细胞周期调控蛋白p21WAF1在腹膜间皮细胞肥大中的作用
作者：杨琼琼 叶任高 余学清 许韩师 阳晓 孔庆瑜
单位：(中山医科大学附属第一医院肾内科， 广东 广州 510080)
关键词：腹膜透析；肥大；细胞周期；蛋白质类；葡萄糖
中国病理生理杂志000905
[摘 要] 目的：观察p21WAF1在高糖作用下腹膜间皮细胞肥大中的作用。方法：用RT-PCR和Western Blot法测定在高浓度葡萄糖(含糖为1.38%、3.86%)作用24 h后体外培养的大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1水平；用流式细胞仪分析细胞周期分布。结果：高糖作用24 h后大鼠腹膜间皮细胞大多出现细胞肥大和停滞于细胞周期的G1期，以含糖3.86%组明显。p21WAF1 mRNA和蛋白随着糖浓度增高表达增高(含糖组间P<0.05)。在和含糖组相同渗透压的甘露醇组和无血清常规培养基几乎无p21WAF1 mRNA和蛋白的表达。结论：p21WAF1可能在高糖作用下间皮细胞的肥大及G1期阻滞中起重要的调节作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R692.5； R329.2+4； Q253 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0788-04
Effect of cell cycle regulator p21WAF1 on hypertrophy
of peritoneal mesothelial cells
YANG Qiong-qiong, YE Ren-gao, YU Xue-qing, XU Han-shi, YANG Xiao, KONG Qing-yu
(Department of Nephrology, 1st Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080, China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM: To investigate the effect of cell cycle regulator p231WAF1 on hypertrophy of peritoneal mesothelial cells affected by high concentrated glucose. METHODS: RT-PCR and Western Blot method were used to detect p21WAF1 expression of rat peritoneal mesothelial cells in high glucose concentration medium (containing 1.86%, 3.86% glucose) after 24 hours. Flow cytometer technique was used to analyze the cell cycle distribution. RESULTS: In high glucose medium, most of the cells became hypertrophy, and were arrested in G1 phase of the cell cycle, which was obvious in 3.86% glucose group. Glucose increased p21WAF1 mRNA and protein expression in a dose-dependent manner, and the levels of p21WAF1 mRNA and protein in 3.86% glucose group were higher than those in 1.38% glucose group (P<0.05). p21WAF1 mRNA and protein expression were absent in the serum-free normal medium and D-mannitol groups which had the same osmolarity as the glucose groups. CONCLUSION: p21WAF1 may be pivotal in the hypertrophy and arrest in the G1 phase of mesothelial cells induced by high concentrated glucose.
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[MeSH] Peritoneal dialysis; Hypertrophy; Cell cycle; Proteins; Glucose
腹膜间皮细胞是构成腹膜的重要的细胞群体，它在保持腹膜结构的完整性和功能的有效性中起重要作用。许多体内外研究和临床研究都发现腹膜长期暴露于含糖(1.5%-4.25%)透析液中间皮细胞会出现细胞肥大的现象[1-3]。近期研究发现肥大的间皮细胞可能是间皮细胞早期衰老的表现[2，3]，并可能最终导致腹膜间皮细胞凋亡、腹膜间皮层缺失，使得腹膜对感染和纤维化的防御功能受损，导致腹膜纤维化及功能进行性丧失。但是目前关于腹膜间皮细胞肥大的机制仍未明。近期研究发现细胞周期抑制蛋白p21WAF1的过度表达与细胞的肥大有关[4-7]。是否腹膜间皮细胞的肥大与p21WAF1有关，至今尚未有报道。本文应用RT-PCR和Western Blot方法，观察高糖对体外培养的大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1表达的影响，旨在从细胞周期角度探讨有关腹膜间皮细胞肥大的分子机制。
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材 料 和 方 法
一、大鼠腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定
大鼠腹膜间皮细胞的培养按Hjelle等[8]建立的方法操作。融合后间皮细胞呈铺路石样，传代后用抗大鼠cytokeritin、抗大鼠vimentin和抗Ⅷ因子相关抗原的单克隆抗体(美国Dako公司)用免疫组化方法(采用SP试剂盒，北京中山公司)鉴定细胞，结果抗cytokeritin和抗vimentin抗原阳性，抗Ⅷ因子相关抗原阴性。
二、高糖对间皮细胞形态及细胞周期的影响
将大鼠腹膜间皮细胞消化后制成细胞悬液接种于6孔培养板中，每孔107，37℃孵育24 h后加入无血清培养基，同步化培养24 h后分别加入含不同的高浓度葡萄糖(1.38%，3.86%)的培养基培养24 h。每个浓度组设一个与高糖组相同渗透压的甘露醇组(浓度约为1.38%，3.86%)为对照组，另设常规的无血清培养基为空白对照组。培养结束后先在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。PBS冲洗后用0.125%胰蛋白酶轻消化，离心弃上清，PBS洗后70%乙醇4℃固定过夜。次日用PBS洗脱乙醇，制成单细胞悬液。PI染色后用流式细胞仪(美国Coulter公司)分析，并以相对细胞数为Y轴，相对的DNA量为X轴作一曲线。细胞周期G1期的细胞数百分比从图中通过电脑分析得出。
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三、间皮细胞RNA提取及RT-PCR方法检测p21WAF1 mRNA表达
107腹膜间皮细胞在不同条件培养基培养24 h(条件同上述)后，用胰酶消化细胞并收集于无RNA酶的1.5 mL离心管中。用RNeasy Mini Kit(美国基因公司)一步法提取细胞总RNA。用紫外分光光度计测定总RNA的纯离和浓度，重复3次。样品OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0之间。以血管紧张素Ⅱ刺激24 h后的肾小管上皮细胞为阳性对照[7]。第一链cDNA合成采用THERMOSCIPTTM逆转录试剂盒(美国Gibco BRL)，按试剂盒说明进行。PCR扩增：取反转录后所得的cDNA模板2 μL，依次加入10×PCR缓冲液5 μL、2.5 nmol/L dNTP混合物5 μL、10 μmol/L上游及下游引物各1 μL和Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)2 μL，总反应体积为50 μL。PCR反应所需的变性，退火和延伸温度为94℃、61℃、72℃，反应时间45 s、 45 s、 1 min，共循环30次。反应完成后，取15 μL反应液在2%琼脂糖凝胶(含0.2 mg/L EB)电泳分析。电泳完毕后在紫外灯下用凝胶成像系统成像及分析，三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)为内参照，计算每一样本的p21WAF1/GAPDH PCR扩增产物的相对比值。
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引物设计和合成
p21WAF1(301bp)[9]
上游引物 AGTATGCCGTCGTCTGTTCG
下游引物 GAGTGCAAGACAGCGACAAG
GAPDH(230bp)
上游引物 ACCACAGTCCATGAAATCAC
下游引物 AGGTTTCTCCAGGCGGCATG
四、Western blot法检测p21WAF1蛋白表达
107腹膜间皮细胞在不同条件培养基培养24 h(条件同上述)后，用细胞裂解液(62.5 mmol/L Tris-HCl(pH6.8, 25℃)，2% W/V SDS， 10% glycerol, 50 mmol/L DTT)提取蛋白。蛋白浓度的测定采用Bradford法。取总蛋白50 μg(用细胞裂解液将各样本调至5 g/L)，100℃煮沸5 min, 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离蛋白。电泳结束后，将蛋白转印到PVDF膜(Boehringer Mannheim)。转膜结束后，用5% TBST封闭60 min，加入稀释好的Ⅰ抗(Rabbit polyclonal anti-p21 Ab: Santa Cruz Cat No: Sc-756工作浓度1∶200)，室温振荡60 min， 1×TBST 40 mL洗6-8次×5 min。此后按luml-lightplus免疫印迹发光试剂盒(Cat No: 2015218, Boehninger Mannheim)说明书操作，X光片在IBAS2.5图像分析系统进行光密度分析。
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五、统计学处理
结果以均数±标准差(
±s)表示，两组之间差异的显著性以F检验和Q检验作统计学处理。
结 果
一、高糖对大鼠腹膜间皮细胞细胞周期数及形态的影响
在倒置显微镜下可观察到大鼠腹膜间皮细胞在高糖的培养条件出现两种明显的形态学改变，首先是细胞肥大，胞核与胞浆成比例，核仁明显，呈“牛眼”征；其二是可见许多细胞的胞核增多，细胞分裂停止(见图1，见加页Ⅰ)。以上改变在含糖浓度为3.86%组中更为明显。而在甘露醇组仅有轻度细胞肥大。
流式细胞仪分析细胞周期分布(见表1)，可发现在含糖1.38%和3.86%组G1期细胞比例明显高于对照组(P<0.05)，但含糖组间无显著差异。含甘露醇1.38%、3.86%组G1期细胞比例与对照组相比无显著差异。
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ig.1 The morphology change of rat mesothelial cells cultured n teh 3.86%glucose
medium for 24 h (B)
A:normalrat mesothelial cells (HM×100)
图1含 糖浓度为3.86%组大鼠腹膜间皮细胞培养24小时后的形态改变(B);(A)为正常对照组大鼠腹
膜间皮细胞
表1 不同培养条件下腹膜间皮细胞G1期细胞比例
Tab 1 Percentage of G1 phase of peritoneal mesothelial cells
, 百拇医药
in the different culture medium (±s ) Concentration
3.86%
1.38%
Control
62.7%±3.4%
Glucose
81.5%±2.3%*
73.1%±3.5%*
Mannitol
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68.5%±7.3%
64.6%±5.5%
*P<0.05 vs the control groups.
三、高糖对大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1表达的影响
由图2和图3可见，在空白对照组间皮细胞几乎无p21WAF1 mRNA和蛋白的表达，但在高糖培养基培养24 h后可见p21WAF1表达增高，其中在含糖3.86%组显著高于含糖1.38%组(P<0.05)(p21WAF1/GAPDH PCR扩增产物的相对比值分别为0.5±0.07，0.36±0.04；p21WAF1蛋白表达量分别为4.2±0.3，5.3±0.5)。而在甘露醇组几乎无p21WAF1 mRNA和蛋白的表达。
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Fig 2 Measurement of the gene expression of p21WAF1 by RT-PCR.±s. n=3.
1-1.38% glucose; 2-3.86% glucose; 3-blank control; 4-positive control; 5-1.38% mannitol; 6-3.86% mannitol; A-p21WAF1； B-GAPDH.
图2 RT-PCR方法检测p21WAF1的基因表达
Fig 3 Western blot for p21WAF1 protein.±s. n=3.
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1-1.38% glucose; 2-3.86% glucose; 3-1.38% mannitol; 4-3.86% mannitol; 5-blank control.
图3 Western blot法检测p21WAF1蛋白表达
讨 论
腹膜纤维化而致的腹膜功能衰竭是腹膜透析发展长期受限的主要原因。在正常环境下每个间皮细胞都经历了生长、再生或分化和衰老的过程。在腹透中间皮细胞长期暴露于含糖浓度高于正常体液15-40倍的高糖(1.5%-4.25%)环境中。在以上的实验中我们发现腹膜间皮细胞持续暴露于高糖环境中会出现细胞肥大、胞核增多、细胞分裂停滞等现象，这和国外其他学者报道的一致[1-3]。Gotloib等[2]近期提出肥大的间皮细胞可能由含糖透析液对细胞周期的影响所致。我们进一步用流式细胞仪分析间皮细胞的细胞周期时，发现在高糖培养基培养下大多肥大的间皮细胞都停滞于细胞周期的G1期。这一作用随着葡萄糖浓度的增高而明显，而与渗透压的关系不大。因此我们可认为肥大的间皮细胞可能代表夭折了的细胞周期，即细胞进入细胞周期的G1期，开始了蛋白的合成，但不能进入细胞周期的S期，细胞周期停滞于G1期。
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近来许多研究都发现细胞周期调控抑制蛋白p21WAF1的过度表达与细胞肥大、细胞周期的G1期停滞有关[4-7]。我们用RT-PCR法和Western Blot检测不同浓度葡萄糖对p21WAF1 mRNA和蛋白表达的影响，结果发现间皮细胞在空白对照组和甘露醇组几乎无p21WAF1 mRNA和蛋白的表达，而高糖可刺激间皮细胞p21WAF1 mRNA和蛋白的表达，且随着含糖浓度增高而表达增高。这初步提示高糖可刺激间皮细胞p21WAF1表达，而这一作用与葡萄糖的浓度有关，而与葡萄糖产生的渗透压关系不大。也就是说，p21WAF1可能在高糖作用下间皮细胞的肥大及G1期阻滞中起重要的调节作用。
近期研究发现间皮细胞形态大小可能与腹膜转运功能有关，肥大的间皮细胞多见于腹膜高通透性的患者[3]。另外本文研究结果初步提示透析液中高糖作用下间皮细胞的肥大可能与细胞周期的调控失衡而导致的细胞增殖能力减低有关，这样可能导致间皮细胞再生迟缓，并可能进一步影响腹膜的功能。然而肥大的间皮细胞与腹膜功能之间的关系如何，这仍有待进一步研究。
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[基金项目] 卫生部临床重点攻关项目基金资助(No. 97040228)
Tel: 020-83798174； E-mail: Ygg@ihw.com.cn
[参 考 文 献]
[1] Gotloib L, Wajsbrot V, Shostak A, et al. Acute and long-term changes observed in imprints of mouse mesothelium exposed to glucose-enriched, lactated, buffered dialysis solutions[J]. Nephron, 1995, 70(4): 466-477.
[2] Gotloib L, Shostak A, Wajsbist V, et al. High glucose induced a hypertrophic, senescent mesothelial cell phenotype after long in vivo exposure[J]. Nephron, 1999, 82(2): 164-173.
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[3] Yamamoto T, Izumotani T, Otoshi T, et al. Morphological studies of mesothelial cells in CAPD effluent and their clinical significance[J]. Am J Kid Dis, 1998, 32(6): 946-952.
[4] Shankland SJ. Cell-cycle control and renal disease[J]. Kid Int, 1997, 52(2): 294-308.
[5] Sheikh MS, Rochefort H, Gracia M, et al. Overexpression of p21WAF1/cip1 induces growth arrest, grant cell formation and apotosis in human breast carcinoma cell lines[J]. Oncogene, 1995, 11(9): 1899-1905.
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[6] Kuan CJ, A1-Douahh M, Shankland S. The cyclin kinase inhibitor p21Waf1, cip1 is increased in experimental diabetic nephropathy: potential role in glomerular hypertrophy[J]. J Am Soc Nephrol, 1998, 9(8): 986-993.
[7] Terada Y, Yanada T, Nakashima O, et al. Angiotension-Ⅱ induced p21cip1 via JAK2-STAT1 pathway and caused hypertrophy in proximal tubular cells[J]. J Am Soc Nephrol, 1996, 7(10): 1776(Abstract).
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[8] Thomas JH, Barbara TG, Dianne CW, et al. Isolation and propagation in vitro of peritoneal mesothelial cells[J]. Peri Dial Int, 1989, 9(4): 301-305.
[9] Sugiyama A, Nagaki M, Shidoji Y, et al. Regulator of cell cycle-related genes in rat hepatocytes by transforming groweth factor β1[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 238(4): 539-543.
[收稿日期] 2000-01-03 [修回日期] 2000-05-16, 百拇医药
单位：(中山医科大学附属第一医院肾内科， 广东 广州 510080)
关键词：腹膜透析；肥大；细胞周期；蛋白质类；葡萄糖
中国病理生理杂志000905
[摘 要] 目的：观察p21WAF1在高糖作用下腹膜间皮细胞肥大中的作用。方法：用RT-PCR和Western Blot法测定在高浓度葡萄糖(含糖为1.38%、3.86%)作用24 h后体外培养的大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1水平；用流式细胞仪分析细胞周期分布。结果：高糖作用24 h后大鼠腹膜间皮细胞大多出现细胞肥大和停滞于细胞周期的G1期，以含糖3.86%组明显。p21WAF1 mRNA和蛋白随着糖浓度增高表达增高(含糖组间P<0.05)。在和含糖组相同渗透压的甘露醇组和无血清常规培养基几乎无p21WAF1 mRNA和蛋白的表达。结论：p21WAF1可能在高糖作用下间皮细胞的肥大及G1期阻滞中起重要的调节作用。
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[中图分类号] R692.5； R329.2+4； Q253 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0788-04
Effect of cell cycle regulator p21WAF1 on hypertrophy
of peritoneal mesothelial cells
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(Department of Nephrology, 1st Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080, China)
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[Abstract] AIM: To investigate the effect of cell cycle regulator p231WAF1 on hypertrophy of peritoneal mesothelial cells affected by high concentrated glucose. METHODS: RT-PCR and Western Blot method were used to detect p21WAF1 expression of rat peritoneal mesothelial cells in high glucose concentration medium (containing 1.86%, 3.86% glucose) after 24 hours. Flow cytometer technique was used to analyze the cell cycle distribution. RESULTS: In high glucose medium, most of the cells became hypertrophy, and were arrested in G1 phase of the cell cycle, which was obvious in 3.86% glucose group. Glucose increased p21WAF1 mRNA and protein expression in a dose-dependent manner, and the levels of p21WAF1 mRNA and protein in 3.86% glucose group were higher than those in 1.38% glucose group (P<0.05). p21WAF1 mRNA and protein expression were absent in the serum-free normal medium and D-mannitol groups which had the same osmolarity as the glucose groups. CONCLUSION: p21WAF1 may be pivotal in the hypertrophy and arrest in the G1 phase of mesothelial cells induced by high concentrated glucose.
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[MeSH] Peritoneal dialysis; Hypertrophy; Cell cycle; Proteins; Glucose
腹膜间皮细胞是构成腹膜的重要的细胞群体，它在保持腹膜结构的完整性和功能的有效性中起重要作用。许多体内外研究和临床研究都发现腹膜长期暴露于含糖(1.5%-4.25%)透析液中间皮细胞会出现细胞肥大的现象[1-3]。近期研究发现肥大的间皮细胞可能是间皮细胞早期衰老的表现[2，3]，并可能最终导致腹膜间皮细胞凋亡、腹膜间皮层缺失，使得腹膜对感染和纤维化的防御功能受损，导致腹膜纤维化及功能进行性丧失。但是目前关于腹膜间皮细胞肥大的机制仍未明。近期研究发现细胞周期抑制蛋白p21WAF1的过度表达与细胞的肥大有关[4-7]。是否腹膜间皮细胞的肥大与p21WAF1有关，至今尚未有报道。本文应用RT-PCR和Western Blot方法，观察高糖对体外培养的大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1表达的影响，旨在从细胞周期角度探讨有关腹膜间皮细胞肥大的分子机制。
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材 料 和 方 法
一、大鼠腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定
大鼠腹膜间皮细胞的培养按Hjelle等[8]建立的方法操作。融合后间皮细胞呈铺路石样，传代后用抗大鼠cytokeritin、抗大鼠vimentin和抗Ⅷ因子相关抗原的单克隆抗体(美国Dako公司)用免疫组化方法(采用SP试剂盒，北京中山公司)鉴定细胞，结果抗cytokeritin和抗vimentin抗原阳性，抗Ⅷ因子相关抗原阴性。
二、高糖对间皮细胞形态及细胞周期的影响
将大鼠腹膜间皮细胞消化后制成细胞悬液接种于6孔培养板中，每孔107，37℃孵育24 h后加入无血清培养基，同步化培养24 h后分别加入含不同的高浓度葡萄糖(1.38%，3.86%)的培养基培养24 h。每个浓度组设一个与高糖组相同渗透压的甘露醇组(浓度约为1.38%，3.86%)为对照组，另设常规的无血清培养基为空白对照组。培养结束后先在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。PBS冲洗后用0.125%胰蛋白酶轻消化，离心弃上清，PBS洗后70%乙醇4℃固定过夜。次日用PBS洗脱乙醇，制成单细胞悬液。PI染色后用流式细胞仪(美国Coulter公司)分析，并以相对细胞数为Y轴，相对的DNA量为X轴作一曲线。细胞周期G1期的细胞数百分比从图中通过电脑分析得出。
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三、间皮细胞RNA提取及RT-PCR方法检测p21WAF1 mRNA表达
107腹膜间皮细胞在不同条件培养基培养24 h(条件同上述)后，用胰酶消化细胞并收集于无RNA酶的1.5 mL离心管中。用RNeasy Mini Kit(美国基因公司)一步法提取细胞总RNA。用紫外分光光度计测定总RNA的纯离和浓度，重复3次。样品OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0之间。以血管紧张素Ⅱ刺激24 h后的肾小管上皮细胞为阳性对照[7]。第一链cDNA合成采用THERMOSCIPTTM逆转录试剂盒(美国Gibco BRL)，按试剂盒说明进行。PCR扩增：取反转录后所得的cDNA模板2 μL，依次加入10×PCR缓冲液5 μL、2.5 nmol/L dNTP混合物5 μL、10 μmol/L上游及下游引物各1 μL和Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)2 μL，总反应体积为50 μL。PCR反应所需的变性，退火和延伸温度为94℃、61℃、72℃，反应时间45 s、 45 s、 1 min，共循环30次。反应完成后，取15 μL反应液在2%琼脂糖凝胶(含0.2 mg/L EB)电泳分析。电泳完毕后在紫外灯下用凝胶成像系统成像及分析，三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)为内参照，计算每一样本的p21WAF1/GAPDH PCR扩增产物的相对比值。
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引物设计和合成
p21WAF1(301bp)[9]
上游引物 AGTATGCCGTCGTCTGTTCG
下游引物 GAGTGCAAGACAGCGACAAG
GAPDH(230bp)
上游引物 ACCACAGTCCATGAAATCAC
下游引物 AGGTTTCTCCAGGCGGCATG
四、Western blot法检测p21WAF1蛋白表达
107腹膜间皮细胞在不同条件培养基培养24 h(条件同上述)后，用细胞裂解液(62.5 mmol/L Tris-HCl(pH6.8, 25℃)，2% W/V SDS， 10% glycerol, 50 mmol/L DTT)提取蛋白。蛋白浓度的测定采用Bradford法。取总蛋白50 μg(用细胞裂解液将各样本调至5 g/L)，100℃煮沸5 min, 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离蛋白。电泳结束后，将蛋白转印到PVDF膜(Boehringer Mannheim)。转膜结束后，用5% TBST封闭60 min，加入稀释好的Ⅰ抗(Rabbit polyclonal anti-p21 Ab: Santa Cruz Cat No: Sc-756工作浓度1∶200)，室温振荡60 min， 1×TBST 40 mL洗6-8次×5 min。此后按luml-lightplus免疫印迹发光试剂盒(Cat No: 2015218, Boehninger Mannheim)说明书操作，X光片在IBAS2.5图像分析系统进行光密度分析。
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结果以均数±标准差(
±s)表示，两组之间差异的显著性以F检验和Q检验作统计学处理。结 果
一、高糖对大鼠腹膜间皮细胞细胞周期数及形态的影响
在倒置显微镜下可观察到大鼠腹膜间皮细胞在高糖的培养条件出现两种明显的形态学改变，首先是细胞肥大，胞核与胞浆成比例，核仁明显，呈“牛眼”征；其二是可见许多细胞的胞核增多，细胞分裂停止(见图1，见加页Ⅰ)。以上改变在含糖浓度为3.86%组中更为明显。而在甘露醇组仅有轻度细胞肥大。
流式细胞仪分析细胞周期分布(见表1)，可发现在含糖1.38%和3.86%组G1期细胞比例明显高于对照组(P<0.05)，但含糖组间无显著差异。含甘露醇1.38%、3.86%组G1期细胞比例与对照组相比无显著差异。
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ig.1 The morphology change of rat mesothelial cells cultured n teh 3.86%glucose
medium for 24 h (B)
A:normalrat mesothelial cells (HM×100)
图1含 糖浓度为3.86%组大鼠腹膜间皮细胞培养24小时后的形态改变(B);(A)为正常对照组大鼠腹
膜间皮细胞
表1 不同培养条件下腹膜间皮细胞G1期细胞比例
Tab 1 Percentage of G1 phase of peritoneal mesothelial cells
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in the different culture medium (
±s ) Concentration3.86%
1.38%
Control
62.7%±3.4%
Glucose
81.5%±2.3%*
73.1%±3.5%*
Mannitol
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68.5%±7.3%
64.6%±5.5%
*P<0.05 vs the control groups.
三、高糖对大鼠腹膜间皮细胞p21WAF1表达的影响
由图2和图3可见，在空白对照组间皮细胞几乎无p21WAF1 mRNA和蛋白的表达，但在高糖培养基培养24 h后可见p21WAF1表达增高，其中在含糖3.86%组显著高于含糖1.38%组(P<0.05)(p21WAF1/GAPDH PCR扩增产物的相对比值分别为0.5±0.07，0.36±0.04；p21WAF1蛋白表达量分别为4.2±0.3，5.3±0.5)。而在甘露醇组几乎无p21WAF1 mRNA和蛋白的表达。
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Fig 2 Measurement of the gene expression of p21WAF1 by RT-PCR.
±s. n=3.1-1.38% glucose; 2-3.86% glucose; 3-blank control; 4-positive control; 5-1.38% mannitol; 6-3.86% mannitol; A-p21WAF1； B-GAPDH.
图2 RT-PCR方法检测p21WAF1的基因表达
Fig 3 Western blot for p21WAF1 protein.
±s. n=3., 百拇医药
1-1.38% glucose; 2-3.86% glucose; 3-1.38% mannitol; 4-3.86% mannitol; 5-blank control.
图3 Western blot法检测p21WAF1蛋白表达
讨 论
腹膜纤维化而致的腹膜功能衰竭是腹膜透析发展长期受限的主要原因。在正常环境下每个间皮细胞都经历了生长、再生或分化和衰老的过程。在腹透中间皮细胞长期暴露于含糖浓度高于正常体液15-40倍的高糖(1.5%-4.25%)环境中。在以上的实验中我们发现腹膜间皮细胞持续暴露于高糖环境中会出现细胞肥大、胞核增多、细胞分裂停滞等现象，这和国外其他学者报道的一致[1-3]。Gotloib等[2]近期提出肥大的间皮细胞可能由含糖透析液对细胞周期的影响所致。我们进一步用流式细胞仪分析间皮细胞的细胞周期时，发现在高糖培养基培养下大多肥大的间皮细胞都停滞于细胞周期的G1期。这一作用随着葡萄糖浓度的增高而明显，而与渗透压的关系不大。因此我们可认为肥大的间皮细胞可能代表夭折了的细胞周期，即细胞进入细胞周期的G1期，开始了蛋白的合成，但不能进入细胞周期的S期，细胞周期停滞于G1期。
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近来许多研究都发现细胞周期调控抑制蛋白p21WAF1的过度表达与细胞肥大、细胞周期的G1期停滞有关[4-7]。我们用RT-PCR法和Western Blot检测不同浓度葡萄糖对p21WAF1 mRNA和蛋白表达的影响，结果发现间皮细胞在空白对照组和甘露醇组几乎无p21WAF1 mRNA和蛋白的表达，而高糖可刺激间皮细胞p21WAF1 mRNA和蛋白的表达，且随着含糖浓度增高而表达增高。这初步提示高糖可刺激间皮细胞p21WAF1表达，而这一作用与葡萄糖的浓度有关，而与葡萄糖产生的渗透压关系不大。也就是说，p21WAF1可能在高糖作用下间皮细胞的肥大及G1期阻滞中起重要的调节作用。
近期研究发现间皮细胞形态大小可能与腹膜转运功能有关，肥大的间皮细胞多见于腹膜高通透性的患者[3]。另外本文研究结果初步提示透析液中高糖作用下间皮细胞的肥大可能与细胞周期的调控失衡而导致的细胞增殖能力减低有关，这样可能导致间皮细胞再生迟缓，并可能进一步影响腹膜的功能。然而肥大的间皮细胞与腹膜功能之间的关系如何，这仍有待进一步研究。
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[基金项目] 卫生部临床重点攻关项目基金资助(No. 97040228)
Tel: 020-83798174； E-mail: Ygg@ihw.com.cn
[参 考 文 献]
[1] Gotloib L, Wajsbrot V, Shostak A, et al. Acute and long-term changes observed in imprints of mouse mesothelium exposed to glucose-enriched, lactated, buffered dialysis solutions[J]. Nephron, 1995, 70(4): 466-477.
[2] Gotloib L, Shostak A, Wajsbist V, et al. High glucose induced a hypertrophic, senescent mesothelial cell phenotype after long in vivo exposure[J]. Nephron, 1999, 82(2): 164-173.
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[3] Yamamoto T, Izumotani T, Otoshi T, et al. Morphological studies of mesothelial cells in CAPD effluent and their clinical significance[J]. Am J Kid Dis, 1998, 32(6): 946-952.
[4] Shankland SJ. Cell-cycle control and renal disease[J]. Kid Int, 1997, 52(2): 294-308.
[5] Sheikh MS, Rochefort H, Gracia M, et al. Overexpression of p21WAF1/cip1 induces growth arrest, grant cell formation and apotosis in human breast carcinoma cell lines[J]. Oncogene, 1995, 11(9): 1899-1905.
, 百拇医药
[6] Kuan CJ, A1-Douahh M, Shankland S. The cyclin kinase inhibitor p21Waf1, cip1 is increased in experimental diabetic nephropathy: potential role in glomerular hypertrophy[J]. J Am Soc Nephrol, 1998, 9(8): 986-993.
[7] Terada Y, Yanada T, Nakashima O, et al. Angiotension-Ⅱ induced p21cip1 via JAK2-STAT1 pathway and caused hypertrophy in proximal tubular cells[J]. J Am Soc Nephrol, 1996, 7(10): 1776(Abstract).
, http://www.100md.com
[8] Thomas JH, Barbara TG, Dianne CW, et al. Isolation and propagation in vitro of peritoneal mesothelial cells[J]. Peri Dial Int, 1989, 9(4): 301-305.
[9] Sugiyama A, Nagaki M, Shidoji Y, et al. Regulator of cell cycle-related genes in rat hepatocytes by transforming groweth factor β1[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 238(4): 539-543.
[收稿日期] 2000-01-03 [修回日期] 2000-05-16, 百拇医药