血小板活化因子对培养人脐静脉血管内皮细胞损伤作用的探讨*
作者：李文 金鸣 李金荣 路彤 陈铁军
单位：李文 金鸣 李金荣 路彤(北京市心肺血管疾病研究所, 北京100029)；陈铁军(首都医科大学病理室, 北京 100054)
关键词：血小板活化因子；内皮，血管
中国病理生理杂志000724 [摘 要] 目的： 观察在培养条件下血小板活化因子(PAF)能否直接损伤原代人血管内皮细胞(HVEC)和ECV-304细胞系。方法： 利用光镜和结晶紫比色的方法，观察HVEC、ECV-304细胞系与PAF孵育前后形态和生物活性变化。结果： PAF与HVEC孵育30min即发生细胞形态改变，生物活性则未见显著下降，与ECV-304细胞系孵育后的细胞形态和生物活性未见明显变化。结论： 在培养条件下PAF可致HVEC损伤，对ECV-304细胞系则未见明显损伤。
[中图分类号] R331.3+2 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0609-02
[MeSH] Platelet activating factor; Endothelium, vascular
血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)是目前已知的强促炎因子，具有多种生物学效应，可诱导血小板聚集，引发白细胞粘附，使毛细血管通透性增强，导致缺氧心肌再灌注损伤，在动脉粥样硬化的发生、心肌缺血再灌注损伤、炎症、移植排斥反应等过程中有重要作用[1，2]。本文利用体外培养技术，研究PAF对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein vascular endothelial cell , HVEC)和血管内皮细胞系ECV-304是否有直接损伤作用。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、材料
PAF(1-o-octadecyl-2(R)-acetyl-glycero-3-phosphocholine), 购自Sigma公司，用前以含0.25%BSA-Hanks液稀释；M199培养基、DMEM培养基, 购自Gibco公司；0.1%I型胶原酶，购自Sigma公司；银杏总内酯(Ginkolide，其中含：Ginkolide A 39.6%，Ginkolide B 39.9%，Ginkolide C 2.0%)，由南京药科大学娄凤昌教授提供，用前以含0.25%BSA-Hanks液稀释。
二、方法
(一)HVEC的分离与培养 取新生儿脐带20～40 cm，用生理盐水冲净残存血液，以0.1%胶原酶37℃消化15 min，收集消化液，1000 r/min离心10 min，D-Hanks液洗2次，M199、15%胎牛血清、青霉素和链霉素液调细胞数至1×106个/mL，加到24孔培养板，100 μL/孔(1×105个细胞/孔)，37℃、5% CO2培养3～5 d使细胞长成单层贴壁细胞。第一批实验将细胞分为HVEC+PAF(不同浓度)、0.25% BSA-Hanks和Triton-100(0.05%)共3组，观察细胞形态和活性；第二批实验将细胞分为HVEC+PAF(不同浓度)、HVEC+Ginkolide(10 mg/L)、HVEC+Ginkolide(10 mg/L)+PAF(不同浓度)、0.25% BSA-Hanks共4组，观察细胞形态和活性。
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(二)传代EC的培养 细胞系ECV-304由中国医学科学院基础医学研究所细胞室馈赠，用含10%胎牛血清的DMEM培养，其它条件同上。
(三)细胞形态观察 用倒置显微镜观察细胞形态和整体排列分布情况。
(四)细胞活性观察 根据文献[3]的方法，用0.25%结晶紫染色，在570 nm测定光密度值。
(五)统计方法 数据用
±s表示，统计先用ANOVA，然后用Q检验进行两组间差异显著性检验，利用SPSS6.0软件包进行统计。结 果
一、 HVEC的形态和活性变化
HVEC与PAF孵育30 min后，形态由长梭状或多边形变为椭圆或圆形，细胞间隙加大，由紧密排列变为疏松的单个细胞，但每次实验所需PAF的浓度不同,在10-12～10-6mol/L之间，生物活性与正常对照相比无显著差异(P>0.05)，见表1。
, 百拇医药
表1 PAF对HVEC生物活性的影响
Tab 1 Effect of PAF on bioactivity of HVEC(
±s) Group
n
OD
0.25% BSA-Hanks
12
0.72±0.38
0.05% Triton
12
0.35±0.15*
, 百拇医药
PAF(10-6mol/L)
12
0.58±0.32
*P<0.05， vs 0.25% BSA-Hanks
HVEC与Ginkolide(10 mg/L)先孵育5 min后，再加入PAF孵育1 h，细胞形态及排列未见明显变化，其结晶紫染色OD值与0.25% BSA-Hanks组相近，PAF、Ginkolide与HVEC孵育后活性染色OD值分别与0.25% BSA-Hanks组无明显差异,见表2。
表2 PAF与Ginkolide对HVEC生物活性的影响
Tab 2 Effect of PAF and Ginkolide on bioactivity of HVEC(±s) Group
, http://www.100md.com
n
OD
0.25% BSA-Hanks
8
0.54±0.17
PAF(10-6mol/L)
8
0.40±0.19
Ginkolide(10 mg/L)
8
0.54±0.22
Ginkolide(10 mg/L)+PAF(10-6mol/L)
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8
0.54±0.30
二、 ECV-304的形态和活性变化
ECV-304细胞系与PAF(10-6mol/L)孵育1h后，其结晶紫染色OD值未见明显变化；孵育2h后，细胞形态及分布排列未见明显变化。讨 论
PAF是目前已知的强促炎因子，可以引发血小板聚集，白细胞粘附性增加，Bussolino等报道[2]，PAF可使培养的HVEC收缩而失去其连接的完整性；荧光染色发现，受PAF刺激的内皮细胞(endothelial cell, EC)内，F-actin消失或分布异常，[125I]标记白蛋白透过率增加，PAF的有效剂量低(10-10mol/L～10-8mol/L)，将lyso-PAF剂量增大10 000倍也无以上作用，且以上作用可被PAF受体拮抗剂如CV-3988、Ginkolide阻断，说明其作用机制可能是作用于EC上的PAF受体。但亦有实验报道称，仅用PAF不能引起培养EC的白蛋白透过率增加，当EC受损时(如在超氧化条件下)，其通透性增加，白蛋白通透实验均呈阳性，EC形态排列亦见变化[4～6]。本研究结果提示，在无其它损伤因素作用时，PAF对培养的HVEC有损伤作用，可使细胞形态由多边形或长梭形变为圆形，且失去紧密相接的完整排列方式，间隙加大或呈单个游离细胞，但生物活性与对照组比较差异无统计学意义，而有明显的下降趋势，支持前述体外条件下不加其它损伤因素，仅PAF即可造成EC损伤的观点，但所需浓度范围较大，在10-11mol/L～10-6mol/L之间，似存在明显的细胞个体差异，且PAF的损伤作用可被Ginkolide所抑制，与文献报道相同[1，2]。对来源统一的EVC-304细胞系，10-6mol/L的PAF似不能造成损伤。
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[基金项目] 国家自然科学基金资助(No.39670884)；首都医科大学基础与临床联合科研基金资助
[参 考 文 献]
[1] HU Jin-Hong, SUN Du-Xin, ZENG Guo-Qian, et al. Platelet adhesion to cultured bovine cerebral microvascular endothelial cells by stimulation of platelet activating factor and antagonism of drugs[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 1995,16(4):318～321.
[2] Bussolino F, Giovanni C, Massimo A, et al. Human endothelial cells are tareget for platelet-activating factor. I.Platelet-activating factor induces changes in cytoskeleton structures[J]. J Immunol, 1987,139(7):2439～2446.
, http://www.100md.com
[3] 叶春婷，李斯明，查健群，等.结晶紫比色法检测表皮生长因子生物活性的探讨[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(2)：154～155 .
[4] Stoll LL, Spector A A. Interaction of platelet-activating factor with endothelial and vascular smooth muscle cells in coculture[J].Cell Physiol, 1989,139:253～261.
[5] Dkayama N, Ichikawa H, Coe L, et al. Exoqenous NO enhances hydrogen peroxide-mediated neutrophil adherence cultured endothelial cells[J]. Am J Physiol, 1998,274(5Pt1):L820～826.
[6] Ichikawa H, Flores S, Kvietys PR, et al. Molecular mechamisms of anoxia/reoxygenation-induced neutrophil adherence to cultured endothelial cells[J]. Circ Res, 1997,81(6):922～931.
[收稿日期] 2000-02-28
[修回日期] 2000-06-02, http://www.100md.com
单位：李文 金鸣 李金荣 路彤(北京市心肺血管疾病研究所, 北京100029)；陈铁军(首都医科大学病理室, 北京 100054)
关键词：血小板活化因子；内皮，血管
中国病理生理杂志000724 [摘 要] 目的： 观察在培养条件下血小板活化因子(PAF)能否直接损伤原代人血管内皮细胞(HVEC)和ECV-304细胞系。方法： 利用光镜和结晶紫比色的方法，观察HVEC、ECV-304细胞系与PAF孵育前后形态和生物活性变化。结果： PAF与HVEC孵育30min即发生细胞形态改变，生物活性则未见显著下降，与ECV-304细胞系孵育后的细胞形态和生物活性未见明显变化。结论： 在培养条件下PAF可致HVEC损伤，对ECV-304细胞系则未见明显损伤。
[中图分类号] R331.3+2 [文献标识码] A
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[文章编号] 1000-4718(2000)07-0609-02
[MeSH] Platelet activating factor; Endothelium, vascular
血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)是目前已知的强促炎因子，具有多种生物学效应，可诱导血小板聚集，引发白细胞粘附，使毛细血管通透性增强，导致缺氧心肌再灌注损伤，在动脉粥样硬化的发生、心肌缺血再灌注损伤、炎症、移植排斥反应等过程中有重要作用[1，2]。本文利用体外培养技术，研究PAF对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein vascular endothelial cell , HVEC)和血管内皮细胞系ECV-304是否有直接损伤作用。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、材料
PAF(1-o-octadecyl-2(R)-acetyl-glycero-3-phosphocholine), 购自Sigma公司，用前以含0.25%BSA-Hanks液稀释；M199培养基、DMEM培养基, 购自Gibco公司；0.1%I型胶原酶，购自Sigma公司；银杏总内酯(Ginkolide，其中含：Ginkolide A 39.6%，Ginkolide B 39.9%，Ginkolide C 2.0%)，由南京药科大学娄凤昌教授提供，用前以含0.25%BSA-Hanks液稀释。
二、方法
(一)HVEC的分离与培养 取新生儿脐带20～40 cm，用生理盐水冲净残存血液，以0.1%胶原酶37℃消化15 min，收集消化液，1000 r/min离心10 min，D-Hanks液洗2次，M199、15%胎牛血清、青霉素和链霉素液调细胞数至1×106个/mL，加到24孔培养板，100 μL/孔(1×105个细胞/孔)，37℃、5% CO2培养3～5 d使细胞长成单层贴壁细胞。第一批实验将细胞分为HVEC+PAF(不同浓度)、0.25% BSA-Hanks和Triton-100(0.05%)共3组，观察细胞形态和活性；第二批实验将细胞分为HVEC+PAF(不同浓度)、HVEC+Ginkolide(10 mg/L)、HVEC+Ginkolide(10 mg/L)+PAF(不同浓度)、0.25% BSA-Hanks共4组，观察细胞形态和活性。
, http://www.100md.com
(二)传代EC的培养 细胞系ECV-304由中国医学科学院基础医学研究所细胞室馈赠，用含10%胎牛血清的DMEM培养，其它条件同上。
(三)细胞形态观察 用倒置显微镜观察细胞形态和整体排列分布情况。
(四)细胞活性观察 根据文献[3]的方法，用0.25%结晶紫染色，在570 nm测定光密度值。
(五)统计方法 数据用
±s表示，统计先用ANOVA，然后用Q检验进行两组间差异显著性检验，利用SPSS6.0软件包进行统计。结 果一、 HVEC的形态和活性变化
HVEC与PAF孵育30 min后，形态由长梭状或多边形变为椭圆或圆形，细胞间隙加大，由紧密排列变为疏松的单个细胞，但每次实验所需PAF的浓度不同,在10-12～10-6mol/L之间，生物活性与正常对照相比无显著差异(P>0.05)，见表1。
, 百拇医药
表1 PAF对HVEC生物活性的影响
Tab 1 Effect of PAF on bioactivity of HVEC(
±s) Groupn
OD
0.25% BSA-Hanks
12
0.72±0.38
0.05% Triton
12
0.35±0.15*
, 百拇医药
PAF(10-6mol/L)
12
0.58±0.32
*P<0.05， vs 0.25% BSA-Hanks
HVEC与Ginkolide(10 mg/L)先孵育5 min后，再加入PAF孵育1 h，细胞形态及排列未见明显变化，其结晶紫染色OD值与0.25% BSA-Hanks组相近，PAF、Ginkolide与HVEC孵育后活性染色OD值分别与0.25% BSA-Hanks组无明显差异,见表2。
表2 PAF与Ginkolide对HVEC生物活性的影响
Tab 2 Effect of PAF and Ginkolide on bioactivity of HVEC(
±s) Group, http://www.100md.com
n
OD
0.25% BSA-Hanks
8
0.54±0.17
PAF(10-6mol/L)
8
0.40±0.19
Ginkolide(10 mg/L)
8
0.54±0.22
Ginkolide(10 mg/L)+PAF(10-6mol/L)
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8
0.54±0.30
二、 ECV-304的形态和活性变化
ECV-304细胞系与PAF(10-6mol/L)孵育1h后，其结晶紫染色OD值未见明显变化；孵育2h后，细胞形态及分布排列未见明显变化。讨 论
PAF是目前已知的强促炎因子，可以引发血小板聚集，白细胞粘附性增加，Bussolino等报道[2]，PAF可使培养的HVEC收缩而失去其连接的完整性；荧光染色发现，受PAF刺激的内皮细胞(endothelial cell, EC)内，F-actin消失或分布异常，[125I]标记白蛋白透过率增加，PAF的有效剂量低(10-10mol/L～10-8mol/L)，将lyso-PAF剂量增大10 000倍也无以上作用，且以上作用可被PAF受体拮抗剂如CV-3988、Ginkolide阻断，说明其作用机制可能是作用于EC上的PAF受体。但亦有实验报道称，仅用PAF不能引起培养EC的白蛋白透过率增加，当EC受损时(如在超氧化条件下)，其通透性增加，白蛋白通透实验均呈阳性，EC形态排列亦见变化[4～6]。本研究结果提示，在无其它损伤因素作用时，PAF对培养的HVEC有损伤作用，可使细胞形态由多边形或长梭形变为圆形，且失去紧密相接的完整排列方式，间隙加大或呈单个游离细胞，但生物活性与对照组比较差异无统计学意义，而有明显的下降趋势，支持前述体外条件下不加其它损伤因素，仅PAF即可造成EC损伤的观点，但所需浓度范围较大，在10-11mol/L～10-6mol/L之间，似存在明显的细胞个体差异，且PAF的损伤作用可被Ginkolide所抑制，与文献报道相同[1，2]。对来源统一的EVC-304细胞系，10-6mol/L的PAF似不能造成损伤。
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[基金项目] 国家自然科学基金资助(No.39670884)；首都医科大学基础与临床联合科研基金资助
[参 考 文 献]
[1] HU Jin-Hong, SUN Du-Xin, ZENG Guo-Qian, et al. Platelet adhesion to cultured bovine cerebral microvascular endothelial cells by stimulation of platelet activating factor and antagonism of drugs[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 1995,16(4):318～321.
[2] Bussolino F, Giovanni C, Massimo A, et al. Human endothelial cells are tareget for platelet-activating factor. I.Platelet-activating factor induces changes in cytoskeleton structures[J]. J Immunol, 1987,139(7):2439～2446.
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[3] 叶春婷，李斯明，查健群，等.结晶紫比色法检测表皮生长因子生物活性的探讨[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(2)：154～155 .
[4] Stoll LL, Spector A A. Interaction of platelet-activating factor with endothelial and vascular smooth muscle cells in coculture[J].Cell Physiol, 1989,139:253～261.
[5] Dkayama N, Ichikawa H, Coe L, et al. Exoqenous NO enhances hydrogen peroxide-mediated neutrophil adherence cultured endothelial cells[J]. Am J Physiol, 1998,274(5Pt1):L820～826.
[6] Ichikawa H, Flores S, Kvietys PR, et al. Molecular mechamisms of anoxia/reoxygenation-induced neutrophil adherence to cultured endothelial cells[J]. Circ Res, 1997,81(6):922～931.
[收稿日期] 2000-02-28
[修回日期] 2000-06-02, http://www.100md.com