细胞间旁分泌在牵张刺激心肌细胞肥大中的作用
作者：冯兵 王德文 何作云
单位：冯兵 王德文(军事医学科学院放射医学研究所， 北京 100850)；何作云(第三军医大学新桥医院心内科， 重庆 400037)
关键词：物理刺激；成纤维细胞；内皮；血管；心肌病；肥大性
中国病理生理杂志001003
[摘 要] 目的： 探讨细胞间旁分泌在牵张刺激心肌细胞肥大中的作用。方法： 用牵张刺激培养成纤维细胞、微血管内皮细胞的条件培养基，刺激心肌细胞，观察[3H]-Leu掺入的变化。 结果： 牵张培养成纤维细胞、微血管内皮细胞的条件培养基均可显著刺激心肌细胞[3H]-Leu掺入。条件培养基中血管紧张素II、内皮素含量显著升高。用特异的血管紧张素II、内皮素受体拮抗剂可明显抑制心肌细胞[3H]-Leu掺入率，联合应用时抑制率可达80%以上。结论： 牵张刺激可通过诱导心肌间质细胞内分泌活化启动心肌肥大反应。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R364.3+1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)10-0883-04
Role of cellular paracrine in the mechanism of cardiomyocyte
hypertrophy induced by stretch
FENG Bing
(Institute of radiation medicine, academy of military medicine， Beijing 100850, China；)
WANG De-wen
, 百拇医药
(Institute of radiation medicine, academy of military medicine， Beijing 100850, China；)
HE Zuo-yun
(Department of Cardiology, Xingiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
[Abstract] AIM： To investigate the role of cellular paracrine in the mechanism of cardiomyocyte hypertrophy induced by stretch. METHODS: [3H]-leu incorporation into cultured cardiomyocytes was measured when stimulated by conditioned-media of myocardial fibroblast and microvascular endothelial cell after stretch. RESULTS： [3H]-leu incorporation rate were both elevated significantly stimulated by conditioned-media of myocardial fibroblast and microvascular endothelial cell. And angiotensin II and endothelin of conditioned-media of myocardial fibroblast and microvascular endothelial cell were also elevated significantly. And [3H]-leu incorporation rate were inhibited significantly when the specific angiotensin II and endothelin receptor antagonist losartan(1 μmol/L) and BQ123(1 μmol/L) were added. [3H]-leu incorporation rate were inhibited over 80% when losartan(1 μmol/L) and BQ123(1 μmol/L) were added together. CONCLUSION: The activation of myocardial fibroblast and microvascular endothelial cell endocrine stimulated by stretch play a role through paracrine in the pathogenesis of pressure-overload heart hypertrophy.
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[MeSH] Physical stimulation; Fibroblasts; Endothelium,vascular; Cardiomyopathy, hypertrophic
近年来研究表明，心脏是一个重要的内分泌器官，如已经证实的心脏肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)、心内膜和心外膜的内分泌功能等。但是，它们基本上是在整体动物上研究的，对于心肌组织中各种细胞的功能单独离体研究较少。心肌组织中心肌细胞占总重量的90%以上，在数量上却仅占总细胞数的60%，成纤维细胞、微血管内皮细胞等占近40%[1]。因此，成纤维细胞、微血管内皮细胞的功能变化必然对心肌细胞的生长、代谢、收缩等功能起到重要的调控作用[2-5]。目前，对于成纤维细胞、微血管内皮细胞在受到超负荷力学机械刺激后的内分泌功能有何变化及其在超负荷心肌肥大机制中的作用均不清楚。本文应用体外细胞牵张刺激模型，探讨牵张刺激是否诱导心肌成纤维细胞、微血管内皮细胞内分泌活化及其在心肌细胞肥大反应中的意义。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、 心肌细胞、成纤维细胞的培养
参照Simpson等[6]的方法进行差速贴壁分离培养心肌细胞、成纤维细胞。
二、心肌微血管内皮细胞的培养
参考Chen等[7]的方法培养心肌微血管内皮细胞，0.1%胰酶-0.02%EDTA消化传代。用Ⅷ因子免疫组织化学方法鉴定。
三、成纤维细胞、微血管内皮细胞牵张刺激实验
消化已融合的成纤维细胞、微血管内皮细胞制成细胞悬液后，计数，按1×106/mL分别接种于牵张培养盒(其制作方法见另文)内，24 h后换液1次，此后隔48 h换液1次。第4 d时换以无血清DMEM培养基培养24 h，再换以3 mL无血清DMEM，然后进行20%拉长持续牵张硅酮膜，分别继续培养24、48、72 h后，收集培养液作为条件培养液[成纤维细胞条件培养液记为CF(conditioned-medium of fibroblasts),内皮细胞条件培养液记为CE(conditioned-medium of endothelial cells)]，分别用于放免检测及刺激心肌细胞肥大实验。
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四、条件培养基刺激心肌细胞肥大的观察
原代培养第4d的心肌细胞换以无血清DMEM培养24 h后,再按条件培养基(均用牵张48 h点)原液(CF、CE)，无血清DMEM 1:1稀释(CF 1∶1,CE 1∶1)分组分别加入培养盒，对照组加无血清DMEM，同时按3.7×1010 mBq/L培养基加入[3H]-Leu，分别继续培养24、48、72 h后，用液闪counts*min-1计数方法测定[3H]-Leu掺入率,以反映蛋白质合成功能。
五、Losartan 和BQ123对条件培养基刺激心肌细胞肥大反应的抑制作用
原代培养第4 d的心肌细胞换以无血清DMEM培养24 h后, 分别加入losartan(1 μmol/L)和BQ123(1 μmol/L)，10 min后加入条件培养基原液(CF、CE)。对照组仅加无血清DMEM。同时按3.7×1010 mBq/L培养基加入[3H]-Leu，继续培养48 h后进行液闪测量。
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六、牵张刺激后培养上清中血管紧张素II及内皮素含量的测定
取出牵张完成后的培养上清3 mL，分作两份，注入已用冰水预冷的试管内(含EDTA-Na2 30 μL和抑肽酶40 μL，测内皮素用或含0.3 mol*L-1 EDTA 50 μL，0.34 mol*L-1 8-羟基喹啉50 μL及0.32 mol*L-1 2-巯基乙醇25 μL，测血管紧张素II)，迅速混匀，4℃，3000 r/min，离心10 min，取上清-70℃保存待测。内皮素测定方法按301医院提供的试剂盒操作说明进行。血管紧张素II测定前冷冻抽干，用0.2 mL 冷PBS溶解，按海军总医院提供的试剂盒及说明进行测定。
七、统计学处理
所有数据以
±s表示，用t检验作组间差异显著检验。
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结 果
一、成纤维细胞和微血管内皮细胞牵张刺激后培养上清中血管紧张素II和内皮素含量的变化
对培养在硅酮膜上的成纤维细胞和微血管内皮细胞进行20%牵张刺激，24 h即可见到两种细胞培养上清中血管紧张素II和内皮素含量显著升高，牵张时间延长，二者的浓度进一步增加见表1。因此，不仅说明牵张刺激可诱导成纤维细胞、内皮细胞的内分泌活化，还提示其时间依赖性。
表1 牵张刺激后成纤维细胞和微血管内皮细胞培养上清中血管紧张素II和内皮素的变化
Tab 1 Changes of angiotensin II(AngII) and endothelin(ET) contents in fibroblast and
microvascular endothelial cell culture media induced by stretch(±s. n=4) Parameter
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Group
24
48
72/h
CE
Ang II(pg/mL)
Control
3.9±0.5
4.1±0.3
4.1±0.2
Stretch
17.2±0.4* *
, 百拇医药
21.1±0.5* *
25.8±0.7* *
ET(pg/mL)
Control
20.9±0.9
20.1±0.5
21.7±1.1
Stretch
59.9±1.9*
65.5±1.5* *
73.2±2.1* *
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CF Ang II(pg/mL)
Control
3.8±0.2
3.6±0.3
3.7±0.2
Stretch
9.2±0.4*
11.1±0.5*
15.4±0.6* *
ET(pg/mL)
Control
, http://www.100md.com
10.9±0.5
10.1±0.5
11.3±0.9
Stretch
21.1±0.9
29.9±0.3*
43.7±2.1*
*P<0.05,** P<0.01 vs control.
二、 牵张刺激成纤维细胞后的条件培养基对心肌肥大反应的影响(见表2)
表2 牵张刺激成纤维细胞后的条件培养基
, 百拇医药
刺激心肌细胞[3H]-Leu掺入的变化
Tab 2 Change of [3H]-Leu incorporation into cultured cardiocytes
stimulated by conditioned-medium of fibroblast after
stretch (±s. n=4. counts*min-1/106 cells) Parameter
24
48
72(h)
, 百拇医药
Control
807±15
800±10
790±17
CF
2173±36*
2781±11* *
3332±33* *
CF1:1
1567±20*
1777±12*
, 百拇医药
2438±13* *
*P<0.05,* * P<0.01 vs control.
用[3H]-Leu掺入的方法可显示心肌细胞蛋白质合成功能。结果显示， 牵张刺激成纤维细胞后的条件培养基可强烈地刺激心肌细胞蛋白质合成，提示机械刺激可诱导成纤维细胞内分泌活化，进而通过旁分泌机制介导机械刺激心肌肥大反应。
表3 牵张刺激微血管内皮细胞后的条件培养基
刺激心肌细胞[3H]-Leu掺入的变化
Tab 3 Change of [3H]-Leu incorporation into cultured cardiocytes
, 百拇医药
stimulated by conditioned-medium of myocardial microvascular
endothelial cell after stretch (±s. n=4. counts*min-1/106 cells) Parameter
24
48
72(h)
Control
807±15
800±10
, 百拇医药
790±17
CE
2209±14*
2899±15* *
3475±14* *
CE1:1
1673±11*
1898±21*
2531±9* *
*P<0.05,** P<0.01 vs control.
, http://www.100md.com
三、 牵张刺激微血管内皮细胞后的条件培养基对心肌肥大反应的影响
同样，牵张刺激微血管内皮细胞后的条件培养基可显著的刺激心肌细胞蛋白质合成，表明机械刺激也可通过诱导内皮细胞内分泌活化介导其致心肌肥大作用见表3。
四、Losartan和BQ123对牵张刺激后的条件培养基诱导心肌细胞肥大反应的影响
在加入成纤维细胞和内皮细胞的牵张刺激条件培养基前，加入血管紧张素II和内皮素受体的拮抗剂losartan(1 μmol/L)、BQ123(1 μmol/L)预孵浴30 min，可显著地抑制心肌细胞[3H]-Leu掺入率，联合应用时抑制率可达80%以上，但并不能完全抑制，说明牵张刺激可诱导成纤维细胞和内皮细胞分泌多种细胞因子、生长因子(见图1、图2)。
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Fig 1 Effect of losartan and BQ123 on [3H]-Leu incorporation into cultured cardiocytes induced by fibroblast conditioned-medium.±s. n=4. *P<0.05 vs CF; # P<0.05 vs control.
图1 Losartan 和BQ123对成纤维细胞条件培养液刺激心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响
Fig 2 Effect of losartan and BQ123 on [3H]-Leu incorporation into cultured cardiocytes induced by endothelial cell conditioned-medium.±s. n=4. *P<0.05 vs CF; # P<0.05 vs control.
, 百拇医药
图2 Losartan 和BQ123对内皮细胞条件培养液刺激心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响
讨 论
大量实验表明，心脏是一个重要的内分泌器官，从最早发现的心钠素到RAS，以及近年的细胞因子、生长因子等在心脏均有表达。随着研究的深入，人们不仅认识到心内膜、心外膜通过其内分泌的变化可影响心脏生理功能及病理过程，而且还提出心肌间质细胞也可能通过旁分泌机制作用于邻近的心肌细胞[1-5]。心肌间质细胞以成纤维细胞、微血管内皮细胞为主。在整体动物模型上研究提示它们在超负荷心肌肥大机制中发挥了重要的中介作用[8]，但是，关于它们对机械刺激后的内分泌反应及在心肌肥大反应中的具体作用机制均不清楚。
本研究在建立牵张培养盒的基础上，应用收集成纤维细胞、微血管内皮细胞牵张刺激后的条件培养基，观察其对心肌细胞蛋白质合成(3H-Leu掺入)的影响，发现成纤维细胞、微血管内皮细胞的条件培养基均可显著地刺激心肌细胞3H-Leu掺入，提示牵张刺激可诱导心肌成纤维细胞、微血管内皮细胞内分泌活化，并向细胞外释放生长因子。现在已知血管紧张素II、内皮素是刺激血管收缩生长的最强烈的内分泌因子，它们也刺激心肌细胞强烈收缩和肥大。本实验结果表明牵张刺激诱导心肌成纤维细胞、微血管内皮细胞释放的生长因子中主要是血管紧张素II、内皮素，因为受体拮抗实验表明，losartan和BQ123合用可抑制80%以上的[3H]-Leu掺入，另外也说明还可能有其他因子也起到一定作用，同时也有报道牵张刺激后心肌间质细胞的内分泌活化还参与了心肌其他一些功能的转换[9-10]。因此，有必要进一步寻找牵张刺激活化细胞内分泌的共同信号通路，这样才能有效防治超负荷心肌肥大。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(No.39600041)
[参 考 文 献]
[1] Dostal DE,Booz GW,Baker KM. Angiotensin II signalling pathways in cardiac fibroblasts: conventional versus novel mechanisms in mediating cardiac growth and function[J]. Mol Cell Biochem,1996, 157:15-21.
[2] Sil P,Sen S. Angiotensin II and myocyte growth: role of fibroblasts[J]. Hypertension,1997,30(2 Pt 1):209.
, 百拇医药 [3] Fleming I,Bauersachs J,Busse R. Paracrine functions of the coronary vascular endothelium[J]. Mol Cell Biochem, 1996, 157:137-145.
[4] Brutsaert DL,Fransen P,Andries LJ,et al. Cardiac endothelium and myocardial function[J]. Cardiovasc Res, 1998, 38:281-290.
[5] Winegrad S. Endothelial cell regulation of contractility of the heart[J]. Annu Rev Physiol,1997, 59:505-525.
[6] Simpson P,McGrath A,Savion S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and catecholamines[J]. Circ Res,1982, 51:787-801.
, http://www.100md.com
[7] Chen SF,Xia F,Li SH. A new simple method for isolation of microvascular endothelial cells avoiding both chemical and mechanical injuries[J]. Microvasc Res, 1995, 50(1)：119-128.
[8] Sadoshima J,Inzumu S. The cellular and molecular response of cardiac myocytes to mechanical stress[J]. Annu Rev Physiol,1997, 59:551-571.
[9] Tyagi SC,Lewis K,Pikes D,et al. Stretch-induced membrane type matrix metalloproteinase and tissue plasminogen actovator in cardiac fibroblast cells[J]. J Cell Physiol,1998, 176:374-382.
[10] Harada M,Saito Y,Kuwahara K, et al. Interaction of myocytes and nonmyocytes is necessary for mechanical stretch to induce ANP/BNP production in cardiocyte culture[J]. J Cardiovasc Pharmacol,1998, 31(suppl 1):S357-359.
[收稿日期] 1999-07-21
[修回日期] 1999-12-02
, 百拇医药
单位：冯兵 王德文(军事医学科学院放射医学研究所， 北京 100850)；何作云(第三军医大学新桥医院心内科， 重庆 400037)
关键词：物理刺激；成纤维细胞；内皮；血管；心肌病；肥大性
中国病理生理杂志001003
[摘 要] 目的： 探讨细胞间旁分泌在牵张刺激心肌细胞肥大中的作用。方法： 用牵张刺激培养成纤维细胞、微血管内皮细胞的条件培养基，刺激心肌细胞，观察[3H]-Leu掺入的变化。 结果： 牵张培养成纤维细胞、微血管内皮细胞的条件培养基均可显著刺激心肌细胞[3H]-Leu掺入。条件培养基中血管紧张素II、内皮素含量显著升高。用特异的血管紧张素II、内皮素受体拮抗剂可明显抑制心肌细胞[3H]-Leu掺入率，联合应用时抑制率可达80%以上。结论： 牵张刺激可通过诱导心肌间质细胞内分泌活化启动心肌肥大反应。
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[中图分类号] R364.3+1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)10-0883-04
Role of cellular paracrine in the mechanism of cardiomyocyte
hypertrophy induced by stretch
FENG Bing
(Institute of radiation medicine, academy of military medicine， Beijing 100850, China；)
WANG De-wen
, 百拇医药
(Institute of radiation medicine, academy of military medicine， Beijing 100850, China；)
HE Zuo-yun
(Department of Cardiology, Xingiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
[Abstract] AIM： To investigate the role of cellular paracrine in the mechanism of cardiomyocyte hypertrophy induced by stretch. METHODS: [3H]-leu incorporation into cultured cardiomyocytes was measured when stimulated by conditioned-media of myocardial fibroblast and microvascular endothelial cell after stretch. RESULTS： [3H]-leu incorporation rate were both elevated significantly stimulated by conditioned-media of myocardial fibroblast and microvascular endothelial cell. And angiotensin II and endothelin of conditioned-media of myocardial fibroblast and microvascular endothelial cell were also elevated significantly. And [3H]-leu incorporation rate were inhibited significantly when the specific angiotensin II and endothelin receptor antagonist losartan(1 μmol/L) and BQ123(1 μmol/L) were added. [3H]-leu incorporation rate were inhibited over 80% when losartan(1 μmol/L) and BQ123(1 μmol/L) were added together. CONCLUSION: The activation of myocardial fibroblast and microvascular endothelial cell endocrine stimulated by stretch play a role through paracrine in the pathogenesis of pressure-overload heart hypertrophy.
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[MeSH] Physical stimulation; Fibroblasts; Endothelium,vascular; Cardiomyopathy, hypertrophic
近年来研究表明，心脏是一个重要的内分泌器官，如已经证实的心脏肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)、心内膜和心外膜的内分泌功能等。但是，它们基本上是在整体动物上研究的，对于心肌组织中各种细胞的功能单独离体研究较少。心肌组织中心肌细胞占总重量的90%以上，在数量上却仅占总细胞数的60%，成纤维细胞、微血管内皮细胞等占近40%[1]。因此，成纤维细胞、微血管内皮细胞的功能变化必然对心肌细胞的生长、代谢、收缩等功能起到重要的调控作用[2-5]。目前，对于成纤维细胞、微血管内皮细胞在受到超负荷力学机械刺激后的内分泌功能有何变化及其在超负荷心肌肥大机制中的作用均不清楚。本文应用体外细胞牵张刺激模型，探讨牵张刺激是否诱导心肌成纤维细胞、微血管内皮细胞内分泌活化及其在心肌细胞肥大反应中的意义。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、 心肌细胞、成纤维细胞的培养
参照Simpson等[6]的方法进行差速贴壁分离培养心肌细胞、成纤维细胞。
二、心肌微血管内皮细胞的培养
参考Chen等[7]的方法培养心肌微血管内皮细胞，0.1%胰酶-0.02%EDTA消化传代。用Ⅷ因子免疫组织化学方法鉴定。
三、成纤维细胞、微血管内皮细胞牵张刺激实验
消化已融合的成纤维细胞、微血管内皮细胞制成细胞悬液后，计数，按1×106/mL分别接种于牵张培养盒(其制作方法见另文)内，24 h后换液1次，此后隔48 h换液1次。第4 d时换以无血清DMEM培养基培养24 h，再换以3 mL无血清DMEM，然后进行20%拉长持续牵张硅酮膜，分别继续培养24、48、72 h后，收集培养液作为条件培养液[成纤维细胞条件培养液记为CF(conditioned-medium of fibroblasts),内皮细胞条件培养液记为CE(conditioned-medium of endothelial cells)]，分别用于放免检测及刺激心肌细胞肥大实验。
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四、条件培养基刺激心肌细胞肥大的观察
原代培养第4d的心肌细胞换以无血清DMEM培养24 h后,再按条件培养基(均用牵张48 h点)原液(CF、CE)，无血清DMEM 1:1稀释(CF 1∶1,CE 1∶1)分组分别加入培养盒，对照组加无血清DMEM，同时按3.7×1010 mBq/L培养基加入[3H]-Leu，分别继续培养24、48、72 h后，用液闪counts*min-1计数方法测定[3H]-Leu掺入率,以反映蛋白质合成功能。
五、Losartan 和BQ123对条件培养基刺激心肌细胞肥大反应的抑制作用
原代培养第4 d的心肌细胞换以无血清DMEM培养24 h后, 分别加入losartan(1 μmol/L)和BQ123(1 μmol/L)，10 min后加入条件培养基原液(CF、CE)。对照组仅加无血清DMEM。同时按3.7×1010 mBq/L培养基加入[3H]-Leu，继续培养48 h后进行液闪测量。
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六、牵张刺激后培养上清中血管紧张素II及内皮素含量的测定
取出牵张完成后的培养上清3 mL，分作两份，注入已用冰水预冷的试管内(含EDTA-Na2 30 μL和抑肽酶40 μL，测内皮素用或含0.3 mol*L-1 EDTA 50 μL，0.34 mol*L-1 8-羟基喹啉50 μL及0.32 mol*L-1 2-巯基乙醇25 μL，测血管紧张素II)，迅速混匀，4℃，3000 r/min，离心10 min，取上清-70℃保存待测。内皮素测定方法按301医院提供的试剂盒操作说明进行。血管紧张素II测定前冷冻抽干，用0.2 mL 冷PBS溶解，按海军总医院提供的试剂盒及说明进行测定。
七、统计学处理
所有数据以
±s表示，用t检验作组间差异显著检验。, http://www.100md.com
结 果
一、成纤维细胞和微血管内皮细胞牵张刺激后培养上清中血管紧张素II和内皮素含量的变化
对培养在硅酮膜上的成纤维细胞和微血管内皮细胞进行20%牵张刺激，24 h即可见到两种细胞培养上清中血管紧张素II和内皮素含量显著升高，牵张时间延长，二者的浓度进一步增加见表1。因此，不仅说明牵张刺激可诱导成纤维细胞、内皮细胞的内分泌活化，还提示其时间依赖性。
表1 牵张刺激后成纤维细胞和微血管内皮细胞培养上清中血管紧张素II和内皮素的变化
Tab 1 Changes of angiotensin II(AngII) and endothelin(ET) contents in fibroblast and
microvascular endothelial cell culture media induced by stretch(
±s. n=4) Parameter, http://www.100md.com
Group
24
48
72/h
CE
Ang II(pg/mL)
Control
3.9±0.5
4.1±0.3
4.1±0.2
Stretch
17.2±0.4* *
, 百拇医药
21.1±0.5* *
25.8±0.7* *
ET(pg/mL)
Control
20.9±0.9
20.1±0.5
21.7±1.1
Stretch
59.9±1.9*
65.5±1.5* *
73.2±2.1* *
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CF Ang II(pg/mL)
Control
3.8±0.2
3.6±0.3
3.7±0.2
Stretch
9.2±0.4*
11.1±0.5*
15.4±0.6* *
ET(pg/mL)
Control
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10.9±0.5
10.1±0.5
11.3±0.9
Stretch
21.1±0.9
29.9±0.3*
43.7±2.1*
*P<0.05,** P<0.01 vs control.
二、 牵张刺激成纤维细胞后的条件培养基对心肌肥大反应的影响(见表2)
表2 牵张刺激成纤维细胞后的条件培养基
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刺激心肌细胞[3H]-Leu掺入的变化
Tab 2 Change of [3H]-Leu incorporation into cultured cardiocytes
stimulated by conditioned-medium of fibroblast after
stretch (
±s. n=4. counts*min-1/106 cells) Parameter24
48
72(h)
, 百拇医药
Control
807±15
800±10
790±17
CF
2173±36*
2781±11* *
3332±33* *
CF1:1
1567±20*
1777±12*
, 百拇医药
2438±13* *
*P<0.05,* * P<0.01 vs control.
用[3H]-Leu掺入的方法可显示心肌细胞蛋白质合成功能。结果显示， 牵张刺激成纤维细胞后的条件培养基可强烈地刺激心肌细胞蛋白质合成，提示机械刺激可诱导成纤维细胞内分泌活化，进而通过旁分泌机制介导机械刺激心肌肥大反应。
表3 牵张刺激微血管内皮细胞后的条件培养基
刺激心肌细胞[3H]-Leu掺入的变化
Tab 3 Change of [3H]-Leu incorporation into cultured cardiocytes
, 百拇医药
stimulated by conditioned-medium of myocardial microvascular
endothelial cell after stretch (
±s. n=4. counts*min-1/106 cells) Parameter24
48
72(h)
Control
807±15
800±10
, 百拇医药
790±17
CE
2209±14*
2899±15* *
3475±14* *
CE1:1
1673±11*
1898±21*
2531±9* *
*P<0.05,** P<0.01 vs control.
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三、 牵张刺激微血管内皮细胞后的条件培养基对心肌肥大反应的影响
同样，牵张刺激微血管内皮细胞后的条件培养基可显著的刺激心肌细胞蛋白质合成，表明机械刺激也可通过诱导内皮细胞内分泌活化介导其致心肌肥大作用见表3。
四、Losartan和BQ123对牵张刺激后的条件培养基诱导心肌细胞肥大反应的影响
在加入成纤维细胞和内皮细胞的牵张刺激条件培养基前，加入血管紧张素II和内皮素受体的拮抗剂losartan(1 μmol/L)、BQ123(1 μmol/L)预孵浴30 min，可显著地抑制心肌细胞[3H]-Leu掺入率，联合应用时抑制率可达80%以上，但并不能完全抑制，说明牵张刺激可诱导成纤维细胞和内皮细胞分泌多种细胞因子、生长因子(见图1、图2)。
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Fig 1 Effect of losartan and BQ123 on [3H]-Leu incorporation into cultured cardiocytes induced by fibroblast conditioned-medium.
±s. n=4. *P<0.05 vs CF; # P<0.05 vs control.图1 Losartan 和BQ123对成纤维细胞条件培养液刺激心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响
Fig 2 Effect of losartan and BQ123 on [3H]-Leu incorporation into cultured cardiocytes induced by endothelial cell conditioned-medium.
±s. n=4. *P<0.05 vs CF; # P<0.05 vs control., 百拇医药
图2 Losartan 和BQ123对内皮细胞条件培养液刺激心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的影响
讨 论
大量实验表明，心脏是一个重要的内分泌器官，从最早发现的心钠素到RAS，以及近年的细胞因子、生长因子等在心脏均有表达。随着研究的深入，人们不仅认识到心内膜、心外膜通过其内分泌的变化可影响心脏生理功能及病理过程，而且还提出心肌间质细胞也可能通过旁分泌机制作用于邻近的心肌细胞[1-5]。心肌间质细胞以成纤维细胞、微血管内皮细胞为主。在整体动物模型上研究提示它们在超负荷心肌肥大机制中发挥了重要的中介作用[8]，但是，关于它们对机械刺激后的内分泌反应及在心肌肥大反应中的具体作用机制均不清楚。
本研究在建立牵张培养盒的基础上，应用收集成纤维细胞、微血管内皮细胞牵张刺激后的条件培养基，观察其对心肌细胞蛋白质合成(3H-Leu掺入)的影响，发现成纤维细胞、微血管内皮细胞的条件培养基均可显著地刺激心肌细胞3H-Leu掺入，提示牵张刺激可诱导心肌成纤维细胞、微血管内皮细胞内分泌活化，并向细胞外释放生长因子。现在已知血管紧张素II、内皮素是刺激血管收缩生长的最强烈的内分泌因子，它们也刺激心肌细胞强烈收缩和肥大。本实验结果表明牵张刺激诱导心肌成纤维细胞、微血管内皮细胞释放的生长因子中主要是血管紧张素II、内皮素，因为受体拮抗实验表明，losartan和BQ123合用可抑制80%以上的[3H]-Leu掺入，另外也说明还可能有其他因子也起到一定作用，同时也有报道牵张刺激后心肌间质细胞的内分泌活化还参与了心肌其他一些功能的转换[9-10]。因此，有必要进一步寻找牵张刺激活化细胞内分泌的共同信号通路，这样才能有效防治超负荷心肌肥大。
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[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(No.39600041)
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-07-21
[修回日期] 1999-12-02
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