p51基因在鼻咽癌组织中表达的研究
作者：李虹 张玲 姚开泰
单位：(湖南医科大学肿瘤研究所卫生部重点实验室， 湖南 长沙 410078)
关键词：鼻咽肿瘤；基因，P53；基因表达
中国病理生理杂志000901 [摘 要] 目的： 研究p51基因的两个转录本p51A和p51B在鼻咽癌及对照组织中的表达谱，为进一步探讨p51在鼻咽癌癌变过程中的作用打下初步基础。方法： (1)用PCR-SSCP银染技术检测21例鼻咽癌组织及配对外周血标本p53基因的突变。(2) 用RT-PCR检测p51A和p51B在鼻咽癌及对照组织中的表达。结果： (1)21例鼻咽癌组织及配对外周血标本p53基因未发现突变。(2) 在鼻咽癌及对照组织中，p51B的mRNA表达要高于p51A。(3)p51A和 p51B mRNA在鼻咽癌组织中的表达高于对照组织。结论： (1) p51A和p51B mRNA在鼻咽癌中的表达高于对照组织。(2)p51A和 p51B mRNA表达的改变与p53基因的突变无关。 [主题词] 鼻咽肿瘤；基因，P53；基因表达
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[中图分类号] Q344.13 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0769-06
The expression of p51A and p51B gene in nasopharyngeal carcinoma
LI Hong, ZHANG Ling, YAO Kai-tai
(Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha, Hunan 410078， China)
[Abstract] AIM： To investigate the expression map of two transcripts, p51A and p51B of p51 gene in nasopharyngeal carcinoma (NPC). METHODS： p53 gene mutation of 21 NPC tissue and blood are analyzed by PCR-SSCP silver stain technique. The expression of p51A and p51B mRNA in NPC tissue and control group are tested by RT-PCR.RESULTS: No gene mutation of p53 is discovered on exon 5-8. p51B mRNA shows higher expression than p51A. The expression of p51B and p51A mRNA on NPC tissue is much higher than that in control group. CONCLUSION： There are differential expression of p51A and p51B mRNA between NPC tissue and control group. The alteration expression of p51A and p51B show no relationship with p53 gene mutation.
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[MeSH] Nasopharyngeal neoplasms; Genes, P53;Gene expression
越来越多的实验证实，肿瘤是一种细胞周期病[1]，是由于一种或多种细胞周期因子调节失控所造成。肿瘤抑制基因在正常情况下可抑制肿瘤的发生和发展[2]。这种抑制功能的丧失是肿瘤形成的必要条件。p53基因属广谱的肿瘤抑制基因，在体内各种组织广泛表达。其翻译产物是多功能转录调节因子，可在细胞周期调控、DNA修复、细胞凋亡的启动及细胞分化的调节等多个途径发挥重要的门控(gatekeeper)作用。在人类肿瘤已发现的p53基因的点突变至少有3500种[ 3,4](错义突变、无义突变、无声突变和移码突变)。在非小细胞肺癌中，p53基因的点突变频率甚至可达到40%-60%[ 5]，提示组织的恶性转化与p53基因的突变密切相关。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方高发的一种上皮性恶性肿瘤。目前研究表明，鼻咽癌的p53的突变频率很低，小于10%[ 6]，而且出现了p53累积的现象。
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在体内，许多重要的基因均以基因家族的形式发挥作用，p53也不例外。 新近发现，p53基因家族有两个新成员。p73基因定位在染色体1p36[ 7]，主要在神经组织内表达，在甲状腺、胰腺、心肌、肝脏、骨骼肌内也可检测到[ 8]；p51基因定位在染色体3q28[ 9]，是一候选的肿瘤抑制基因。p51基因有两个转录本，p51A和p51B，在多种上皮性组织如鼠的皮肤、内耳、食道上皮有高表达[10,11]；人的胰腺、心肌、膀胱、骨骼肌、甲状腺也有表达[ 8]。目前发现的有限的点突变也发生在上皮来源的组织[ 5]。在人的鼻咽上皮，p51A、p51B是否有表达，在该部位发生恶性转变前后，其表达谱是否有改变则未见报道。本文用竞争性RT-PCR的方法，检测正常成人鼻咽上皮、鼻咽癌组织的p51A和p51B的表达水平，试图解释鼻咽癌组织内鼻咽癌p53累积的现象，同时为进一步阐明p51基因在鼻咽癌发病机制中的作用奠定基础。
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材 料 和 方 法
一、材料
(一)15例鼻咽癌活检标本及配对外周血样品，6例正常对照活检标本及配对外周血样品均来自于湖南省肿瘤医院头颈科门诊室，鼻咽癌患者均为未接受放射治疗的门诊病人，其活检标本经鉴定均为低分化鳞癌。
(二)PCR引物由大连宝生物公司合成。Taq DNA聚合酶为华美公司产品。CNE-2由我所细胞中心提供，该细胞p53基因位于第8外显子上第280密码子存在G→C的突变。
二、 方法
(一) RNA 、DNA的抽提 用Trizol试剂盒抽提活检组织标本。水相用异丙醇沉淀RNA，酚相按说明书抽提DNA。外周血标本按常规方法抽提DNA。并对抽提DNA及RNA进行纯度及浓度鉴定。
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(二)PCR扩增 根据p53 gDNA序列，选取p53外显子中的突变热点区5-8外显子，设计相应的引物如下：
在50 μL反应体系内，含1X反应缓冲液，1 μg 基因组DNA，25 μmol/L上游及下游引物，dNTP 200 μmol/L，2.5 u Taq酶。95℃，5 min热变性后的循环参数为94℃，45 s；58℃，45 s； 72℃，45 s，共35个循环，最后一个循环的延伸时间为10 min。1.2%琼脂糖75 V电泳20 min检测，上样量10 μL。阴性对照用水代替模板DNA。 位点
引物序列
产物
外显子
5
CTGTCTCCTTCCTCTTCCTACAGT
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282
bp
GCAATCAGTGAGGAATCAGAGG
外显子
6
CCTCTGATTCCTCACTGATTGC
157
bp
CAGTTGCAAACCAGACCTCAG
外显子
7
GGCCTGTGTTATCTCCTAGGTTG
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131
bp
ACCTGGAGTCTTCCAGTGTGAT
外显子
8
AGTGGTAATCTACTGGGACGGAAC
151
bp
CTGCTTGCTTACCTCGCTTAGT
(三)SSCP分析 5 μL PCR产物与5 μL甲酰胺变性上样缓冲液(95%甲酰胺；20 mmol/L EDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青)混合后，100℃变性10 min后，迅速置冰上10 min。以含或不含5% 甘油的12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(49∶1)为支持介质，室温下65V电泳分离10 h。用10%乙醇，1%硝酸分别处理后，银染至DNA区带清晰止。干燥保存。以CNE-2细胞DNA经PCR扩增后p53的8外显子片段为阳性对照。
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(四)RT-PCR分析 RNA 样品用DNase处理，去除残余的DNA。按Promega说明书进行逆转录反应，42℃，保温60 min后，继续在37℃，反应30 min，然后68℃变性20 min。以NPC及正常对照的cDNA为模板，确定平台期及两者PCR差异最大的循环数。25 μL反应体系内，含1X反应缓冲液，2 μL cDNA，20 pmol上游 及下游引物，dNTP 200 nmol/L，2.5U Taq酶。95℃，5 min预变性后的循环参数为94℃，50 s；56℃，50 s； 72℃，50 s，循环数根据平台期结果决定。最后一个循环的延伸时间为10 min。10 μL PCR产物1.2%琼脂糖(含EB)75V电泳20 min 检测。结果于紫外灯下摄影保存，并进行区带的灰度分析。 引物序列分别为：
p53：5'-ACCTGGAGTCTTCCAGTGTGAT3',5'AGTCACAGCACATGACGGAG-3'；p51A: 5'ATTCCTGAAGCAGGCTGAAA3', 5'GAAAGCAGCAAGTTTCGGAC-3';p51B: 5'GCTTATCAACCCTCAGCAGC3', 5'ATGATGAACAGCCCAACCTC3'。产物片段分别为289 bp、396 bp和242 bp，内对照为GAPDH(580 bp)。
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(五)Southern 杂交 将标本p51A和p51B经RT-PCR扩增后，产物琼脂糖电泳分离。毛细管转移至尼龙膜，UV交联固定。预杂交8 h后，与32P标记的探针杂交16 h，常规洗膜，压片，-80℃放射自显影48 h。探针序列为： GGGCCGTGAGACTT ATGAAA(p51A)；TACAACCATTCCTGATGGCA(p51B)。用末端转移酶标记。结 果
一、 鼻咽癌p53基因突变的分析
21例鼻咽癌组织及配对外周血标本经PCR-SSCP检测，在p53基因的第5-8外显子未见异常泳动带，双链DNA泳动位置与待扩增片段的理论长度一致。而在相同条件下，外显子8的阳性对照CNE-2的PCR扩增片段电泳带型则显示异常。说明用PCR-SSCP技术，在待检测标本gDNA，未检测到p53基因的突变(图1)。
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Fig 1 p53 gene mutation by PCR-SSCP.
lane l-8:p53 exon 8 PCR products of 4 tissues and blood;
lane 9:positive control; lane 10: 100 bp DNA ladder.
图1 PCR-SSCP鉴定p53基因突变
Fig 2 Identification of RNA purity.
图2 RNA 纯度鉴定
二、 p53基因表达的RT-PCR分析
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15例鼻咽癌组织活检标本及6 例正常对照的RNA经DNase处理后，1%琼脂糖电泳检测，5S、18S和25S rRNA 3条区带清晰可见，满足RT-PCP分析的要求(图2)。平台期确定26个循环时，p53即可达到较强的扩增；30个循环时，p53基因的扩增达到平台期。选择26个循环作为扩增循环数，尽可能体现不同标本间的表达差异。1.2%琼脂糖电泳检测PCR产物，在紫外灯下观测并摄影(图3)。结果经BANDLEADER(3.0) 软件分析，鼻咽癌组织活检标本的p53基因表达强度与细胞管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达强度之比为0.82，而实验对照组的两基因表达强度之比为0.76，两者无显著差异。说明p53基因表达在RNA水平没有改变。
三、 p51基因转录本p51A和p51B表达的RT-PCR分析
相同组织标本确定32个循环时，p51A和p51B cDNA扩增达到平台期。而在30个循环时，所选的一对鼻咽癌组织活检标本及正常对照的p51AcDNA出现了差异表达。因而选择30个循环作为扩增循环数。1.2%琼脂糖电泳检测PCR产物，在紫外灯下观测并摄影(图4、5)。结果经BANDLEADER(3.0) 软件分析，鼻咽癌组织活检标本的 p51A mRNA表达强度与GAPDH基因的表达强度之比为0.28，而实验对照组的两基因表达强度之比为 0.10，两者差异显著。说明p51A mRNA 表达在两组有显著改变。相同条件下，p51B mRNA表达强度与 GAPDH基因的表达强度之比为0.63，而实验对照组的两基因表达强度之比为0.44，两者有显著差异。说明 在p51A mRNA表达发生改变的同时，p51基因的另一种转录本p51B mRNA在癌变组织和正常组织的表达也有显著改变。
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Fig 3 Analysis of p53 mRNA by RT-PCR.
lane 1-5: NPC sample; lane 6：PCR marker; lane7-8：control.
图3 p53 mRNA RT-PCR分析
Fig 4 Analysis of p51A mRNA by RT-PCR.
lane 1-5: NPC sample; lane 6：PCR marker; lane 7-8：control.
图4 p51A mRNA RT-PCR分析
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Fig 5 Analysis of p51B mRNA by RT-PCR.
lane1-5: NPC sample; lane 6：PCR marker; lane 7-8： control.
图5 p51B mRNA RT-PCR分析
四、Southern 杂交结果
用Southern 杂交检测RT-PCR的真实性。所选探针经BLAST分析在PCR扩增序列内，理论上可与PCR产物特异结合。Southern 杂交的结果证实，探针可与目的DNA片段结合。说明RT-PCR所扩增的片段为特异性DNA(图6、7)。
Fig 6 Southern blot analysis of p51A PCR.
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lane 1-6: PCR product of NPC sample; lane 7-8: control.
图6 p51A PCR的Southern blot分析
Fig 7 Southern blot analysis of p51B PCR.
lane 1-6: PCR product of NPC sample; lane 7-8: control.
图7 p51B PCR的Southern blot分析
讨 论
p51基因是p53基因家族的一员，它们在结构上的相似性决定了它们在功能上的可预见性，而在结构上的差异决定了它们在功能上存在一定的差异。p51基因缺陷小鼠的实验揭示p51基因是肢体和上皮的形态发生、再生性增殖所必需[ 10-11]。
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p51基因又称p63，p73L[ 8]，在大鼠体内为KET[ 12]，与其具有高度的同源性。人的p51基因是从骨骼肌cDNA文库中用消减PCR获得的。目前发现，小鼠的p51基因至少编码6种不同的异构蛋白[ 13]，它们是来自于不同启动子所指导的转录本。人的p51基因可编码两种不同的异构蛋白p51A和p51B，前者 由448个氨基酸残基组成，后者由641个氨基酸残基组成。两种蛋白质的区别在于外显子10处的蛋白质具有不同的C-端[ 8]。
作为p53 基因家族的一个新成员，p51显示出与p53 及p73基因的结构上的相似性，如在DNA结合结构域(DNA binding domain)、转录激活结构域(transcriptional transactivation domain)和四聚体化结构域(tetramerization domain)与p53基因的同源性分别达到60%、22%和37%[ 13]。p73 α与p51B ， p73β与 p51A 在结构上也有一定的同源性[ 8,9]。如：p73β与 p51A在DNA结合结构域、转录激活结构域、四聚体化结构域的同源性分别达到87%、30%和65%。毫无疑问，p51同样可以转录激活p53基因的内源性靶分子，如细胞周期抑制基因p21，导致细胞凋亡和生长受抑[ 13]。
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在研究肿瘤抑制基因的蛋白质产物如p53、pRB时，病毒瘤蛋白是极为重要的分子。p53可与多种DNA病毒的瘤蛋白如SV40的大T抗原，腺病毒的E1B55K，HPV 的E6，EB病毒的EBNA5和BZLF2相互作用而影响其生物活性[ 14]。p51 与DNA病毒的瘤蛋白的相互作用虽未见报道，但由于p73不能与大T抗原、E6、E1B55K相互作用，基于p51和p73结构的相似性，推测p51也不能与上述DNA病毒的瘤蛋白相互作用。而p51与EBNA5和BZLF2是否能发生相互作用，仍需进一步的实验证实。
Sunahara[ 5]曾报道有关p51基因在肺癌及乳腺癌的表达，发现以DNA结合结构域设计的引物，经RT-PCR扩增35个循环后，在非小细胞肺癌的肿瘤和癌旁正常组织p51 mRNA的表达无相关性。本实验中，证实p51B基因在鼻咽癌组织中的表达高于对照组织，而p51B基因的表达要高于p51A基因，此时，p53基因的表达未见改变，而且并未检测到p53基因的突变。显然，本实验的结果不同于Sunahara的结果，原因有二：(1)将p51 的基因表达从p51A、p51B mRNA水平分别进行检测，更能精确显示p51 基因在组织细胞内的真实表达；(2)利用平台期的监测，可准确地确定基因表达较强且不同待检标本差异较大的PCR循环数，便于准确反映待检基因的表达细微差异。
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与p53表达水平维持不变相比，p51B和p51A mRNA在鼻咽癌组织中的表达均高于对照组织，与野生型p73在肿瘤组织的表达高于癌旁正常组织表达的报道一致[ 15]。由于p53 基因家族的三成员在四聚体化结构域上存在一定的同源性，不同的家族成员有可能形成异源(杂合)四聚体[ 13]。野生型p53与突变型p53形成的四聚体，可抑制野生型p53的功能[ 16]；野生型p53与p73形成异源(杂合)四聚体也有报道不具备野生型p53的功能[ 7，13]。因此，完全有理由推论，p51与p53也可能通过形成异源(杂合)四聚体来影响p53的生物学活性。
在对我国南方鼻咽癌的研究中发现，p53的突变率很低，但有p53的累积。本研究结果，可为这一现象提出一个合理的推测。当p51B在鼻咽癌组织的表达增高后，p51B可与p53形成异源(杂合)四聚体。由于在p51蛋白分子内未发现p53在细胞内主要的功能及降解介导分子MDM2的结合位点[ 17]，而且，与p53相比，p51B分子C-端的保守区(100个氨基酸残基)，含有SAM(sterile alpha motif)[ 18]。当形成p51B-p53异源(杂合)四聚体时， p53分子上MDM2的结合位点可能被掩盖，导致p53在组织内的累积。p73过表达的神经胶质瘤[ 15]同样出现p53累积可以作为本推测有力的佐证之一。
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在体内，p51A的转录激活作用要明显高于p51B[ 15]。但在本实验中发现，鼻咽癌癌变后，p51A mRNA水平呈现明显的增高， 而p53的表达并无显著变化。说明细胞癌变后，p51A可能取代p53，发挥对肿瘤细胞的生长调节作用。而p51基因的另一种转录本p51B分子内的SAM是蛋白质信号分子相互作用结构域。 提示p51B分子可能通过参与信号分子相互作用，在鼻咽上皮的分化和形态发生过程中发挥作用[ 10]。
综上所述，作为p53 基因家族的每一个成员，它们的结构、功能有一定的相似性，但也存在一定的差别：p53在组织细胞内广泛表达，发挥细胞生长、细胞凋亡的调节作用；p51主要在上皮性细胞内表达，p73主要在神经性细胞内表达。作为对p53的补充，两者均不与多种DNA病毒的瘤蛋白相互作用，是细胞内抗病毒的细胞生长调节因子。在正常细胞内，p53、p51和 p73达到动态平衡，功能互补，共同完成对细胞生长的调节作用。当细胞受到环境因素(化学致癌物、致瘤病毒)攻击时，它们在各自不同的组织内发挥作用。一旦p53、p51和 p73动态平衡被打破，细胞就可能出现不可逆转的恶性转化。而对p51和 p73结构功能，p51和 p73如何与细胞内的生物分子相互作用的进一步研究，将有可能为肿瘤的发生和发展机理的阐明奠定基础。
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[基金项目] 国家自然科学基金重点资助(39730200)
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-12-24 [修回日期] 2000-04-03, 百拇医药
单位：(湖南医科大学肿瘤研究所卫生部重点实验室， 湖南 长沙 410078)
关键词：鼻咽肿瘤；基因，P53；基因表达
中国病理生理杂志000901 [摘 要] 目的： 研究p51基因的两个转录本p51A和p51B在鼻咽癌及对照组织中的表达谱，为进一步探讨p51在鼻咽癌癌变过程中的作用打下初步基础。方法： (1)用PCR-SSCP银染技术检测21例鼻咽癌组织及配对外周血标本p53基因的突变。(2) 用RT-PCR检测p51A和p51B在鼻咽癌及对照组织中的表达。结果： (1)21例鼻咽癌组织及配对外周血标本p53基因未发现突变。(2) 在鼻咽癌及对照组织中，p51B的mRNA表达要高于p51A。(3)p51A和 p51B mRNA在鼻咽癌组织中的表达高于对照组织。结论： (1) p51A和p51B mRNA在鼻咽癌中的表达高于对照组织。(2)p51A和 p51B mRNA表达的改变与p53基因的突变无关。 [主题词] 鼻咽肿瘤；基因，P53；基因表达
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LI Hong, ZHANG Ling, YAO Kai-tai
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越来越多的实验证实，肿瘤是一种细胞周期病[1]，是由于一种或多种细胞周期因子调节失控所造成。肿瘤抑制基因在正常情况下可抑制肿瘤的发生和发展[2]。这种抑制功能的丧失是肿瘤形成的必要条件。p53基因属广谱的肿瘤抑制基因，在体内各种组织广泛表达。其翻译产物是多功能转录调节因子，可在细胞周期调控、DNA修复、细胞凋亡的启动及细胞分化的调节等多个途径发挥重要的门控(gatekeeper)作用。在人类肿瘤已发现的p53基因的点突变至少有3500种[ 3,4](错义突变、无义突变、无声突变和移码突变)。在非小细胞肺癌中，p53基因的点突变频率甚至可达到40%-60%[ 5]，提示组织的恶性转化与p53基因的突变密切相关。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方高发的一种上皮性恶性肿瘤。目前研究表明，鼻咽癌的p53的突变频率很低，小于10%[ 6]，而且出现了p53累积的现象。
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在体内，许多重要的基因均以基因家族的形式发挥作用，p53也不例外。 新近发现，p53基因家族有两个新成员。p73基因定位在染色体1p36[ 7]，主要在神经组织内表达，在甲状腺、胰腺、心肌、肝脏、骨骼肌内也可检测到[ 8]；p51基因定位在染色体3q28[ 9]，是一候选的肿瘤抑制基因。p51基因有两个转录本，p51A和p51B，在多种上皮性组织如鼠的皮肤、内耳、食道上皮有高表达[10,11]；人的胰腺、心肌、膀胱、骨骼肌、甲状腺也有表达[ 8]。目前发现的有限的点突变也发生在上皮来源的组织[ 5]。在人的鼻咽上皮，p51A、p51B是否有表达，在该部位发生恶性转变前后，其表达谱是否有改变则未见报道。本文用竞争性RT-PCR的方法，检测正常成人鼻咽上皮、鼻咽癌组织的p51A和p51B的表达水平，试图解释鼻咽癌组织内鼻咽癌p53累积的现象，同时为进一步阐明p51基因在鼻咽癌发病机制中的作用奠定基础。
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材 料 和 方 法
一、材料
(一)15例鼻咽癌活检标本及配对外周血样品，6例正常对照活检标本及配对外周血样品均来自于湖南省肿瘤医院头颈科门诊室，鼻咽癌患者均为未接受放射治疗的门诊病人，其活检标本经鉴定均为低分化鳞癌。
(二)PCR引物由大连宝生物公司合成。Taq DNA聚合酶为华美公司产品。CNE-2由我所细胞中心提供，该细胞p53基因位于第8外显子上第280密码子存在G→C的突变。
二、 方法
(一) RNA 、DNA的抽提 用Trizol试剂盒抽提活检组织标本。水相用异丙醇沉淀RNA，酚相按说明书抽提DNA。外周血标本按常规方法抽提DNA。并对抽提DNA及RNA进行纯度及浓度鉴定。
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(二)PCR扩增 根据p53 gDNA序列，选取p53外显子中的突变热点区5-8外显子，设计相应的引物如下：
在50 μL反应体系内，含1X反应缓冲液，1 μg 基因组DNA，25 μmol/L上游及下游引物，dNTP 200 μmol/L，2.5 u Taq酶。95℃，5 min热变性后的循环参数为94℃，45 s；58℃，45 s； 72℃，45 s，共35个循环，最后一个循环的延伸时间为10 min。1.2%琼脂糖75 V电泳20 min检测，上样量10 μL。阴性对照用水代替模板DNA。 位点
引物序列
产物
外显子
5
CTGTCTCCTTCCTCTTCCTACAGT
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282
bp
GCAATCAGTGAGGAATCAGAGG
外显子
6
CCTCTGATTCCTCACTGATTGC
157
bp
CAGTTGCAAACCAGACCTCAG
外显子
7
GGCCTGTGTTATCTCCTAGGTTG
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131
bp
ACCTGGAGTCTTCCAGTGTGAT
外显子
8
AGTGGTAATCTACTGGGACGGAAC
151
bp
CTGCTTGCTTACCTCGCTTAGT
(三)SSCP分析 5 μL PCR产物与5 μL甲酰胺变性上样缓冲液(95%甲酰胺；20 mmol/L EDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青)混合后，100℃变性10 min后，迅速置冰上10 min。以含或不含5% 甘油的12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(49∶1)为支持介质，室温下65V电泳分离10 h。用10%乙醇，1%硝酸分别处理后，银染至DNA区带清晰止。干燥保存。以CNE-2细胞DNA经PCR扩增后p53的8外显子片段为阳性对照。
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(四)RT-PCR分析 RNA 样品用DNase处理，去除残余的DNA。按Promega说明书进行逆转录反应，42℃，保温60 min后，继续在37℃，反应30 min，然后68℃变性20 min。以NPC及正常对照的cDNA为模板，确定平台期及两者PCR差异最大的循环数。25 μL反应体系内，含1X反应缓冲液，2 μL cDNA，20 pmol上游 及下游引物，dNTP 200 nmol/L，2.5U Taq酶。95℃，5 min预变性后的循环参数为94℃，50 s；56℃，50 s； 72℃，50 s，循环数根据平台期结果决定。最后一个循环的延伸时间为10 min。10 μL PCR产物1.2%琼脂糖(含EB)75V电泳20 min 检测。结果于紫外灯下摄影保存，并进行区带的灰度分析。 引物序列分别为：
p53：5'-ACCTGGAGTCTTCCAGTGTGAT3',5'AGTCACAGCACATGACGGAG-3'；p51A: 5'ATTCCTGAAGCAGGCTGAAA3', 5'GAAAGCAGCAAGTTTCGGAC-3';p51B: 5'GCTTATCAACCCTCAGCAGC3', 5'ATGATGAACAGCCCAACCTC3'。产物片段分别为289 bp、396 bp和242 bp，内对照为GAPDH(580 bp)。
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(五)Southern 杂交 将标本p51A和p51B经RT-PCR扩增后，产物琼脂糖电泳分离。毛细管转移至尼龙膜，UV交联固定。预杂交8 h后，与32P标记的探针杂交16 h，常规洗膜，压片，-80℃放射自显影48 h。探针序列为： GGGCCGTGAGACTT ATGAAA(p51A)；TACAACCATTCCTGATGGCA(p51B)。用末端转移酶标记。结 果
一、 鼻咽癌p53基因突变的分析
21例鼻咽癌组织及配对外周血标本经PCR-SSCP检测，在p53基因的第5-8外显子未见异常泳动带，双链DNA泳动位置与待扩增片段的理论长度一致。而在相同条件下，外显子8的阳性对照CNE-2的PCR扩增片段电泳带型则显示异常。说明用PCR-SSCP技术，在待检测标本gDNA，未检测到p53基因的突变(图1)。
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Fig 1 p53 gene mutation by PCR-SSCP.
lane l-8:p53 exon 8 PCR products of 4 tissues and blood;
lane 9:positive control; lane 10: 100 bp DNA ladder.
图1 PCR-SSCP鉴定p53基因突变
Fig 2 Identification of RNA purity.
图2 RNA 纯度鉴定
二、 p53基因表达的RT-PCR分析
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15例鼻咽癌组织活检标本及6 例正常对照的RNA经DNase处理后，1%琼脂糖电泳检测，5S、18S和25S rRNA 3条区带清晰可见，满足RT-PCP分析的要求(图2)。平台期确定26个循环时，p53即可达到较强的扩增；30个循环时，p53基因的扩增达到平台期。选择26个循环作为扩增循环数，尽可能体现不同标本间的表达差异。1.2%琼脂糖电泳检测PCR产物，在紫外灯下观测并摄影(图3)。结果经BANDLEADER(3.0) 软件分析，鼻咽癌组织活检标本的p53基因表达强度与细胞管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达强度之比为0.82，而实验对照组的两基因表达强度之比为0.76，两者无显著差异。说明p53基因表达在RNA水平没有改变。
三、 p51基因转录本p51A和p51B表达的RT-PCR分析
相同组织标本确定32个循环时，p51A和p51B cDNA扩增达到平台期。而在30个循环时，所选的一对鼻咽癌组织活检标本及正常对照的p51AcDNA出现了差异表达。因而选择30个循环作为扩增循环数。1.2%琼脂糖电泳检测PCR产物，在紫外灯下观测并摄影(图4、5)。结果经BANDLEADER(3.0) 软件分析，鼻咽癌组织活检标本的 p51A mRNA表达强度与GAPDH基因的表达强度之比为0.28，而实验对照组的两基因表达强度之比为 0.10，两者差异显著。说明p51A mRNA 表达在两组有显著改变。相同条件下，p51B mRNA表达强度与 GAPDH基因的表达强度之比为0.63，而实验对照组的两基因表达强度之比为0.44，两者有显著差异。说明 在p51A mRNA表达发生改变的同时，p51基因的另一种转录本p51B mRNA在癌变组织和正常组织的表达也有显著改变。
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Fig 3 Analysis of p53 mRNA by RT-PCR.
lane 1-5: NPC sample; lane 6：PCR marker; lane7-8：control.
图3 p53 mRNA RT-PCR分析
Fig 4 Analysis of p51A mRNA by RT-PCR.
lane 1-5: NPC sample; lane 6：PCR marker; lane 7-8：control.
图4 p51A mRNA RT-PCR分析
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Fig 5 Analysis of p51B mRNA by RT-PCR.
lane1-5: NPC sample; lane 6：PCR marker; lane 7-8： control.
图5 p51B mRNA RT-PCR分析
四、Southern 杂交结果
用Southern 杂交检测RT-PCR的真实性。所选探针经BLAST分析在PCR扩增序列内，理论上可与PCR产物特异结合。Southern 杂交的结果证实，探针可与目的DNA片段结合。说明RT-PCR所扩增的片段为特异性DNA(图6、7)。
Fig 6 Southern blot analysis of p51A PCR.
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lane 1-6: PCR product of NPC sample; lane 7-8: control.
图6 p51A PCR的Southern blot分析
Fig 7 Southern blot analysis of p51B PCR.
lane 1-6: PCR product of NPC sample; lane 7-8: control.
图7 p51B PCR的Southern blot分析
讨 论
p51基因是p53基因家族的一员，它们在结构上的相似性决定了它们在功能上的可预见性，而在结构上的差异决定了它们在功能上存在一定的差异。p51基因缺陷小鼠的实验揭示p51基因是肢体和上皮的形态发生、再生性增殖所必需[ 10-11]。
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p51基因又称p63，p73L[ 8]，在大鼠体内为KET[ 12]，与其具有高度的同源性。人的p51基因是从骨骼肌cDNA文库中用消减PCR获得的。目前发现，小鼠的p51基因至少编码6种不同的异构蛋白[ 13]，它们是来自于不同启动子所指导的转录本。人的p51基因可编码两种不同的异构蛋白p51A和p51B，前者 由448个氨基酸残基组成，后者由641个氨基酸残基组成。两种蛋白质的区别在于外显子10处的蛋白质具有不同的C-端[ 8]。
作为p53 基因家族的一个新成员，p51显示出与p53 及p73基因的结构上的相似性，如在DNA结合结构域(DNA binding domain)、转录激活结构域(transcriptional transactivation domain)和四聚体化结构域(tetramerization domain)与p53基因的同源性分别达到60%、22%和37%[ 13]。p73 α与p51B ， p73β与 p51A 在结构上也有一定的同源性[ 8,9]。如：p73β与 p51A在DNA结合结构域、转录激活结构域、四聚体化结构域的同源性分别达到87%、30%和65%。毫无疑问，p51同样可以转录激活p53基因的内源性靶分子，如细胞周期抑制基因p21，导致细胞凋亡和生长受抑[ 13]。
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在研究肿瘤抑制基因的蛋白质产物如p53、pRB时，病毒瘤蛋白是极为重要的分子。p53可与多种DNA病毒的瘤蛋白如SV40的大T抗原，腺病毒的E1B55K，HPV 的E6，EB病毒的EBNA5和BZLF2相互作用而影响其生物活性[ 14]。p51 与DNA病毒的瘤蛋白的相互作用虽未见报道，但由于p73不能与大T抗原、E6、E1B55K相互作用，基于p51和p73结构的相似性，推测p51也不能与上述DNA病毒的瘤蛋白相互作用。而p51与EBNA5和BZLF2是否能发生相互作用，仍需进一步的实验证实。
Sunahara[ 5]曾报道有关p51基因在肺癌及乳腺癌的表达，发现以DNA结合结构域设计的引物，经RT-PCR扩增35个循环后，在非小细胞肺癌的肿瘤和癌旁正常组织p51 mRNA的表达无相关性。本实验中，证实p51B基因在鼻咽癌组织中的表达高于对照组织，而p51B基因的表达要高于p51A基因，此时，p53基因的表达未见改变，而且并未检测到p53基因的突变。显然，本实验的结果不同于Sunahara的结果，原因有二：(1)将p51 的基因表达从p51A、p51B mRNA水平分别进行检测，更能精确显示p51 基因在组织细胞内的真实表达；(2)利用平台期的监测，可准确地确定基因表达较强且不同待检标本差异较大的PCR循环数，便于准确反映待检基因的表达细微差异。
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与p53表达水平维持不变相比，p51B和p51A mRNA在鼻咽癌组织中的表达均高于对照组织，与野生型p73在肿瘤组织的表达高于癌旁正常组织表达的报道一致[ 15]。由于p53 基因家族的三成员在四聚体化结构域上存在一定的同源性，不同的家族成员有可能形成异源(杂合)四聚体[ 13]。野生型p53与突变型p53形成的四聚体，可抑制野生型p53的功能[ 16]；野生型p53与p73形成异源(杂合)四聚体也有报道不具备野生型p53的功能[ 7，13]。因此，完全有理由推论，p51与p53也可能通过形成异源(杂合)四聚体来影响p53的生物学活性。
在对我国南方鼻咽癌的研究中发现，p53的突变率很低，但有p53的累积。本研究结果，可为这一现象提出一个合理的推测。当p51B在鼻咽癌组织的表达增高后，p51B可与p53形成异源(杂合)四聚体。由于在p51蛋白分子内未发现p53在细胞内主要的功能及降解介导分子MDM2的结合位点[ 17]，而且，与p53相比，p51B分子C-端的保守区(100个氨基酸残基)，含有SAM(sterile alpha motif)[ 18]。当形成p51B-p53异源(杂合)四聚体时， p53分子上MDM2的结合位点可能被掩盖，导致p53在组织内的累积。p73过表达的神经胶质瘤[ 15]同样出现p53累积可以作为本推测有力的佐证之一。
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在体内，p51A的转录激活作用要明显高于p51B[ 15]。但在本实验中发现，鼻咽癌癌变后，p51A mRNA水平呈现明显的增高， 而p53的表达并无显著变化。说明细胞癌变后，p51A可能取代p53，发挥对肿瘤细胞的生长调节作用。而p51基因的另一种转录本p51B分子内的SAM是蛋白质信号分子相互作用结构域。 提示p51B分子可能通过参与信号分子相互作用，在鼻咽上皮的分化和形态发生过程中发挥作用[ 10]。
综上所述，作为p53 基因家族的每一个成员，它们的结构、功能有一定的相似性，但也存在一定的差别：p53在组织细胞内广泛表达，发挥细胞生长、细胞凋亡的调节作用；p51主要在上皮性细胞内表达，p73主要在神经性细胞内表达。作为对p53的补充，两者均不与多种DNA病毒的瘤蛋白相互作用，是细胞内抗病毒的细胞生长调节因子。在正常细胞内，p53、p51和 p73达到动态平衡，功能互补，共同完成对细胞生长的调节作用。当细胞受到环境因素(化学致癌物、致瘤病毒)攻击时，它们在各自不同的组织内发挥作用。一旦p53、p51和 p73动态平衡被打破，细胞就可能出现不可逆转的恶性转化。而对p51和 p73结构功能，p51和 p73如何与细胞内的生物分子相互作用的进一步研究，将有可能为肿瘤的发生和发展机理的阐明奠定基础。
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[基金项目] 国家自然科学基金重点资助(39730200)
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-12-24 [修回日期] 2000-04-03, 百拇医药