牙髓牙本质复合体中VIP阳性神经纤维的研究
作者：姚江江 朱世柱 朱艺
单位：姚江江(南京大学医学院附属口腔医院， 江苏 南京 210008)；朱世柱 朱艺(湖北医科大学，湖北 武汉 430071)
关键词：牙髓；牙本质；神经纤维
中国病理生理杂志000913
[摘 要] 目的：研究血管活性肠肽(VIP)在牙髓牙本质复合体中的表达，探讨其功能。方法：收集人前磨牙，石蜡包埋切片，作免疫组织化学和图象定量分析。结果：VIP阳性神经纤维自根尖孔呈束状进入牙髓，至颈部扇形分开，在冠髓大量分支，部分围绕在血管周围，部分终止于牙髓基质，部分参与形成成牙本质细胞层下Raschkow神经丛，然后发出分支伸入成牙本质细胞层和前期牙本质，但不进入成熟牙本质。VIP阳性神经纤维在冠髓的积分光密度为12.74±1.807，体密度为0.0192±0.0127，线密度为0.0046±0.0029，在前期牙本质的积分光密度为13.07±1.927，线段长度为(19.60±8.597) mm。结论：VIP阳性神经纤维存在于人牙髓牙本质复合体，部分纤维围绕血管，部分纤维止于牙髓基质和前期牙本质，这种分布提示该纤维除与血管运动有关外，可能还与感觉有关，在痛觉传导、血管调节等方面发挥重要作用。
, 百拇医药
[中图分类号] Q425； R781.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0821-03
Study on VIP-immunoreactive nerve fibers in dental pulp-
dentine complex of human premolar
YAO Jiang-jiang
(Affiliated Atomatological Hospital, Medical College of Nanjing University, Nanjing 210008， China)
ZHU Shi-zhu，ZHU Yi
, 百拇医药
(Hubei Medical University, Wuhan 430071, China)
[Abstract] AIM: To study the expression of vasoactive intestinal polypeptide(VIP) in dental pulp-dentine complex of human premolar and its function. METHODS: Human premolars were collected and embedded in paraffin and cut into slices.The slices were treated by immunohistochemistry reaction and the image analysis. RESULTS: VIP-immunoreactive nerve fibers were expressed from apical foramina to the central pulp as bunchy line，and became fan-shaped at the cervical line，more branches in the coronal pulp.Some branches surrounded blood vessels，some branches terminated in the pulp matrix，the others passed Raschkow nerve plexus and run forward the odontoblastic layer and the predentine，but not went into dentine.The integral optical density of VIP immunoreacitve fibers in coronal pulp was 12.74±1.807，the volume density was 0.0192±0.0127，the length density is 0.0046±0.0029，the integral optical density in predentine is 13.07±1.927，the line length is (19.60±8.597) mm.CONCLUSION: VIP-immunoreactive nerve fibers existed in human dental-pulp dentine complex.Some fibers surrounded blood vessels，some terminated in pulp matrix and predentine.These findings suggested that VIP-immunoreacitve nerve fibers might relate to sense as well as vasoaction，and play an important role in nociception conduction，regulation of the blood flow and so on.
, http://www.100md.com
[MeSH] Dental pulp; Dentine; Nerve fibers
血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)阳性神经纤维于70年代早期被发现并于1974年被确定，它是由28个氨基酸残基组成的多肽，有关它的研究一直进展缓慢，其来源、性质尚不清楚，一般认为属副交感神经纤维。过去一直认为VIP的功能只与血管舒张有关，如今越来越多的研究发现它具有多种生物活性，可能还与感觉传导有关[1]。VIP阳性神经纤维是否存在于牙髓牙本质复合体中目前还有争论[2，3]。研究VIP阳性神经纤维是否分布在牙髓牙本质复合体中以及如何分布，不仅有助于对牙病表现的认识，同时也可为牙病的治疗开拓新的思路。因此拟对牙髓牙本质复合体VIP阳性神经纤维进行免疫组织化学与图象定量分析研究。
材 料 和 方 法
收集正畸拔除的新鲜健康完整的人前磨牙共80颗，年龄15～30岁，无疾病和龋病史，牙周情况良好。拔下后立即用生理盐水冲洗，涡轮机截去根尖1/3，立即投入4%新鲜配制的多聚甲醛固定液，4℃下过夜，甲酸-甲酸钠4℃下脱钙，常规石蜡包埋，切片厚5 μm。
, http://www.100md.com
链菌素亲生物素过氧化物酶(strepavidin-peroxidase, SP)法免疫组织化学：切片经二甲苯脱腊入水，复合酶(博士德公司提供)消化，过氧化氢、正常羊血清封闭，然后滴加兔抗VIP血清(1∶1000，Sigma公司)37 ℃孵育3 h，滴加生物素化羊抗兔IgG血清(美国Matrix公司)，37℃孵育20 min，再用链霉菌-生物素-过氧化物酶复合物(美国Matrix公司)37℃孵育20 min，以上每个步骤之后均用0.01 mol/L PBS洗5次，每次5 min，最后用DAB室温下显色，适时终止反应，苏木精复染，自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，OLYMPUS显微镜下观察并照相，对照片用PBS代替兔抗VIP血清，染色程序同上。阴性结果为浅黄色或无色，阳性结果为棕黄色。
图象定量分析：将免疫组织化学切片输入图像分析仪，用MPIAS-500多媒体彩色病理图像分析系统，分别在1.9693 μm像数点长，1.080415×106 μm2测量窗下、0.199 μm像数点长，1.109×104 μm2测量窗下进行牙髓、前期牙本质内VIP阳性神经纤维的积分光密度、体密度、线密度、线段长度的图象定量分析。
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结 果
根部：VIP阳性神经纤维呈束状伴随血管经根尖孔进入根部牙髓，平行于牙体长轴，行走于牙髓中央，较少发出分支(图1，见加页Ⅰ)。分支一般行向牙髓周边区，并进入前期牙本质，不到成熟牙本质。
颈部：VIP阳性神经束在此处呈扇形散开，伸向冠髓(图2，见加页Ⅰ)。
冠部：VIP阳性神经纤维在冠髓大量分支，从中央区向周边区分支由粗变细，逐渐致密，彼此吻合成网状，有的分支围绕在血管周围，有的分支与血管无关，散在于基质中(图3，见加页Ⅰ)。还有部分伸向周边区，经多细胞层到达乏细胞层，在成牙本质细胞层下反复分支参与Raschkow神经丛的构成，神经丛再发出分支伸入成牙本质细胞层，部分终止于成牙本质细胞之间，部分穿过成牙本质细胞之间伸向前期牙本质。有些纤维到达前期牙本质-成熟牙本质界，但不进入成熟牙本质。在前期牙本质VIP阳性神经纤维有的横行，有的纵行，有的斜行，有的还发出侧支与相邻纤维相吻合(图4，见加页Ⅰ)。有些在前期牙本质内横向走行。
, 百拇医药
对照片未见阳性着色。
图象分析的定量分析结果见表1。
Fig1 VIP -immunoreactive nerve bundle in the dental pulp(sp×33)
图1根部VIP 阳性神经束
Fig2 VIP -immunoreactive nere bundle scattered in teh cervical lin e(SP×16.5)
图2颈部VIP 阳性神经束开始分散
Fig 3 The relationship of VIP-immunoreactive nerve fibers adn vessels (SP×132)
, 百拇医药
图3VIP 阳性神经纤维与血管的关系
Fig4 The distribution of VIP-immunoreactive nerve fibers in odontoblastic layer adn
predentine (S×132)
图4造牙本质细胞层和前期牙本质内VIP 阳性神经纤维的分布
表1 冠部牙髓牙本质复合体VIP阳性神经纤维的积分光密度、线密度、体密度、线段长度值
Tab 1 The integral optical density, volume density , length density and line length of VIP immunoreactive nerve fibres in coronal dental pulp-dentine complex(
±s. n=80)
, http://www.100md.com
Integral optical density
Volume density
Length density
Line length(mm)
Coronal dental pulp
12.74±1.807
0.0192±0.0127
0.0046±0.0029
—
Coronal predentine
, 百拇医药 13.07±1.927
—
—
19.60±8.597
讨 论
VIP阳性神经纤维是否存在于牙髓牙本质复合体中以及在牙内的分布目前尚无定论。Wakisaka等在猫牙中，Luthman等在人牙中均发现了该纤维[2，4]，而Kerezoudis等在鼠牙中没有见到[3]。Fristad等1998年研究结果表明，鼠牙髓中没有VIP阳性神经纤维，仅根尖处有少许纤维[5]。本实验在人牙髓牙本质复合体中见到了该神经纤维。VIP阳性神经纤维出不出现于牙髓牙本质复合体是否与样品种属有关还有待于进一步研究。在分布范围上，Wakisaka等报道在猫牙髓的成牙本质细胞层未发现VIP 阳性神经纤维[2]，而Luthman等发现该纤维存在于Raschkow神经丛并穿入成牙本质细胞层[4]。本实验发现VIP阳性神经纤维不仅到达成牙本质细胞层还伸入到前期牙本质。这些结果的不同可能有以下几个原因：一是种属差异：Wakisaka等用的是猫牙，Luthman等研究的是人牙，不同种属牙内VIP阳性神经纤维含量可能不同。二是取材部位的不同：Luthman等的样品仅限于牙髓，而本实验的样品不仅包括牙髓，还包括牙本质。
, 百拇医药
VIP阳性神经纤维与血管的密切关系诸多学者看法一致。发现许多纤维围绕在血管周围[2，4]。本实验也观察到了这种现象，提示VIP可能参与了牙髓血流的调控，在牙髓生理及炎症过程中发挥着重要作用。VIP能使血管扩张，牙髓血流量增加，同时可抑制交感神经的缩血管作用[6]，但其扩血管机制目前还不清楚。
关于VIP阳性神经纤维的来源目前还有争议。以前的研究结果认为属副交感神经来源。但Lazarov等用VIP免疫组织化学方法研究发现猫的三叉神经节中有VIP阳性神经元[7]，Wakisaka等研究发现VIP与P物质(substance P,SP)可共存于同一神经纤维中，且血管周围VIP阳性的纤维SP也阳性[2]，这意味着可能有部分VIP阳性神经纤维来源于三叉神经节。本结果表明，VIP阳性反应不仅出现于血管周围，还出现于血管之外的其它牙髓基质和前期牙本质中，这种分布提示VIP阳性神经纤维不仅与血管运动有关，还可能与感觉有关，有可能通过轴突反射参与牙的生理及炎症过程。副交感神经是否存在于牙内一直没有定论，证实VIP阳性神经纤维的存在将有助于该问题的探讨。
, 百拇医药
Tel:025-7714636
[参 考 文 献]
[1] 卢金活.血管活性肠多肽能神经元[M].见：朱长庚主编.神经免疫细胞化学.第1版. 北京：科学出版社，1990.148-154.
[2] Wakisaka S，Ichikawa H，Nishikawa S，et al.Immunohistochenical observation on the correlation between substance P and vasoactive intestinal polypeptide-like immunoreactivities in the feline dental pulp[J].Archs Oral Biol，1987，32：449-453.
[3] Kerezondis NP，Fried K，Olgart L.Haemodynamic and immunohistochemical studies of rat incisor pulp after denervation and subsequent reinnervation[J].Archs Oral Biol，1995，40：815-823.
, http://www.100md.com
[4] Luthman J，Luthman D，Hokfelt T.Occurrence and distribution of different neurochemical markers in the human dental pulp[J].Archs Oral Biol，1992，37：193-208.
[5] Fristad I，Jacobsen EB，Kvinnsland IH.Coexpression of vasoactive intestinal polypeptide and substance P in reinnervating pulpal nerves and in trigeminal ganglion neurones after axotomy of the inferior alveolar nerve in the rat[J].Archs Oral Biol，1998，43：183-189.
[6] Lundberg JM，Hokfelt T.Coexistence of peptides and classical neurotransmit ters[J].Trends Neurosci，1983，6：325-333.
[7] Lazarov N.Primary trigeminal afferent neuron of the cat Ⅱ[J].J Brain Res，1994，35：373-389.
[收稿日期] 1999-07-22 [修回日期] 1999-11-24, http://www.100md.com
单位：姚江江(南京大学医学院附属口腔医院， 江苏 南京 210008)；朱世柱 朱艺(湖北医科大学，湖北 武汉 430071)
关键词：牙髓；牙本质；神经纤维
中国病理生理杂志000913
[摘 要] 目的：研究血管活性肠肽(VIP)在牙髓牙本质复合体中的表达，探讨其功能。方法：收集人前磨牙，石蜡包埋切片，作免疫组织化学和图象定量分析。结果：VIP阳性神经纤维自根尖孔呈束状进入牙髓，至颈部扇形分开，在冠髓大量分支，部分围绕在血管周围，部分终止于牙髓基质，部分参与形成成牙本质细胞层下Raschkow神经丛，然后发出分支伸入成牙本质细胞层和前期牙本质，但不进入成熟牙本质。VIP阳性神经纤维在冠髓的积分光密度为12.74±1.807，体密度为0.0192±0.0127，线密度为0.0046±0.0029，在前期牙本质的积分光密度为13.07±1.927，线段长度为(19.60±8.597) mm。结论：VIP阳性神经纤维存在于人牙髓牙本质复合体，部分纤维围绕血管，部分纤维止于牙髓基质和前期牙本质，这种分布提示该纤维除与血管运动有关外，可能还与感觉有关，在痛觉传导、血管调节等方面发挥重要作用。
, 百拇医药
[中图分类号] Q425； R781.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0821-03
Study on VIP-immunoreactive nerve fibers in dental pulp-
dentine complex of human premolar
YAO Jiang-jiang
(Affiliated Atomatological Hospital, Medical College of Nanjing University, Nanjing 210008， China)
ZHU Shi-zhu，ZHU Yi
, 百拇医药
(Hubei Medical University, Wuhan 430071, China)
[Abstract] AIM: To study the expression of vasoactive intestinal polypeptide(VIP) in dental pulp-dentine complex of human premolar and its function. METHODS: Human premolars were collected and embedded in paraffin and cut into slices.The slices were treated by immunohistochemistry reaction and the image analysis. RESULTS: VIP-immunoreactive nerve fibers were expressed from apical foramina to the central pulp as bunchy line，and became fan-shaped at the cervical line，more branches in the coronal pulp.Some branches surrounded blood vessels，some branches terminated in the pulp matrix，the others passed Raschkow nerve plexus and run forward the odontoblastic layer and the predentine，but not went into dentine.The integral optical density of VIP immunoreacitve fibers in coronal pulp was 12.74±1.807，the volume density was 0.0192±0.0127，the length density is 0.0046±0.0029，the integral optical density in predentine is 13.07±1.927，the line length is (19.60±8.597) mm.CONCLUSION: VIP-immunoreactive nerve fibers existed in human dental-pulp dentine complex.Some fibers surrounded blood vessels，some terminated in pulp matrix and predentine.These findings suggested that VIP-immunoreacitve nerve fibers might relate to sense as well as vasoaction，and play an important role in nociception conduction，regulation of the blood flow and so on.
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[MeSH] Dental pulp; Dentine; Nerve fibers
血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)阳性神经纤维于70年代早期被发现并于1974年被确定，它是由28个氨基酸残基组成的多肽，有关它的研究一直进展缓慢，其来源、性质尚不清楚，一般认为属副交感神经纤维。过去一直认为VIP的功能只与血管舒张有关，如今越来越多的研究发现它具有多种生物活性，可能还与感觉传导有关[1]。VIP阳性神经纤维是否存在于牙髓牙本质复合体中目前还有争论[2，3]。研究VIP阳性神经纤维是否分布在牙髓牙本质复合体中以及如何分布，不仅有助于对牙病表现的认识，同时也可为牙病的治疗开拓新的思路。因此拟对牙髓牙本质复合体VIP阳性神经纤维进行免疫组织化学与图象定量分析研究。
材 料 和 方 法
收集正畸拔除的新鲜健康完整的人前磨牙共80颗，年龄15～30岁，无疾病和龋病史，牙周情况良好。拔下后立即用生理盐水冲洗，涡轮机截去根尖1/3，立即投入4%新鲜配制的多聚甲醛固定液，4℃下过夜，甲酸-甲酸钠4℃下脱钙，常规石蜡包埋，切片厚5 μm。
, http://www.100md.com
链菌素亲生物素过氧化物酶(strepavidin-peroxidase, SP)法免疫组织化学：切片经二甲苯脱腊入水，复合酶(博士德公司提供)消化，过氧化氢、正常羊血清封闭，然后滴加兔抗VIP血清(1∶1000，Sigma公司)37 ℃孵育3 h，滴加生物素化羊抗兔IgG血清(美国Matrix公司)，37℃孵育20 min，再用链霉菌-生物素-过氧化物酶复合物(美国Matrix公司)37℃孵育20 min，以上每个步骤之后均用0.01 mol/L PBS洗5次，每次5 min，最后用DAB室温下显色，适时终止反应，苏木精复染，自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，OLYMPUS显微镜下观察并照相，对照片用PBS代替兔抗VIP血清，染色程序同上。阴性结果为浅黄色或无色，阳性结果为棕黄色。
图象定量分析：将免疫组织化学切片输入图像分析仪，用MPIAS-500多媒体彩色病理图像分析系统，分别在1.9693 μm像数点长，1.080415×106 μm2测量窗下、0.199 μm像数点长，1.109×104 μm2测量窗下进行牙髓、前期牙本质内VIP阳性神经纤维的积分光密度、体密度、线密度、线段长度的图象定量分析。
, http://www.100md.com
结 果
根部：VIP阳性神经纤维呈束状伴随血管经根尖孔进入根部牙髓，平行于牙体长轴，行走于牙髓中央，较少发出分支(图1，见加页Ⅰ)。分支一般行向牙髓周边区，并进入前期牙本质，不到成熟牙本质。
颈部：VIP阳性神经束在此处呈扇形散开，伸向冠髓(图2，见加页Ⅰ)。
冠部：VIP阳性神经纤维在冠髓大量分支，从中央区向周边区分支由粗变细，逐渐致密，彼此吻合成网状，有的分支围绕在血管周围，有的分支与血管无关，散在于基质中(图3，见加页Ⅰ)。还有部分伸向周边区，经多细胞层到达乏细胞层，在成牙本质细胞层下反复分支参与Raschkow神经丛的构成，神经丛再发出分支伸入成牙本质细胞层，部分终止于成牙本质细胞之间，部分穿过成牙本质细胞之间伸向前期牙本质。有些纤维到达前期牙本质-成熟牙本质界，但不进入成熟牙本质。在前期牙本质VIP阳性神经纤维有的横行，有的纵行，有的斜行，有的还发出侧支与相邻纤维相吻合(图4，见加页Ⅰ)。有些在前期牙本质内横向走行。
, 百拇医药
对照片未见阳性着色。
图象分析的定量分析结果见表1。
Fig1 VIP -immunoreactive nerve bundle in the dental pulp(sp×33)
图1根部VIP 阳性神经束
Fig2 VIP -immunoreactive nere bundle scattered in teh cervical lin e(SP×16.5)
图2颈部VIP 阳性神经束开始分散
Fig 3 The relationship of VIP-immunoreactive nerve fibers adn vessels (SP×132)
, 百拇医药
图3VIP 阳性神经纤维与血管的关系
Fig4 The distribution of VIP-immunoreactive nerve fibers in odontoblastic layer adn
predentine (S×132)
图4造牙本质细胞层和前期牙本质内VIP 阳性神经纤维的分布
表1 冠部牙髓牙本质复合体VIP阳性神经纤维的积分光密度、线密度、体密度、线段长度值
Tab 1 The integral optical density, volume density , length density and line length of VIP immunoreactive nerve fibres in coronal dental pulp-dentine complex(
±s. n=80), http://www.100md.com
Integral optical density
Volume density
Length density
Line length(mm)
Coronal dental pulp
12.74±1.807
0.0192±0.0127
0.0046±0.0029
—
Coronal predentine
, 百拇医药 13.07±1.927
—
—
19.60±8.597
讨 论
VIP阳性神经纤维是否存在于牙髓牙本质复合体中以及在牙内的分布目前尚无定论。Wakisaka等在猫牙中，Luthman等在人牙中均发现了该纤维[2，4]，而Kerezoudis等在鼠牙中没有见到[3]。Fristad等1998年研究结果表明，鼠牙髓中没有VIP阳性神经纤维，仅根尖处有少许纤维[5]。本实验在人牙髓牙本质复合体中见到了该神经纤维。VIP阳性神经纤维出不出现于牙髓牙本质复合体是否与样品种属有关还有待于进一步研究。在分布范围上，Wakisaka等报道在猫牙髓的成牙本质细胞层未发现VIP 阳性神经纤维[2]，而Luthman等发现该纤维存在于Raschkow神经丛并穿入成牙本质细胞层[4]。本实验发现VIP阳性神经纤维不仅到达成牙本质细胞层还伸入到前期牙本质。这些结果的不同可能有以下几个原因：一是种属差异：Wakisaka等用的是猫牙，Luthman等研究的是人牙，不同种属牙内VIP阳性神经纤维含量可能不同。二是取材部位的不同：Luthman等的样品仅限于牙髓，而本实验的样品不仅包括牙髓，还包括牙本质。
, 百拇医药
VIP阳性神经纤维与血管的密切关系诸多学者看法一致。发现许多纤维围绕在血管周围[2，4]。本实验也观察到了这种现象，提示VIP可能参与了牙髓血流的调控，在牙髓生理及炎症过程中发挥着重要作用。VIP能使血管扩张，牙髓血流量增加，同时可抑制交感神经的缩血管作用[6]，但其扩血管机制目前还不清楚。
关于VIP阳性神经纤维的来源目前还有争议。以前的研究结果认为属副交感神经来源。但Lazarov等用VIP免疫组织化学方法研究发现猫的三叉神经节中有VIP阳性神经元[7]，Wakisaka等研究发现VIP与P物质(substance P,SP)可共存于同一神经纤维中，且血管周围VIP阳性的纤维SP也阳性[2]，这意味着可能有部分VIP阳性神经纤维来源于三叉神经节。本结果表明，VIP阳性反应不仅出现于血管周围，还出现于血管之外的其它牙髓基质和前期牙本质中，这种分布提示VIP阳性神经纤维不仅与血管运动有关，还可能与感觉有关，有可能通过轴突反射参与牙的生理及炎症过程。副交感神经是否存在于牙内一直没有定论，证实VIP阳性神经纤维的存在将有助于该问题的探讨。
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[参 考 文 献]
[1] 卢金活.血管活性肠多肽能神经元[M].见：朱长庚主编.神经免疫细胞化学.第1版. 北京：科学出版社，1990.148-154.
[2] Wakisaka S，Ichikawa H，Nishikawa S，et al.Immunohistochenical observation on the correlation between substance P and vasoactive intestinal polypeptide-like immunoreactivities in the feline dental pulp[J].Archs Oral Biol，1987，32：449-453.
[3] Kerezondis NP，Fried K，Olgart L.Haemodynamic and immunohistochemical studies of rat incisor pulp after denervation and subsequent reinnervation[J].Archs Oral Biol，1995，40：815-823.
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[4] Luthman J，Luthman D，Hokfelt T.Occurrence and distribution of different neurochemical markers in the human dental pulp[J].Archs Oral Biol，1992，37：193-208.
[5] Fristad I，Jacobsen EB，Kvinnsland IH.Coexpression of vasoactive intestinal polypeptide and substance P in reinnervating pulpal nerves and in trigeminal ganglion neurones after axotomy of the inferior alveolar nerve in the rat[J].Archs Oral Biol，1998，43：183-189.
[6] Lundberg JM，Hokfelt T.Coexistence of peptides and classical neurotransmit ters[J].Trends Neurosci，1983，6：325-333.
[7] Lazarov N.Primary trigeminal afferent neuron of the cat Ⅱ[J].J Brain Res，1994，35：373-389.
[收稿日期] 1999-07-22 [修回日期] 1999-11-24, http://www.100md.com