肺炎衣原体对C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化的影响
作者：金俊飞 杨永宗
单位：金俊飞(南京铁道医学院病理生理教研室， 江苏 南京 210009)；杨永宗(衡阳医学院心血管病研究所，湖南 衡阳 421001)
关键词：衣原体，肺炎；巨噬细胞；泡沫细胞；动脉粥样硬化
中国病理生理杂志000815
[摘 要] 目的：探讨肺炎衣原体在C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化过程中的作用。方法：将肺炎衣原体与C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞培养72 h后用油红O方法染色观察细胞的形态变化并测定细胞内胆固醇的含量。结果：肺炎衣原体能使C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞胞浆内脂质颗粒增多，胆固醇酯占总胆固醇的比例增加。结论：肺炎衣原体能促进C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化
[中图分类号] R543 [文献标识码] A
, 百拇医药
[文章编号]1000-4718(2000)08-0730-04
The role of chlamydia pneumoniae in the course of transformation
of C57 BL/6J mouse peritoneal macrophages into foam cells
YANG Yong-zong
(Institute of Cardiovascular Disease of Hengyang Medical College，Hengang 421001，China)
JIN Jun-fei
(Department of Pathophysiology, Nanjing railway Medical College, Nanjing 210009, China)
, http://www.100md.com
[Abstract] AIM： In order to understand the role of chlamydia pneumoniae in the course of macrophages transformation into foam cells experiments with chlamydia pneumoniae standard strain AR-39 wese made. METHOD: C57 BL/6J Mouse peritoneal macrophages C57 BL/6J wese incubated 24 h, and they were divided into 6 groups to be incubated continually: A1～DMEM; A2～DMEM+106 IFUs/L AR-39; B1～DMEM+10 mg/L LDL; B2～DMEM+10 mg/L LDL+106 IFUs/L AR-39; C1～DMEM+10 mg/L OxLDL ;C2～DMEM+10 mg/L OxLDL+106 IFUs/L AR-39. 72 h later, morphological changes of the cells were observed and of intracellular cholesterol of content was detected. RESULTS: 1、Morphological studies: there were no lipid particles in A1，A2 and B1 groups, but the lipid particles could be found in B2、C1 and C2 group, Among six groups, the most lipid particles were seen in C2 groups. 2、Biochemical detection:The ratio of cholesterol ester to total cholesterol was much higher than 50% in B2、C1 and C2 groups, but was less than 50% in A1、A2 and B1 groups. CONCLUSION: Chlamydia pneumoniae may have played a role in promoting C57 BL/6J mouse peritoneal macrophages into foam cells.
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[MeSH] Chlamydia pneumoniae; Macrophages; Foam cells; Atherosclerosis
自1988年Saikku等[1]将肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae，Cpn)与 动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)联系起来后，大量的流行病学资料表明肺炎衣原体与动脉粥样硬化密切相关，实验动物、人尸检标本以及临床病人身上也存在二者密切相关的证据[2]。但是Cpn在As发生与发展中的确切作用有待于更进 一步深入地研究。泡沫细胞的出现是As斑块中有特征性的病理形态改变，本实验在As易感小鼠C57 BL/6J腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞模型上观察Cpn标准株 AR-39对C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化的影响，以探讨Cpn在As过程中的可能作用。
材 料 与 方 法
, 百拇医药 一、材料
AR-39：由加拿大Monitoba大学钟光明博士赠送。实验动物：C57 BL/6J，100只，雄性，10周龄，体重(25±2.7)g，购自中国医学科学院实验动物繁育场。戊二醛、达氏修正依代培养基(Dulbeccos modified Eagles med, DMEM)培养基、Taq酶、dNTP、琼脂糖为Sigma公司产品，其它试剂均为国产分析纯。
二、实验分组
取C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞培养24 h让其贴壁后分为6组培养：A1：DMEM；A2：DMEM+106 IFUs/L AR-39；B1：DMEM+10 mg/L低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL；B2：DMEM+10 mg/LLDL+106 IFUs/L AR-39；C1：DMEM+10 mg/L OxLDL(coxidized low density lipoprotein)；C2: DMEM+10 mg/L OxLDL+106 IFUs/L AR-39。在35℃、5% CO2条件下培养72 h后进行形态学观察和细胞内胆固醇的定量分析。
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三、AR-39的培养
选用12 cm2的培养瓶，内含DMEM(加有10% FCS，100 μg/mL链霉素，100μg/mL万古霉素)，每一瓶中接种1 mL的HeLa-229细胞悬浮液(内含2×105个HeLa-229细胞)，温育过夜形成融合的细胞单层。用DEAE-dextran处理[3]后加入0.1 mL(108 IFUs/L)的AR-39储存液，轻轻摇动培养瓶，以便储存液能完全覆盖细胞单层，将培养瓶放入35 ℃培养箱中，每隔15 min摇晃1次，至少温育2 h让其完全粘附，轻轻加入5 mL DMEM(加有10% FCS、0.5μg/mL放线菌酮)，培养72 h。用橡皮擦刮下感染的细胞，超声处理，让AR-39原体从细胞中释放出来(避免生热)，离心(2800 r/min，10 min)取上清(含AR-39原体)，再离心(9000 r/min，30 min)取沉淀(含AR-39原体)，将原体悬浮在SPG(sucrose phosphate glutamate medium)[3]中分装冻存或进一 步扩增。将部分原体重新感染HeLa-229细胞，培养72 h之后，经吉姆萨染色后 观察到衣原体包涵体，计数为107 IFUs/L。
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四、LDL的制备、氧化修饰及修饰程度鉴定[4]
(一)LDL的制备 人血浆LDL采用序列超速离心法制备。LDL在4℃、含0.1% EDTA的PBS中透析24 h，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，保存于4 ℃冰箱中。LDL经琼脂糖凝胶电泳鉴定为同一区带。用Lowry法测得LDL的蛋白质含量为1.78 mg/mL(本文中所列脂蛋白浓度均以蛋白为准)。
(二)LDL的氧化修饰 将新鲜的LDL置含10μmol/L Cu2+的PBS中，37℃透析12 h，然后在0.01% EDTA的PBS中透析24 h(4℃)，除菌保存。
(三)氧化低密度脂蛋白(OxLDL)修饰程度鉴定 修饰程度用脂蛋白所含LPO(lipid peroxide)含量来表示。用OxLDL中所含硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituric acid reactive substance，TBARS)的含量代表LPO的量。样品或丙二醛标准品0.1 mL加入到2.9 mL的混合液中(混合液含0.92 mol/L CCl3COOH，0.026 mol/L C4H4N2O2S，0.25 mol/L HCl)100℃水浴30 min，冷却后测530 nm波长处的OD值得TBARS含量。 LDL中LPO含量为每克胆固醇3～5μmol/L TBARS被定义为轻度修饰，超过此值，被视为氧化，成为OxLDL。本实验用序列超速离心法从正常人血清中分离LDL，呈淡黄色，TBARS值为1.4 μmol/g胆固醇，Cu2+(10μmol/L)氧化修饰过程中，其颜色由黄色向乳白色转化，氧化修饰12 min后，可达16.5μmol TBARS/g胆固醇，根据定义已成为OxLDL。
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五、巨噬细胞泡沫化
(一)巨噬细胞的收集和培养[5] 将10周龄的C57 BL/6J雄性小鼠处死后取腹腔巨噬细胞(调整细胞数为109/L)，接种到培养瓶中(内放盖玻片，便于形态学观察)，每瓶2 mL，在35℃、5% CO2培养箱中培养24 h，弃培养液，PBS冲洗掉未贴壁细胞组分，重复3次，然后分为6组培养72 h。
(二)巨噬细胞泡沫化方法 将上面所取巨噬细胞接种到培养瓶中，每瓶2 mL，在35℃、5%CO2培养箱中培养24 h，弃培养液，PBS冲洗掉未贴壁细胞组分，重复3次。然后加入10 mg/L OxLDL培养72 h，促成泡沫细胞。
1.形态观察 将预先放入培养瓶内的盖玻片取出，用PBS液冲洗两次，用2.5%戊二醛固定3 h，双蒸水冲洗，2.5%重铬酸钾处理16 h，双蒸水洗净，放入油红O中染色20 min，双蒸水冲洗，在氧化苏木精中衬染20 min，双蒸水冲洗，用丙酮脱水后，香柏油封片，显微镜下观察可以看到细胞质中有红色的脂质颗粒，用Kodak 100彩色照相。
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2.生化检测 用0.25%胰酶消化培养细胞1 min，离心(1000 r/min、10 min)后弃去上清；用PBS液2mL洗涤2次，再离心(1000 r/min、10 min)弃上清；加0.1 mol/L NaOH 100μL，异丙醇100μL，超声5 min后再离心(1000 r/min、10min)，取上清各50μL用试剂盒分别测总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离胆固醇(free cholesterol,FC)及胆固醇酯(cholesterol ester,CE)。沉淀物用来测细胞内蛋白质，采用Lowry法。胆固醇酯占总胆固醇的50%以上可视泡沫细胞[4]。
六、AR-39对巨噬细胞的感染及鉴定
将巨噬细胞培养24 h让其贴壁后，加入含30μg/mL DEAE-dextran的PBS溶液处理，后接种0.1 mL(108 IFUs/L)的AR-39储存液，培养72 h(具体方法见前面AR-39的培养)。鉴定采用PCR方法，检测培养72 h之后的巨噬细胞中含AR-39 DNA。
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(一)AR-39 DNA的提取 将上述培养72 h的巨噬细胞消化收集，在CQ 250超声波清洗器上震动10 s/次×3次，然后离心(2800 r/min、30 min)取上清，再离心(9000 r/min、30 min)，弃上清，沉淀用来提取DNA。
(二)引物设计与合成 根据文献[6]已知序列，上游引物为 5′CGTTGTTCATGAAGGCCTACT 3′(29～49 bp)；
下游引物为 5′CTGCATAACCTACGGTGTGTT 3′(448～468 bp)；
均由上海生物工程公司合成。
(三)PCR扩增 扩增条件为反应总体积100μL，其中含10×PCR缓冲液10μL，10 mmol的各种dNTP混合液1 μL，15 mmol MgCl2 10μL，模板1μL，3.5 u Taq酶，上游引物、下游引物各50 pmol，铺盖100μL矿物油，将管置PCR仪中。94℃预变性4 min后扩增，参数为：94℃、45 s→55℃、45 s→72℃、45 s，共30个循环。
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(四)2%琼脂糖凝胶电泳、照相。
七、统计处理
所有数据以
±s表示，采用t检验判定均数差异显著性。
结 果
一、AR-39成功感染巨噬细胞：
在各组细胞培养72 h之后将巨噬细胞消化、收集、破碎，分离纯化AR-39，提取DNA。经PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳后A2、B2、C2组在439 bp处显示出一特异性带，表示巨噬细胞内含AR-39的DNA，AR-39成功感染上这3组巨噬细胞，而A1、B1、C1组却未见相应的带(图1)。
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Fig 1 Agarose gel electrophoresis map of the PCR products.
lane 1：A2 ；lane 3：B2 ；lane 5：C2 ； lane 2：A1；
lane 4：B1 ；lane 6：C1 ; lane 7: pGEM-7zf (+) Hae Marker.
图1 PCR产物的电泳图谱
二、各组培养细胞的变化
(一)细胞的形态学改变 用油红O方法染色，镜下观察6组细胞具有不同的表现。A1组、A2组相近，油红O染色较淡，胞浆中见不到脂质颗粒。B1组也未见明显的脂质颗粒但油红O染色较深。B2、C1、C2组胞浆内红染颜色明显，都可见染成红色的脂质颗粒，成为巨噬细胞泡沫化特有的病理形态特征，这3组中尤以C2组形态特征最为明显 (图2，加见页Ⅱ)。
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(二)细胞内胆固醇含量改变 在6组细胞中，胆固醇酯占总胆固醇的百分比有差别，A1、A2、B1组该百分比未达到50%；而B2、C1、C2组都超过50%。统计分析A1与A2没有显著性差异，B1与B2有显著性差异，C1与C2有显著差异(表1)。而且6组细胞内总胆固醇含量有所不同，其中A1与A2比较接近，B2、C1、C2含量相似。后3组细胞内胆固醇含量比A1组大幅度增加，可达3倍左右。统计分析A1与A2没有显著差异，B1与B2有显著差异，C1与C2没有显著差异(表1)。
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表1 6组细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯
含量及胆固醇酯与总胆固醇的百分比
Tab 1 Contents of Intracellular Cholesterol and percentage of
intracellular cholesterol ester within total cholesterol(±s，n=10) Group
TC(mg/g
protein)
FC(mg/g
protein)
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CE(mg/g
protein)
CE/TC(%)
A1
21.4±4.0
18.7±3.7
2.7±0.9
12.6
A2
19.0±2.5
12.0±1.7
7.0±0.5
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36.8
B1
25.6±5.5
15.6±2.2
10.0±0.7
39.1
B2
67.2±4.1*
30.4±1.6
36.8±1.2
54.8*
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C1
70.4±3.6
31.0±1.3
37.4±0.9
53.1
C2
74.6±2.5
16.2±0.4
58.4±2.5
78.3#
*P<0.05, vs B1 group; # P<0.05, vs C1 group
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TC:total cholesterol; FC:free cholesterol; CE:cholesterol ester讨 论
As的发病机制虽经长期研究，但目前仍不完全清楚。其原因，除了As是一种多因素疾病和影响因素太多外，与As的病程长、病变定位在动脉，在人体内研究受到许多限制有关。为此，建立适宜的As动物模型和细胞模型以供深入研究显得特别重要。本实验室近年来成功建立了多种动物As模型和C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞模型及猪腹主动脉平滑肌细胞源性泡沫细胞模型，为As提供了较好的研究工具，本文采用C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞模型研究Cpn对As的影响。为解释As的发病机理，提出过许多假说，但都不能满意解释As的发生与发展。近年来感染因素在As中的作用引起了许多学者的关注，他们认为As是一种特殊的慢性炎症，As的发生和发展与人体内某些微生物反复持久的感染有关，这些微生物包括Cpn和巨细胞病毒等[7]，十多年来的研究结果表明Cpn的慢性感染与As的发生发展密切相关。
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现已公认，单核细胞迁入动脉内皮下间隙，形成单核细胞源性泡沫细胞是As病变中最早出现的细胞。单核细胞源性巨噬细胞吞噬OxLDL，细胞内脂质堆积。巨噬细胞内胆固醇酯的堆积与巨噬细胞释放细胞因子、生长因子、氧自由基等有关，OxLDL与巨噬细胞膜上清道夫受体(scavenger receptor，SR)结合，由于SR没有下行调节LDL的特性，使OxLDL和化学修饰LDL进入巨噬细胞的量增加，导致胆固醇酯在细胞中堆积，而成为泡沫细胞。
本实验室研究表明C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞与10mg/L LDL培养4 d与对照组相比，胞浆红染明显，细胞内总胆固醇及胆固醇酯含量均相应增高，表现出一定程度的泡沫化倾向，但是还不足以形成泡沫细胞；而C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞与10 mg/L OxLDL培养4 d能形成泡沫细胞[4]。本实验在此基础上，观察Cpn标准株AR-39对C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化的影响。结果发现；(1)10 mg/L LDL与106IFUs/L AR-39在35℃、5% CO2培养箱中共同作用于C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞72 h后，胞浆中出现红色的脂质颗粒，CE/TC大于50%，表明已形成泡沫细胞。(2)10 mg/L OxLDL+106IFUs/L AR-39与C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞共同培养72 h和单独用10 mg/L OxLDL与巨噬细胞培养72 h相比，两者都能形成泡沫细胞，但是前者胞浆内脂质颗粒增多，CE/TC更大，泡沫化程度更重。综上所述，Cpn能促进C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化，至于Cpn如何促进C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化，其机制尚不清楚，我们推测Cpn作为病原微生物作用于巨噬细胞，使其产生大量的自由基，自由基性质活泼容易导致培养液中LDL氧化，另外衣原体脂多糖可与LDL结合修饰脂蛋白，氧化LDL以及其它修饰LDL在体外都能导致巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。
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[参 考 文 献]
[1] Saikku P, Mattila K, Nieminen MS, et al. Serological evidence of an association of a novel chlamydia TWAR with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction [J]. Lancet, 1988,2: 983.
[2] 金俊飞, 杨永宗. 肺炎衣原体与动脉粥样硬化 [J]. 中国动脉硬化杂志, 1998, 6 (3): 275.
[3] Kuo CC, Wang SP, Wentwoeth BB, et al. Primary isolation of TRIC organisms in HeLa-229 cells treated with DEAE-dextran [J]. J Infect Dis, 1972, 125 (6): 665.
, 百拇医药
[4] 杨永宗, 谭健苗, 杨小毅. 动脉粥样硬化敏感小鼠C57 BL/6J腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立 [J]. 中国动脉硬化杂志, 1995, 3 (4): 279.
[5] Gaydos CA，Summersgill JT，Sahney NN，et al. Replication of chlamydia pneumoniae in vitro in human macrophages, endothelial cells, and aortic artery smooth muscle cells [J]. Infection and Immunity, 1996, 64(5):1614.
[6] Jackson LA，Campbell LA，Schmidt RA，et al. Specificity of detection of chlamydia pneumoniae in cardiovascular atheroma: evaluation of the innocent bystander hypothesis [J]. Am J Pathol ,1997, 150 (5):1785.
[7] Cook PJ, Lip GY. Infectious agents and atherosclerotic vascular disease [J]. Q J M, 1996, 89 (10) :727.
[收稿日期] 1999-01-08 [修回日期] 1999-07-19, http://www.100md.com
单位：金俊飞(南京铁道医学院病理生理教研室， 江苏 南京 210009)；杨永宗(衡阳医学院心血管病研究所，湖南 衡阳 421001)
关键词：衣原体，肺炎；巨噬细胞；泡沫细胞；动脉粥样硬化
中国病理生理杂志000815
[摘 要] 目的：探讨肺炎衣原体在C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化过程中的作用。方法：将肺炎衣原体与C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞培养72 h后用油红O方法染色观察细胞的形态变化并测定细胞内胆固醇的含量。结果：肺炎衣原体能使C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞胞浆内脂质颗粒增多，胆固醇酯占总胆固醇的比例增加。结论：肺炎衣原体能促进C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化
[中图分类号] R543 [文献标识码] A
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[文章编号]1000-4718(2000)08-0730-04
The role of chlamydia pneumoniae in the course of transformation
of C57 BL/6J mouse peritoneal macrophages into foam cells
YANG Yong-zong
(Institute of Cardiovascular Disease of Hengyang Medical College，Hengang 421001，China)
JIN Jun-fei
(Department of Pathophysiology, Nanjing railway Medical College, Nanjing 210009, China)
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[Abstract] AIM： In order to understand the role of chlamydia pneumoniae in the course of macrophages transformation into foam cells experiments with chlamydia pneumoniae standard strain AR-39 wese made. METHOD: C57 BL/6J Mouse peritoneal macrophages C57 BL/6J wese incubated 24 h, and they were divided into 6 groups to be incubated continually: A1～DMEM; A2～DMEM+106 IFUs/L AR-39; B1～DMEM+10 mg/L LDL; B2～DMEM+10 mg/L LDL+106 IFUs/L AR-39; C1～DMEM+10 mg/L OxLDL ;C2～DMEM+10 mg/L OxLDL+106 IFUs/L AR-39. 72 h later, morphological changes of the cells were observed and of intracellular cholesterol of content was detected. RESULTS: 1、Morphological studies: there were no lipid particles in A1，A2 and B1 groups, but the lipid particles could be found in B2、C1 and C2 group, Among six groups, the most lipid particles were seen in C2 groups. 2、Biochemical detection:The ratio of cholesterol ester to total cholesterol was much higher than 50% in B2、C1 and C2 groups, but was less than 50% in A1、A2 and B1 groups. CONCLUSION: Chlamydia pneumoniae may have played a role in promoting C57 BL/6J mouse peritoneal macrophages into foam cells.
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[MeSH] Chlamydia pneumoniae; Macrophages; Foam cells; Atherosclerosis
自1988年Saikku等[1]将肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae，Cpn)与 动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)联系起来后，大量的流行病学资料表明肺炎衣原体与动脉粥样硬化密切相关，实验动物、人尸检标本以及临床病人身上也存在二者密切相关的证据[2]。但是Cpn在As发生与发展中的确切作用有待于更进 一步深入地研究。泡沫细胞的出现是As斑块中有特征性的病理形态改变，本实验在As易感小鼠C57 BL/6J腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞模型上观察Cpn标准株 AR-39对C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化的影响，以探讨Cpn在As过程中的可能作用。
材 料 与 方 法
, 百拇医药 一、材料
AR-39：由加拿大Monitoba大学钟光明博士赠送。实验动物：C57 BL/6J，100只，雄性，10周龄，体重(25±2.7)g，购自中国医学科学院实验动物繁育场。戊二醛、达氏修正依代培养基(Dulbeccos modified Eagles med, DMEM)培养基、Taq酶、dNTP、琼脂糖为Sigma公司产品，其它试剂均为国产分析纯。
二、实验分组
取C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞培养24 h让其贴壁后分为6组培养：A1：DMEM；A2：DMEM+106 IFUs/L AR-39；B1：DMEM+10 mg/L低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL；B2：DMEM+10 mg/LLDL+106 IFUs/L AR-39；C1：DMEM+10 mg/L OxLDL(coxidized low density lipoprotein)；C2: DMEM+10 mg/L OxLDL+106 IFUs/L AR-39。在35℃、5% CO2条件下培养72 h后进行形态学观察和细胞内胆固醇的定量分析。
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三、AR-39的培养
选用12 cm2的培养瓶，内含DMEM(加有10% FCS，100 μg/mL链霉素，100μg/mL万古霉素)，每一瓶中接种1 mL的HeLa-229细胞悬浮液(内含2×105个HeLa-229细胞)，温育过夜形成融合的细胞单层。用DEAE-dextran处理[3]后加入0.1 mL(108 IFUs/L)的AR-39储存液，轻轻摇动培养瓶，以便储存液能完全覆盖细胞单层，将培养瓶放入35 ℃培养箱中，每隔15 min摇晃1次，至少温育2 h让其完全粘附，轻轻加入5 mL DMEM(加有10% FCS、0.5μg/mL放线菌酮)，培养72 h。用橡皮擦刮下感染的细胞，超声处理，让AR-39原体从细胞中释放出来(避免生热)，离心(2800 r/min，10 min)取上清(含AR-39原体)，再离心(9000 r/min，30 min)取沉淀(含AR-39原体)，将原体悬浮在SPG(sucrose phosphate glutamate medium)[3]中分装冻存或进一 步扩增。将部分原体重新感染HeLa-229细胞，培养72 h之后，经吉姆萨染色后 观察到衣原体包涵体，计数为107 IFUs/L。
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四、LDL的制备、氧化修饰及修饰程度鉴定[4]
(一)LDL的制备 人血浆LDL采用序列超速离心法制备。LDL在4℃、含0.1% EDTA的PBS中透析24 h，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，保存于4 ℃冰箱中。LDL经琼脂糖凝胶电泳鉴定为同一区带。用Lowry法测得LDL的蛋白质含量为1.78 mg/mL(本文中所列脂蛋白浓度均以蛋白为准)。
(二)LDL的氧化修饰 将新鲜的LDL置含10μmol/L Cu2+的PBS中，37℃透析12 h，然后在0.01% EDTA的PBS中透析24 h(4℃)，除菌保存。
(三)氧化低密度脂蛋白(OxLDL)修饰程度鉴定 修饰程度用脂蛋白所含LPO(lipid peroxide)含量来表示。用OxLDL中所含硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituric acid reactive substance，TBARS)的含量代表LPO的量。样品或丙二醛标准品0.1 mL加入到2.9 mL的混合液中(混合液含0.92 mol/L CCl3COOH，0.026 mol/L C4H4N2O2S，0.25 mol/L HCl)100℃水浴30 min，冷却后测530 nm波长处的OD值得TBARS含量。 LDL中LPO含量为每克胆固醇3～5μmol/L TBARS被定义为轻度修饰，超过此值，被视为氧化，成为OxLDL。本实验用序列超速离心法从正常人血清中分离LDL，呈淡黄色，TBARS值为1.4 μmol/g胆固醇，Cu2+(10μmol/L)氧化修饰过程中，其颜色由黄色向乳白色转化，氧化修饰12 min后，可达16.5μmol TBARS/g胆固醇，根据定义已成为OxLDL。
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五、巨噬细胞泡沫化
(一)巨噬细胞的收集和培养[5] 将10周龄的C57 BL/6J雄性小鼠处死后取腹腔巨噬细胞(调整细胞数为109/L)，接种到培养瓶中(内放盖玻片，便于形态学观察)，每瓶2 mL，在35℃、5% CO2培养箱中培养24 h，弃培养液，PBS冲洗掉未贴壁细胞组分，重复3次，然后分为6组培养72 h。
(二)巨噬细胞泡沫化方法 将上面所取巨噬细胞接种到培养瓶中，每瓶2 mL，在35℃、5%CO2培养箱中培养24 h，弃培养液，PBS冲洗掉未贴壁细胞组分，重复3次。然后加入10 mg/L OxLDL培养72 h，促成泡沫细胞。
1.形态观察 将预先放入培养瓶内的盖玻片取出，用PBS液冲洗两次，用2.5%戊二醛固定3 h，双蒸水冲洗，2.5%重铬酸钾处理16 h，双蒸水洗净，放入油红O中染色20 min，双蒸水冲洗，在氧化苏木精中衬染20 min，双蒸水冲洗，用丙酮脱水后，香柏油封片，显微镜下观察可以看到细胞质中有红色的脂质颗粒，用Kodak 100彩色照相。
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2.生化检测 用0.25%胰酶消化培养细胞1 min，离心(1000 r/min、10 min)后弃去上清；用PBS液2mL洗涤2次，再离心(1000 r/min、10 min)弃上清；加0.1 mol/L NaOH 100μL，异丙醇100μL，超声5 min后再离心(1000 r/min、10min)，取上清各50μL用试剂盒分别测总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离胆固醇(free cholesterol,FC)及胆固醇酯(cholesterol ester,CE)。沉淀物用来测细胞内蛋白质，采用Lowry法。胆固醇酯占总胆固醇的50%以上可视泡沫细胞[4]。
六、AR-39对巨噬细胞的感染及鉴定
将巨噬细胞培养24 h让其贴壁后，加入含30μg/mL DEAE-dextran的PBS溶液处理，后接种0.1 mL(108 IFUs/L)的AR-39储存液，培养72 h(具体方法见前面AR-39的培养)。鉴定采用PCR方法，检测培养72 h之后的巨噬细胞中含AR-39 DNA。
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(一)AR-39 DNA的提取 将上述培养72 h的巨噬细胞消化收集，在CQ 250超声波清洗器上震动10 s/次×3次，然后离心(2800 r/min、30 min)取上清，再离心(9000 r/min、30 min)，弃上清，沉淀用来提取DNA。
(二)引物设计与合成 根据文献[6]已知序列，上游引物为 5′CGTTGTTCATGAAGGCCTACT 3′(29～49 bp)；
下游引物为 5′CTGCATAACCTACGGTGTGTT 3′(448～468 bp)；
均由上海生物工程公司合成。
(三)PCR扩增 扩增条件为反应总体积100μL，其中含10×PCR缓冲液10μL，10 mmol的各种dNTP混合液1 μL，15 mmol MgCl2 10μL，模板1μL，3.5 u Taq酶，上游引物、下游引物各50 pmol，铺盖100μL矿物油，将管置PCR仪中。94℃预变性4 min后扩增，参数为：94℃、45 s→55℃、45 s→72℃、45 s，共30个循环。
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(四)2%琼脂糖凝胶电泳、照相。
七、统计处理
所有数据以
±s表示，采用t检验判定均数差异显著性。结 果
一、AR-39成功感染巨噬细胞：
在各组细胞培养72 h之后将巨噬细胞消化、收集、破碎，分离纯化AR-39，提取DNA。经PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳后A2、B2、C2组在439 bp处显示出一特异性带，表示巨噬细胞内含AR-39的DNA，AR-39成功感染上这3组巨噬细胞，而A1、B1、C1组却未见相应的带(图1)。
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Fig 1 Agarose gel electrophoresis map of the PCR products.
lane 1：A2 ；lane 3：B2 ；lane 5：C2 ； lane 2：A1；
lane 4：B1 ；lane 6：C1 ; lane 7: pGEM-7zf (+) Hae Marker.
图1 PCR产物的电泳图谱
二、各组培养细胞的变化
(一)细胞的形态学改变 用油红O方法染色，镜下观察6组细胞具有不同的表现。A1组、A2组相近，油红O染色较淡，胞浆中见不到脂质颗粒。B1组也未见明显的脂质颗粒但油红O染色较深。B2、C1、C2组胞浆内红染颜色明显，都可见染成红色的脂质颗粒，成为巨噬细胞泡沫化特有的病理形态特征，这3组中尤以C2组形态特征最为明显 (图2，加见页Ⅱ)。
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(二)细胞内胆固醇含量改变 在6组细胞中，胆固醇酯占总胆固醇的百分比有差别，A1、A2、B1组该百分比未达到50%；而B2、C1、C2组都超过50%。统计分析A1与A2没有显著性差异，B1与B2有显著性差异，C1与C2有显著差异(表1)。而且6组细胞内总胆固醇含量有所不同，其中A1与A2比较接近，B2、C1、C2含量相似。后3组细胞内胆固醇含量比A1组大幅度增加，可达3倍左右。统计分析A1与A2没有显著差异，B1与B2有显著差异，C1与C2没有显著差异(表1)。
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表1 6组细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯
含量及胆固醇酯与总胆固醇的百分比
Tab 1 Contents of Intracellular Cholesterol and percentage of
intracellular cholesterol ester within total cholesterol(
±s，n=10) GroupTC(mg/g
protein)
FC(mg/g
protein)
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CE(mg/g
protein)
CE/TC(%)
A1
21.4±4.0
18.7±3.7
2.7±0.9
12.6
A2
19.0±2.5
12.0±1.7
7.0±0.5
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36.8
B1
25.6±5.5
15.6±2.2
10.0±0.7
39.1
B2
67.2±4.1*
30.4±1.6
36.8±1.2
54.8*
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C1
70.4±3.6
31.0±1.3
37.4±0.9
53.1
C2
74.6±2.5
16.2±0.4
58.4±2.5
78.3#
*P<0.05, vs B1 group; # P<0.05, vs C1 group
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TC:total cholesterol; FC:free cholesterol; CE:cholesterol ester讨 论
As的发病机制虽经长期研究，但目前仍不完全清楚。其原因，除了As是一种多因素疾病和影响因素太多外，与As的病程长、病变定位在动脉，在人体内研究受到许多限制有关。为此，建立适宜的As动物模型和细胞模型以供深入研究显得特别重要。本实验室近年来成功建立了多种动物As模型和C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞模型及猪腹主动脉平滑肌细胞源性泡沫细胞模型，为As提供了较好的研究工具，本文采用C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞模型研究Cpn对As的影响。为解释As的发病机理，提出过许多假说，但都不能满意解释As的发生与发展。近年来感染因素在As中的作用引起了许多学者的关注，他们认为As是一种特殊的慢性炎症，As的发生和发展与人体内某些微生物反复持久的感染有关，这些微生物包括Cpn和巨细胞病毒等[7]，十多年来的研究结果表明Cpn的慢性感染与As的发生发展密切相关。
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现已公认，单核细胞迁入动脉内皮下间隙，形成单核细胞源性泡沫细胞是As病变中最早出现的细胞。单核细胞源性巨噬细胞吞噬OxLDL，细胞内脂质堆积。巨噬细胞内胆固醇酯的堆积与巨噬细胞释放细胞因子、生长因子、氧自由基等有关，OxLDL与巨噬细胞膜上清道夫受体(scavenger receptor，SR)结合，由于SR没有下行调节LDL的特性，使OxLDL和化学修饰LDL进入巨噬细胞的量增加，导致胆固醇酯在细胞中堆积，而成为泡沫细胞。
本实验室研究表明C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞与10mg/L LDL培养4 d与对照组相比，胞浆红染明显，细胞内总胆固醇及胆固醇酯含量均相应增高，表现出一定程度的泡沫化倾向，但是还不足以形成泡沫细胞；而C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞与10 mg/L OxLDL培养4 d能形成泡沫细胞[4]。本实验在此基础上，观察Cpn标准株AR-39对C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化的影响。结果发现；(1)10 mg/L LDL与106IFUs/L AR-39在35℃、5% CO2培养箱中共同作用于C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞72 h后，胞浆中出现红色的脂质颗粒，CE/TC大于50%，表明已形成泡沫细胞。(2)10 mg/L OxLDL+106IFUs/L AR-39与C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞共同培养72 h和单独用10 mg/L OxLDL与巨噬细胞培养72 h相比，两者都能形成泡沫细胞，但是前者胞浆内脂质颗粒增多，CE/TC更大，泡沫化程度更重。综上所述，Cpn能促进C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化，至于Cpn如何促进C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化，其机制尚不清楚，我们推测Cpn作为病原微生物作用于巨噬细胞，使其产生大量的自由基，自由基性质活泼容易导致培养液中LDL氧化，另外衣原体脂多糖可与LDL结合修饰脂蛋白，氧化LDL以及其它修饰LDL在体外都能导致巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。
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[参 考 文 献]
[1] Saikku P, Mattila K, Nieminen MS, et al. Serological evidence of an association of a novel chlamydia TWAR with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction [J]. Lancet, 1988,2: 983.
[2] 金俊飞, 杨永宗. 肺炎衣原体与动脉粥样硬化 [J]. 中国动脉硬化杂志, 1998, 6 (3): 275.
[3] Kuo CC, Wang SP, Wentwoeth BB, et al. Primary isolation of TRIC organisms in HeLa-229 cells treated with DEAE-dextran [J]. J Infect Dis, 1972, 125 (6): 665.
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[4] 杨永宗, 谭健苗, 杨小毅. 动脉粥样硬化敏感小鼠C57 BL/6J腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立 [J]. 中国动脉硬化杂志, 1995, 3 (4): 279.
[5] Gaydos CA，Summersgill JT，Sahney NN，et al. Replication of chlamydia pneumoniae in vitro in human macrophages, endothelial cells, and aortic artery smooth muscle cells [J]. Infection and Immunity, 1996, 64(5):1614.
[6] Jackson LA，Campbell LA，Schmidt RA，et al. Specificity of detection of chlamydia pneumoniae in cardiovascular atheroma: evaluation of the innocent bystander hypothesis [J]. Am J Pathol ,1997, 150 (5):1785.
[7] Cook PJ, Lip GY. Infectious agents and atherosclerotic vascular disease [J]. Q J M, 1996, 89 (10) :727.
[收稿日期] 1999-01-08 [修回日期] 1999-07-19, http://www.100md.com