer period, but the expressions do not strengthen with the ventricule wall load increase.This sequential induction pattern may reflect the time course regularity of the proto-oncogenes expression induced by VOL,and indicate the proto-oncogenes expression initiate while the heart load accumulate some extent and duration and the load magnitude may not play a critical role.
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[MeSH] Ventricular function; Proto-oncogenes; Gene expression
长期血流动力学负荷增加心脏将发生代偿性心肌肥厚，然而左心室肥厚又是发生心力衰竭、心肌梗塞和猝死的独立危险因素。原癌基因编码的蛋白—生长因子、生长因子受体、细胞内信息传递器及核转录因子对细胞生长、增殖、分化发挥重要作用。已经证明，心肌肥厚发生过程极早期多种原癌基因有短暂表达，对调节心脏特异性基因的转录及心肌肥厚的发生可能起重要作用。心脏对不同刺激的应答—心肌原癌基因表达表现出刺激特异性以及不同的时间、空间次序[1～4]，这对其下游特异性基因表达和心肌肥厚的发生可能有特殊意义。目前对心脏超负荷诱导成年哺乳动物心肌肥厚的早期分子和细胞变化还不完全清楚，对活体容量超负荷(VOL)诱导心肌原癌基因表达的研究较少，国内尚无研究报告。因此，我们用核酸杂交的方法检测大鼠活体心脏VOL早期左心室压力与3个不同家族的转录因子：亮氨酸拉链(leucine zipper)结构c-fos、c-jun，锌指(zinc finger)结构egr-1和螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)结构c-myc心肌原癌基因表达时间变化规律。
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材 料 和 方 法
一、大鼠容量超负荷模型建立
雄性Wistar大鼠(体重：200～250 g)，参照Garcia等的方法[6]，以18G针头进行腹主动脉-腔静脉穿刺建立动静脉瘘(aorta vena caval fistula，AVF)。为减少手术对原癌基因表达的影响，尽可能缩短手术时间 ，VOL大鼠(n=4)完成AVF时间为5～9 min。假手术对照组(n=4)除不进行穿刺外处理步骤相同。二组大鼠分别于术后30 min、1、4、6、12、48 h参照Litwin等的方法[7]左心室穿刺，用HP78560A型中心监测仪(Hewlett Packard CO,USA)检测左心室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)和舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)。心室压力检测后处死动物，迅速取出心脏，分离左心室，液氮中速冻后转移至-70℃冰箱中保存。
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二、mRNA检测
使用TRIzol(GibcoBRL)抽提左心室心肌总RNA，用紫外分光光度计以260 nm进行定量。按标准方法[8]进行狭缝杂交。以β-actin为内对照、酵母tRNA为阴性对照。大鼠c-fos、c-jun、c-myc、egr-1、β-actin mRNA寡核苷酸探针：c-fos 5′-CAAGT TGATC TGTCT CCGCT CGTAT CTGTC-3′；c-jun 5′-GATGT GCCCA TTGCT GGACT GGATG ATCAG-3′；c-myc 5′-TTGTT CTTCT TCAGA GTCGC TGCTG GTGGT -3′；egr-1 5′-TGGGA GGCAG AGGAA GACGA TGAAG CAGCT-3′；β-actin 5′-CCTAG AAGCA TTTGC GGTGC ACGAT GGAGG-3′(由中科院上海细胞生物学研究所基因工程实验室合成)。用T4多聚核苷酸激酶(Promega CO.)、[32 P-γ]ATP(Amersham CO.)进行5′端标记寡核苷酸探针，标记后比活性为109 counts*min-1*μg-1。用狭缝杂交板转膜(Hybond-N,Amersham)后，加入探针，55℃杂交16 h后洗膜、进行放射性自显影。用电脑图象分析仪检测杂交信号的相对光密度(IOD)。每组实验重复三次，计算上述原癌基因mRNA杂交信号与内对照β-actin mRNA IOD的比值，所有检测结果用此比值表示，以各组最早的阳性表达为100%。
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三、数据分析
试验数据以均值±标准差(
±s)表示，用Bonferroni t和Student t检验判断均数差异显著性。结 果
一、AVF术后大鼠左心室LVSP和LVEDP变化时间过程(图1)
VOL组大鼠AVF后30 min LVSP低于对照组29%(P<0.05)， 48 h低于对照组42%(P<0.05)，LVEDP术后30 min高于对照组283%(P<0.05)，12 h为700%(P<0.05)，48h接近对照组水平(P>0.05)。
Fig 1 Showing the time point changes of LVP after the AVF
±s, n=4; * P<0.05, vs control;, http://www.100md.com
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图1 AVF术后左心室压力变化
二、VOL大鼠心肌c-fos、c-jun、c-myc和egr-1 mRNA表达变化时间过程(表1、图2)
AVF后30 min未检测出各原癌基因表达，均于术后4 h出现表达峰值。术后1 h c-fos mRNA可见微弱表达，4 h表达增强，为1 h的547%(P<0.05)，6 h为234%(P<0.05)，12 h表达水平与1 h相近，48 h无表达；同样，AVF后1 h c-jun mRNA表达较弱，4 h表达为1 h的578%(P<0.05)，6 h为150%(P>0.05)，12 h表达水平与1 h接近，48 h为1 h的181%(P<0.05)；术后1 h检测到egr-1 mRNA表达，4 h表达为前者336%(P<0.05)，此后6、12、48 h表达水平增强分别为1 h的166%、297%(P<0.05)、259%(P<0.05)；术后30 min、1 h未检测到c-myc mRNA表达， 4 h开始表达，并与6、12 h水平相近(P>0.05)，48 h表达水平显著低于6 h(P<0.05)，较前平均水平低22%。
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三、假手术对照组和阴性对照无阳性表达。
Fig 2 Slot blot analysis showing changes of c-fos,c-myc,c-jun,egr-1 mRNA expression after AVF
图2 AVF术后c-fos\,c-myc\,c-jun\,egr-1 mRNA表达变化
表1 VOL大鼠心肌c-fos、c-jun、c-myc和egr-1 mRNA IOD
Tab 1 IOD of c-fos,c-jun,c-myc and egr-1 mRNA in myocardium of VOL rats (
±s,n=4), http://www.100md.com
Time point after VOL (h)
Control 0.5
1
4
6
12
48 h
c-fos
0.12±0.02#
0.62±0.12
0.28±0.02*#▲
0.12±0.03#
, 百拇医药
c-jun
0.16±0.02#
0.99±0.06
0.24±0.09*#▲
0.10±0.01#
0.29±0.04*#
c-myc
0.22±0.03
0.26±0.04
0.21±0.06
0.17±0.01△
, http://www.100md.com
egr-1
0.42±0.05#
1.38±0.22
0.68±0.09#▲
1.23±0.09*
1.07±0.10*△
*P<0.05， vs 1 h; #P<0.05， vs 4 h; ▲P<0.05, vs 12 h; △P<0.05, vs 6 h, 12 h讨 论
AVF模型为经典的VOL模型，回心血量、LVEDP显著增高，心排血量增加，而外周阻力下降[8]，可认为AVF模型心脏无后负荷增加。与大鼠离体灌注心脏VOL心肌原癌基因表达实验结果[3，4]基本相同，本实验观察到c-fos、c-jun、egr-1、 c-myc mRNA表达水平增加，说明活体左心室前负荷异常增高可以诱导心肌原癌基因表达。对心脏负荷刺激通过何种分子机制，如何启动心肌细胞肥厚的基因表达还不清楚。研究表明，牵拉心肌细胞可诱导c-fos基因表达，牵拉响应元件(stretch response element)位于c-fos基因DNA的5′-侧翼[9]；机械性负荷可使牵拉激活性离子通道(stretch-activated ion (SA) channel)开放，SA开放增加细胞内Ca2+浓度可诱导心肌c-fos、c-jun表达增高，SA可能有启动心肌肥厚信号的机械性感受器作用；整合蛋白(integrin) 可作用于多种细胞内信号分子，对介导牵拉诱导的细胞反应可能起关键作用，很可能是将机械性信号转变为细胞内第二信使信号的机械性感受器，但阻断整合蛋白仍不能抑制c-fos表达。因此其在诱导心肌肥厚中的作用仍需进一步阐明[2]。
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与离体心脏实验[3～5]不完全相同，本实验检测出原癌基因表达和出现峰值的时间较晚，持续时间长。本实验观察到c-fos、c-jun、egr-1首先表达，c-myc较晚，c-fos表达水平下降较快；c-jun、egr-1、c-myc mRNA表达持续时间较长，48 h仍有较高的表达，这种表达时间变化过程反映出心脏负荷诱导活体和离体心肌原癌基因表达变化的不同，原癌基因持续表达对VOL诱导心肌肥厚可能有重要意义。
VOL导致心肌肥厚是心室对舒张末室壁负荷增加的应答反应，最终导致心腔容积增加，室壁厚度增加将使室壁所受的负荷恢复正常。AVF后早期(24 h)心肌重量无明显变化，1周时则可见明显的心肌肥厚[8]。根据La Place定律(室壁负荷与心室内压力、心室内径呈正比，与室壁厚度呈反比)，应认为LVEDP增加时舒张末室壁负荷显著增加。本实验原癌基因表达峰值均出现于术后4 h，并非LVEDP增高最显著的术后12 h；c-fos 、c-jun mRNA表达峰值后较短时间内水平明显下降，而c-myc、egr-1 mRNA则持续较高水平地表达，未见随LVEDP变化的趋势。提示心脏VOL时，当室壁受到一定程度、和一定时间的负荷牵拉，心肌原癌基因即开始表达，并且负荷达到一定程度后其强弱可能并非重要影响因素。Slinker等[4]观察到，给离体兔左心室不同的负荷，仅30 min c-fos表达与左室舒张末容积(EDV)有密切关系，60 min时EDV对c-fos、egr-1表达无明显影响。Schunkert等[10]的实验观察到，当抑制心肌主动收缩时，给予左心室不同负荷使心肌被动牵拉，各种负荷诱导c-fos、c-jun mRNA表达水平无差异；当左室前负荷固定，c-fos、c-jun mRNA表达水平与左室单位重量心肌产生的主动左室收缩压的高低成正相关，提示LVEDP的变化不是诱导左室心肌c-fos、c-myc mRNA表达的主要因素。这些观察结果似乎还得到临床证据的支持，研究发现许多高血压患者仅轻度血压增高就出现左心室肥厚，并且高血压患者与正常人严格配对的研究表明实际所有高血压患者均有左心室肥厚[1] 。
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牵拉和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)均可激活多种第二信使信号分子、导致心肌细胞肥厚，由于大鼠VOL早期就可激活循环、心脏肾素血管紧张素系统[2] ，心脏AngⅡ增加是否通过影响心肌原癌基因表达对发生心肌肥厚起一定作用，本实验结果尚不能阐明。
[基金资助] 国家自然科学基金部分资助(39470838)
[参 考 文 献]
[1] Susic D, Frohlich ED.Left ventricular hypertrophy : pathophysiological and molecular biological [J].Hypert Res, 1993, 16: 163～177.
[2] Sadoshima J,Izumo S.The cellular and molecular response of cardiac myocytes to mechanical stress [J].Annu Rev Physiol, 1997,59:551～571.
, 百拇医药
[3] Kolbeck-Ruhmkorff C,Zimmer H.Proto-oncogene expression in the isolated working rat heart combination of pressure and volume overload with norepinephrine[J]. J Mol Cell Cardiol, 1995,27:501～511.
[4] Slinker BK,Stephens RL,Fisher SA,et al.Immediate-early gene responses to different cardiac loads in the ejecting rabbit left ventricule [J].J Mol Cell Cardiol, 1996,28:1565～1574.
[5] Garcia G,Diebold S. Simple, rapid and effective method of producing aortocaval shunt in the rat [J].Cardiovasc Res, 1990, 24: 430～432.
, http://www.100md.com
[6] Litwin SE, Katz SE, Weiberg EO,et al. Serial echocardiographic -doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy.Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure[J]. Circulation, 1995,91:2642～2654.
[7] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning [M].New York:Coldspring Harbor Laboratory Press,1989.
[8] Ruzicka M,Yuan B,Harmsen E,et al.The renin-angiotensin system and volume overload-induced cardiac hypertrophy in rats. Effects of angiotensin converting enzyme inhibitor versus angiotensin Ⅱ receptor blocker [J].Circulation， 1993， 87: 921～930.
, 百拇医药
[9] Komuro I,Kaida T,Shibazaki Y,et al.Stretching cardiac myocytes stimulates protooncogene expression[J]. J Biol Chem， 1990，265:3595～3598.
[10] Schunkert H,Jahn L,Izumo S,et al.Localization and regulation of c-fos and c-jun protoocogene induction by systolic wall stress in normal and hypertrophied rats heart [J].Proc Natl Acad Sci USA， 1991，88:11480～11484.
[收稿日期]1999-02-01
[修回日期]1999-08-10, 百拇医药