缺氧复氧对人心房肌细胞内钙离子浓度的影响
作者：梁延春 张荣庆 周更须 贾国良 蔡振杰
单位：梁延春(沈阳军区总医院心脏内科,辽宁 沈阳 110000)；张荣庆 周更须 贾国良 蔡振杰(第四军医大学西京医院,陕西 西安 710033)
关键词：低氧；心肌；细胞；钙
中国病理生理杂志000723 [摘 要] 目的和方法: 观察缺氧、复氧对人心房肌细胞内钙离子浓度的影响。急性分离人心房肌细胞，以Fluo-3作为Ca2+指示剂，用激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+浓度变化。结果：人心房肌细胞在缺氧前[Ca2+]i为(117±48) nmol/L。在缺氧15 min时，[Ca2+]i即增加为(187±64) nmol/L(P<0.05， vs 缺氧前)。缺氧30 min时[Ca2+]i为(417±139) nmol/L(P<0.01， vs 缺氧前)。缺氧后复氧30 min[Ca2+]i为(786±238) nmol/L(P<0.01， vs 缺氧前)。结论：人心房肌细胞在缺氧状态下胞内Ca2+浓度升高，而当其短期复氧时，胞内Ca2+浓度继续增加。
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[中图分类号] R364.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0584-02
[MeSH] Anoxia; Myocardium; Cells; Calcium
Ca2+作为细胞生命活动中信息传递的第二信使，是维持心肌细胞功能的基础因素，其在细胞内浓度的变化，很大程度上影响着心肌细胞收缩，电兴奋等生理功能的变化。细胞受损伤时，胞内Ca2+浓度[Ca2+]i会发生变化, 但不同的细胞有不同的变化，多数细胞[Ca2+]i 升高，少数细胞[Ca2+]i下降[1，2]。缺氧缺血及缺血再灌注是人心肌损伤的最常见因素。但是对于这两个损伤因素的研究，较多地应用于心室肌，而对于心房肌的研究相对较少，尤其是对于人类心房肌的研究更为少见。本实验旨在应用激光共聚焦显微镜技术来观察缺氧、复氧对人心房肌[Ca2+]i的影响。
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材 料 和 方 法
一、实验对象
为99年3月至5月间来本院行心脏外科手术患者的右心耳。共4例(男2、女2，平均年龄8.8岁)。2例诊断为房间隔缺损，2例诊断为室间隔缺损。每例患者取同一培养皿中3个心房肌细胞作为研究对象，共观察12个细胞。
二、试剂和溶液
Tyrode液(mmol/L) NaCl 126.0 , KCl 5.4 , MgCl2 0.8 , CaCl2 1.0 , NaH2PO4 0.33 , HEPES 10.0 , Glucose 5.5 (pH7.4)。无Ca2+Tyrode液按Tyrode液配方不加CaCl2 (以下未特殊注明无Ca2+Tyrode液者均为有Ca2+ Tyrode液) 。Fluo-3/AM(美国BIO-RAD)。胶原酶(日本Yakult)。蛋白酶XXIV(美国Sigma)。 牛血清白蛋白(美国Amerco)。 氧和Tyrode液为实验应用前持续通入纯O2的Tyrode液(通气持续时间>1 h)。 缺氧Tyrode液为实验应用前持续通入纯N2的Tyrode液(通气持续时间>1 h，p O2<2.7 kP)。
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三、人心房肌细胞的分离
将手术中获得的小块右心耳组织迅速置于氧合的无Ca2+Tyrode液中，并于5 min内送回实验室。用无Ca2+Tyrode液清洗组织，然后将组织剪成1 mm3×1 mm 大小碎块，置于含有蛋白酶Ⅹ Ⅹ Ⅳ 2 U/mL,胶原酶200 U/mL的无Ca2+Tyrode液中，于37℃在充氧条件下消化40 min,而后将组织块移至含有胶原酶200 U/mL的无Ca2+Tyrode液中消化10～20 min。将组织块移至含有牛血清白蛋白的无Ca2+Tyrode液中，吹打，即可获得单个人心房肌细胞。
四、缺氧、复氧时人心房肌[Ca2+]i变化的观察
(一)原理 Fluo-3是一敏感性钙指示剂，能特异性与Ca2+结合，并在一定波长激光激发下产生荧光，其荧光强度与[Ca2+]i成正比，因而可用于[Ca2+]i的定量观察。但Fluo-3为极性大的酸性化合物，难以进入细胞膜，而当其结合上亲脂的2-酰羟甲基酯成为脂溶性的Fluo-3/AM,在与细胞温育时，很容易透过细胞膜，胞浆内的非特异性酯酶将其酯基脱去生成游离的Fluo-3。
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(二)Fluo-3/AM的荷载 采用离心方法(1 000 r/min,5 min)使用氧合Tyrode液洗涤获得的人心房肌细胞2次，将沉淀细胞吹匀后吸取2 mL加入培养皿中，于37℃避光条件下用Fluo-3/AM(4.4 μmol/L)荷载。90 min后人心房肌细胞贴壁完全，移去细胞外液，用氧合Tyrode 液洗涤细胞3次，洗去细胞外液残余染料，最后保留少许细胞外Tyrode液。
(三)缺氧与复氧实验 将培养皿中细胞外液换成缺氧Tyrode液即为缺氧条件。缺氧30 min后，将培养中细胞外液换成氧和 Tyrode液即为复氧条件。分别于缺氧前、缺氧15、30 min和复氧后30 min观察[Ca2+]i变化。
(四)细胞内Ca2+浓度的测定 Fluo-3/AM荷载的人心房肌细胞在共聚焦显微镜(MRC-1024,BIO-RAD)下扫描细胞内荧光强度，激发波长488 nm,放射波长526 nm。应用数字传入式摄像机和高速度计算机处理软件得到清晰的细胞内分布图像。利用其图像量化、分析系统进行图像分析。[Ca2+]i=kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)],kd是Fluo-3与Ca2+反应解离常数，kd=400 nmol/L,F为所测得的荧光强度值，Fmax和Fmin分别为Ca2+ 饱和和无Ca2+时的胞内荧光强度。
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五、统计方法
数据以均数±标准差表示，两两比较用配对t检验。
结 果
人心房肌细胞在常氧即缺氧前(图1A)，细胞内荧光强度和荧光光密度值较低, 细胞内游离Ca2+浓度[Ca2+]i为(117±48) nmol/L。在缺氧15 min时(图1B)，[Ca2+]i即增加，细胞内荧光强度增强，[Ca2+]i为(187±64) nmol/L(P<0.05， vs缺氧前)。缺氧30 min时(图1C)，细胞内荧光光密度值增加更为明显, [Ca2+]i为(417±139) nmol/L(P<0.01， vs缺氧前)。缺氧后复氧30 min(图1D)，细胞内荧光光密度值更加增高, [Ca2+]i为(786±238) nmol/L(P<0.01， vs 缺氧前)。
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Fig1 Photo showing intracellular fluoresence intensity of a atrial myocyte under normoxia(A)bypoxia(B)，30minbypoxina(C)and 30min reoxygenation afterhypoxia(D)
图1 人心房肌细胞在常氧(A)，缺氧15min(B)、缺氧30min(C)和缺氧后复氧30min(D)时的荧光强度和荧光密度值
讨 论
细胞的许多生理代谢活动都与[Ca2+]i有关。正常静息状态下，[Ca2+]i约为10-7 mol/L。心室肌细胞在缺血缺氧过程中，由于发生了氧反常和pH反常，[Ca2+]i升高，pH值下降。而当缺血缺氧再灌注时，心室肌细胞[Ca2+]i急速上升，以致较正常高出8～10倍，给细胞造成严重损伤，使心肌大面积坏死[3]。本研究发现，人心房肌细胞在缺氧、复氧过程中[Ca2+]i的变化，与心室肌细胞大致相同。在缺氧15 min时，[Ca2+]i即有所增高，缺氧30 min时[Ca2+]i增高更加明显，而复氧30 min后，[Ca2+]i继续明显增加，在缺氧30 min及缺氧后复氧30 min时，细胞形态亦有所改变。
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目前对细胞内Ca2+超载的机制尚不十分清楚。多数学者支持H+-Na+、Na+-Ca2+交换加强理论，即认为在心肌细胞缺氧后，可造成代谢异常使细胞内H+聚集引起胞内pH降低，而加大细胞内外的H+梯度，使H+-Na+、Na+-Ca2+交换得到加强，从而造成细胞内Ca2+超载[4，5]，有研究表明H+-Ca2+交换在加重细胞Ca2+超载中也起了不可忽视的作用[6]。
供给心房肌的冠脉血管病变，可直接导致心房肌缺血缺氧，造成心房肌病变，引起各种临床表现。一些非冠脉病变，如当今研究热点之一的心房纤颤，缺血缺氧这一损伤因素也可能参与其病理生理机制。Ausma等[7]研究发现，持续性心房纤颤导致的心房肌细胞超微结构的改变很类似心室肌细胞冬眠时的改变，提示心房肌缺血可能存在。在持续性心房纤颤时，由于过快的房性激动(400～600次/min)，使心房肌细胞耗氧量剧增，造成相对心房肌缺血。胞内Ca2+超载是许多细胞损伤的最后通路，因此对于心房肌细胞[Ca2+]i变化的研究对于揭示临床一些心房疾病的病理生理学机制有着十分重要的意义。
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[参 考 文 献]
[1] Stevens T, Cornfield DN, Mcmurtry IF, et al. Acute reductions in pO2 depolarize pulmonary artery endothelial cells[J]. Am J Physiol, 1994， 266(4 Pt 2): H1416～1421.
[2] 柴文祥，李 彤，梁继河,等. 重复急性缺氧再给氧对培养鼠主动脉内皮细胞胞内钙的影响[J]. 第四军医大学学报, 1997， 18(6): 43～45.
[3] Silverman HS, Stern MD. Ionic basis of ischaemic cardiac injury: insights from cellular studies. Cardiovasc Res, 1994， 28(5): 581～597.
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[4] 宋良文, 唐朝枢. pH反常与心肌缺血-再灌注损伤[J]. 国外医学生理、病理科学与临床分册, 1991， 12(1): 9～11.
[5] 赵廷存, 时安云. Na+/H+交换及其在心肌缺血再灌注损伤中的意义[J]. 生理科学进展, 1993， 24(2): 234～236.
[6] 张北奇, 马 宁, 周锡英, 等. H+-Ca2+交换在心肌细胞缺氧复氧过程中所致Ca2+超负荷的意义[J]. 中国病理生理杂志, 1996， 12(4): 587～589.
[7] Ausma J, Wijffels M, Thone F, et al. Structural changes of atrial myocardium due to sustained atrial fibrillation in the goat[J]. Circulation, 1997， 96(9): 3157～3163.
[收稿日期] 1999-11-20
[修回日期] 2000-04-17, http://www.100md.com
单位：梁延春(沈阳军区总医院心脏内科,辽宁 沈阳 110000)；张荣庆 周更须 贾国良 蔡振杰(第四军医大学西京医院,陕西 西安 710033)
关键词：低氧；心肌；细胞；钙
中国病理生理杂志000723 [摘 要] 目的和方法: 观察缺氧、复氧对人心房肌细胞内钙离子浓度的影响。急性分离人心房肌细胞，以Fluo-3作为Ca2+指示剂，用激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+浓度变化。结果：人心房肌细胞在缺氧前[Ca2+]i为(117±48) nmol/L。在缺氧15 min时，[Ca2+]i即增加为(187±64) nmol/L(P<0.05， vs 缺氧前)。缺氧30 min时[Ca2+]i为(417±139) nmol/L(P<0.01， vs 缺氧前)。缺氧后复氧30 min[Ca2+]i为(786±238) nmol/L(P<0.01， vs 缺氧前)。结论：人心房肌细胞在缺氧状态下胞内Ca2+浓度升高，而当其短期复氧时，胞内Ca2+浓度继续增加。
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[中图分类号] R364.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)07-0584-02
[MeSH] Anoxia; Myocardium; Cells; Calcium
Ca2+作为细胞生命活动中信息传递的第二信使，是维持心肌细胞功能的基础因素，其在细胞内浓度的变化，很大程度上影响着心肌细胞收缩，电兴奋等生理功能的变化。细胞受损伤时，胞内Ca2+浓度[Ca2+]i会发生变化, 但不同的细胞有不同的变化，多数细胞[Ca2+]i 升高，少数细胞[Ca2+]i下降[1，2]。缺氧缺血及缺血再灌注是人心肌损伤的最常见因素。但是对于这两个损伤因素的研究，较多地应用于心室肌，而对于心房肌的研究相对较少，尤其是对于人类心房肌的研究更为少见。本实验旨在应用激光共聚焦显微镜技术来观察缺氧、复氧对人心房肌[Ca2+]i的影响。
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材 料 和 方 法
一、实验对象
为99年3月至5月间来本院行心脏外科手术患者的右心耳。共4例(男2、女2，平均年龄8.8岁)。2例诊断为房间隔缺损，2例诊断为室间隔缺损。每例患者取同一培养皿中3个心房肌细胞作为研究对象，共观察12个细胞。
二、试剂和溶液
Tyrode液(mmol/L) NaCl 126.0 , KCl 5.4 , MgCl2 0.8 , CaCl2 1.0 , NaH2PO4 0.33 , HEPES 10.0 , Glucose 5.5 (pH7.4)。无Ca2+Tyrode液按Tyrode液配方不加CaCl2 (以下未特殊注明无Ca2+Tyrode液者均为有Ca2+ Tyrode液) 。Fluo-3/AM(美国BIO-RAD)。胶原酶(日本Yakult)。蛋白酶XXIV(美国Sigma)。 牛血清白蛋白(美国Amerco)。 氧和Tyrode液为实验应用前持续通入纯O2的Tyrode液(通气持续时间>1 h)。 缺氧Tyrode液为实验应用前持续通入纯N2的Tyrode液(通气持续时间>1 h，p O2<2.7 kP)。
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三、人心房肌细胞的分离
将手术中获得的小块右心耳组织迅速置于氧合的无Ca2+Tyrode液中，并于5 min内送回实验室。用无Ca2+Tyrode液清洗组织，然后将组织剪成1 mm3×1 mm 大小碎块，置于含有蛋白酶Ⅹ Ⅹ Ⅳ 2 U/mL,胶原酶200 U/mL的无Ca2+Tyrode液中，于37℃在充氧条件下消化40 min,而后将组织块移至含有胶原酶200 U/mL的无Ca2+Tyrode液中消化10～20 min。将组织块移至含有牛血清白蛋白的无Ca2+Tyrode液中，吹打，即可获得单个人心房肌细胞。
四、缺氧、复氧时人心房肌[Ca2+]i变化的观察
(一)原理 Fluo-3是一敏感性钙指示剂，能特异性与Ca2+结合，并在一定波长激光激发下产生荧光，其荧光强度与[Ca2+]i成正比，因而可用于[Ca2+]i的定量观察。但Fluo-3为极性大的酸性化合物，难以进入细胞膜，而当其结合上亲脂的2-酰羟甲基酯成为脂溶性的Fluo-3/AM,在与细胞温育时，很容易透过细胞膜，胞浆内的非特异性酯酶将其酯基脱去生成游离的Fluo-3。
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(二)Fluo-3/AM的荷载 采用离心方法(1 000 r/min,5 min)使用氧合Tyrode液洗涤获得的人心房肌细胞2次，将沉淀细胞吹匀后吸取2 mL加入培养皿中，于37℃避光条件下用Fluo-3/AM(4.4 μmol/L)荷载。90 min后人心房肌细胞贴壁完全，移去细胞外液，用氧合Tyrode 液洗涤细胞3次，洗去细胞外液残余染料，最后保留少许细胞外Tyrode液。
(三)缺氧与复氧实验 将培养皿中细胞外液换成缺氧Tyrode液即为缺氧条件。缺氧30 min后，将培养中细胞外液换成氧和 Tyrode液即为复氧条件。分别于缺氧前、缺氧15、30 min和复氧后30 min观察[Ca2+]i变化。
(四)细胞内Ca2+浓度的测定 Fluo-3/AM荷载的人心房肌细胞在共聚焦显微镜(MRC-1024,BIO-RAD)下扫描细胞内荧光强度，激发波长488 nm,放射波长526 nm。应用数字传入式摄像机和高速度计算机处理软件得到清晰的细胞内分布图像。利用其图像量化、分析系统进行图像分析。[Ca2+]i=kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)],kd是Fluo-3与Ca2+反应解离常数，kd=400 nmol/L,F为所测得的荧光强度值，Fmax和Fmin分别为Ca2+ 饱和和无Ca2+时的胞内荧光强度。
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五、统计方法
数据以均数±标准差表示，两两比较用配对t检验。
结 果
人心房肌细胞在常氧即缺氧前(图1A)，细胞内荧光强度和荧光光密度值较低, 细胞内游离Ca2+浓度[Ca2+]i为(117±48) nmol/L。在缺氧15 min时(图1B)，[Ca2+]i即增加，细胞内荧光强度增强，[Ca2+]i为(187±64) nmol/L(P<0.05， vs缺氧前)。缺氧30 min时(图1C)，细胞内荧光光密度值增加更为明显, [Ca2+]i为(417±139) nmol/L(P<0.01， vs缺氧前)。缺氧后复氧30 min(图1D)，细胞内荧光光密度值更加增高, [Ca2+]i为(786±238) nmol/L(P<0.01， vs 缺氧前)。
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Fig1 Photo showing intracellular fluoresence intensity of a atrial myocyte under normoxia(A)bypoxia(B)，30minbypoxina(C)and 30min reoxygenation afterhypoxia(D)
图1 人心房肌细胞在常氧(A)，缺氧15min(B)、缺氧30min(C)和缺氧后复氧30min(D)时的荧光强度和荧光密度值
讨 论
细胞的许多生理代谢活动都与[Ca2+]i有关。正常静息状态下，[Ca2+]i约为10-7 mol/L。心室肌细胞在缺血缺氧过程中，由于发生了氧反常和pH反常，[Ca2+]i升高，pH值下降。而当缺血缺氧再灌注时，心室肌细胞[Ca2+]i急速上升，以致较正常高出8～10倍，给细胞造成严重损伤，使心肌大面积坏死[3]。本研究发现，人心房肌细胞在缺氧、复氧过程中[Ca2+]i的变化，与心室肌细胞大致相同。在缺氧15 min时，[Ca2+]i即有所增高，缺氧30 min时[Ca2+]i增高更加明显，而复氧30 min后，[Ca2+]i继续明显增加，在缺氧30 min及缺氧后复氧30 min时，细胞形态亦有所改变。
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目前对细胞内Ca2+超载的机制尚不十分清楚。多数学者支持H+-Na+、Na+-Ca2+交换加强理论，即认为在心肌细胞缺氧后，可造成代谢异常使细胞内H+聚集引起胞内pH降低，而加大细胞内外的H+梯度，使H+-Na+、Na+-Ca2+交换得到加强，从而造成细胞内Ca2+超载[4，5]，有研究表明H+-Ca2+交换在加重细胞Ca2+超载中也起了不可忽视的作用[6]。
供给心房肌的冠脉血管病变，可直接导致心房肌缺血缺氧，造成心房肌病变，引起各种临床表现。一些非冠脉病变，如当今研究热点之一的心房纤颤，缺血缺氧这一损伤因素也可能参与其病理生理机制。Ausma等[7]研究发现，持续性心房纤颤导致的心房肌细胞超微结构的改变很类似心室肌细胞冬眠时的改变，提示心房肌缺血可能存在。在持续性心房纤颤时，由于过快的房性激动(400～600次/min)，使心房肌细胞耗氧量剧增，造成相对心房肌缺血。胞内Ca2+超载是许多细胞损伤的最后通路，因此对于心房肌细胞[Ca2+]i变化的研究对于揭示临床一些心房疾病的病理生理学机制有着十分重要的意义。
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[参 考 文 献]
[1] Stevens T, Cornfield DN, Mcmurtry IF, et al. Acute reductions in pO2 depolarize pulmonary artery endothelial cells[J]. Am J Physiol, 1994， 266(4 Pt 2): H1416～1421.
[2] 柴文祥，李 彤，梁继河,等. 重复急性缺氧再给氧对培养鼠主动脉内皮细胞胞内钙的影响[J]. 第四军医大学学报, 1997， 18(6): 43～45.
[3] Silverman HS, Stern MD. Ionic basis of ischaemic cardiac injury: insights from cellular studies. Cardiovasc Res, 1994， 28(5): 581～597.
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[4] 宋良文, 唐朝枢. pH反常与心肌缺血-再灌注损伤[J]. 国外医学生理、病理科学与临床分册, 1991， 12(1): 9～11.
[5] 赵廷存, 时安云. Na+/H+交换及其在心肌缺血再灌注损伤中的意义[J]. 生理科学进展, 1993， 24(2): 234～236.
[6] 张北奇, 马 宁, 周锡英, 等. H+-Ca2+交换在心肌细胞缺氧复氧过程中所致Ca2+超负荷的意义[J]. 中国病理生理杂志, 1996， 12(4): 587～589.
[7] Ausma J, Wijffels M, Thone F, et al. Structural changes of atrial myocardium due to sustained atrial fibrillation in the goat[J]. Circulation, 1997， 96(9): 3157～3163.
[收稿日期] 1999-11-20
[修回日期] 2000-04-17, http://www.100md.com