急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体能量代谢的影响
作者：高文祥 柳君泽 吴利平 蔡明春
单位：高文祥 柳君泽 蔡明春(第三军医大学病理生理教研室 高原医学研究室， 重庆 400038)；吴利平(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032)
关键词：低氧；线粒体；氧化磷酸化；能量代谢；脑
中国病理生理杂志001002
[摘 要] 目的：探讨缺氧大鼠脑线粒体能量代谢的特点。方法：雄性Wistar大鼠随机分为急性缺氧组(AH)、慢性缺氧组(CH)和对照组。急、慢性缺氧组动物分别连续暴露于模拟4 000 m高原3 d(AH)和40 d(CH)。分离脑线粒体，分别测定线粒体呼吸功能、线粒体内腺苷酸池含量、ATP生成能力和F0F1-ATP酶活性。结果：急性缺氧大鼠IV态呼吸(ST4)显著升高，伴呼吸控制率(RCR)降低，同时线粒体内ATP含量、ATP生成率和F0F1-ATP酶活性均显著降低；慢性缺氧大鼠ST4、RCR、线粒体ATP含量和F0F1-ATP酶活性部分恢复。结论：急性缺氧脑线粒体代谢是以功能受损为特点，而慢性缺氧时则表现为功能的部分代偿。
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[中图分类号] R364.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)10-0879-04
Characteristics of energy metabolism in brain mitochondria
of rats exposed to hypoxia
GAO Wen-xiang
(Department of Pathophysiology & Institute of High Altitude, the Third Military Medical University,Chongqing 400038，China)
LIU Jun-ze
, 百拇医药
(Department of Pathophysiology & Institute of High Altitude, the Third Military Medical University,Chongqing 400038，China)
WU Li-ping
(Xijing Hospital, the 4th Military Medical University, Xian 710032, China) CAI Ming-chun
(Department of Pathophysiology & Institute of High Altitude, the Third Military Medical University,Chongqing 400038，China)
[Abstract] AIM:To explore the characteristics of energy metabolism in brain mitochondria of rats exposed to acute and chronic hypoxia. METHODS: Animal grouping: Wistar rats were randomized into acute hypoxic group (AH), chronic hypoxic group (CH) and the control. Respiratory function, F0F1-ATPase activity, mitochondrial ATP, ADP and AMP contents and ATP production rate were measured respectively. RESULTS: In AH, brain mitochondrial respiratory state IV (ST4) was increased, while respiratory control rate (RCR), mitochondrial ATP content, ATP production rate and F0F1-ATPase activity were decreased respectively. In CH, ST4, RCR, mitochondrial ATP content and F0F1-ATPase activity were reversed partially. CONCLUSION: Acute hypoxia may impair brain mitochondria energy metabolism by way of depressing mitochondrial oxidative phosphorylation and ATP production and these parameters gain partial reablement during chronic hypoxia.
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[MeSH] Anoxia; Mitochondria; Oxidative phosphorylation; Energy metabolism; Brain
线粒体(mitochondria)含有氧化磷酸化的重要装置，是细胞呼吸的主要场所，在维持细胞正常的物质代谢、离子转运等方面具有重要作用。而脑组织以有氧代谢为主，几乎没有无氧代谢能力，对氧的需求量高。同时，脑组织氧和ATP的储备很少，因而对缺氧的耐受性差，是机体对缺氧最敏感的组织。已有研究表明，在缺氧的肝脏[1]和心脏[2]以及缺血大脑[3]，线粒体功能都受到显著抑制。但目前对于急、慢性缺氧脑线粒体能量合成的特点尚乏研究。我们测定了急、慢性缺氧大鼠脑线粒体呼吸功能，F0F1-ATP酶活性，线粒体内腺苷酸池含量及ATP生成率，以期了解缺氧大鼠脑线粒体能量合成的特点。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、动物分组与处理
雄性Wistar大鼠(本校动物所提供，实验进行时为11-13周龄，体重160-280 g)随机分为3组：①平原对照组(control)；②急性缺氧连续减压3 d组(acute hypoxia, AH)；③慢性缺氧连续减压40 d组(chronic hypoxia, CH)。急、慢性缺氧组减压条件为：模拟海拔4 000 m，大气压61 kPa，24 h/d(每天放回平原30 min打扫清洁及喂食)。对照组动物于舱外同时饲养。平原对照组与急、慢性缺氧组动物分别在平原和模拟海拔4 000 m高原低压舱内采集标本。
二、线粒体分离
参照Clark等[4]的方法。动物断头处死，迅速分离脑组织，置于0-4℃生理盐水中洗涤数次，立即埋入带冰碴的分离介质中，用以分离线粒体。以上操作在30 s内完成。线粒体蛋白含量测定按Lowry法[5]，以牛血清白蛋白为浓度标准。
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三、线粒体呼吸功能测定参照Clark等[4]的方法。
四、脑线粒体中腺苷酸含量的测定按Kwast等[6]和邓峰等[7]方法稍加改动。于0.1 mL线粒体悬液中加入0.2 mL冰冷的1.6 mol/L HClO4，静置5 min破膜。离心20 000 g×10 min，上清用2.5 mol/L K2CO3中和，调pH 6.5(6.0-7.0)。离心20 000 g×10 min。以上操作过程均在0-4℃完成。取上清20 μL在 Water-484高效液相色谱仪上测定ATP、ADP、AMP含量。色谱柱为4.6×250 mm，hypersil-BDS C18 10 μm；流动相为20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。进行样品分析时使用恒速洗脱，全程8 min，流速1 mL/min，结果用Baseline-810数据站收集处理。
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五、脑线粒体ATP生成率的测定按Tatuch等[8]的方法。
六、F0F1-ATP酶活性测定参照Tatuch等[8]的方法。
七、统计处理
实验所获数据用
±s表示,在计算机上用Microsoft Excel进行单因素方差分析。
结 果
一、线粒体呼吸功能的变化
急性缺氧大鼠脑线粒体IV态呼吸(respiratory state 4, ST4)高于对照组1倍以上(P<0.01)，呼吸控制率(respiratory control rate, RCR)则显著低于对照组水平(P<0.01)。
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慢性缺氧大鼠脑线粒体Ⅲ态呼吸(respiratory state 3, ST3)显著低于对照组(p<0.05)，而ST4显著低于急性组(P<0.01)，RCR则显著高于急性缺氧组(P<0.01)，后两者与平原组相比均无显著差异(表1)。
二、线粒体腺苷酸池含量的变化
急性缺氧可使大鼠脑线粒体内ATP含量显著低于对照组(P<0.01)。慢性缺氧组线粒体ATP、ADP含量均显著高于急性缺氧组，分别低于和高于平原水平(P<0.05)(表 2)。
表1 急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体呼吸功能的影响
Tab 1 Effects of acute and chronic hypoxia on rat brain
mitochondrial respiratory activity (±s. n=10)
, 百拇医药
ST3(nanoatoms O/mg.min)
ST4(nanoatomsO/mg.min)
RCR
Control
51.279±13.484
15.399±1.642
4.853±0.436
AH
46.432±8.8283
0.116±4.821* *
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2.548±0.435* *
CH
40.535±6.325*
14.968±1.707△△
5.058±0.617△△
*P<0.05，* *P<0.01 vs Control； △△ P<0.01 vs A.H.
ST3, ST4 and RCR stand for respiratory state 3, state 4 and respiratory control rate respectively；AH and CH are abbreviations of acute hypoxia and chronic hypoxia.
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三、线粒体ATP生成率的变化
各组线粒体ATP生成率在以丙酮酸钠为底物时最高，是苹果酸钠/谷氨酸钠和以琥珀酸钠为底物时的2-3倍(P<0.01)，后两者之间没有显著差异。
急性缺氧组各种底物的ATP生成率显著低于对照组(P<0.05)(表 3)。
表2 急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体ATP、ADP及AMP含量的影响
Tab 2 Effects of acute and chronic hypoxia on rat brain mitochondrial ATP, ADP and AMP contents (±s)
n
, 百拇医药
ATP
(μg/g pro)
ADP
(μg/g pro)
AMP
(μg/g pro)
Control
7
141.510±31.944
156.048±89.940
185.232±119.952
AH
, 百拇医药
7
49.422±23.688**
166.632±81.738
229.422±94.692
CH
6
94.008±38.724*△
269.322±59.994*△
271.248±77.340
* P<0.05，** P<0.01 vs control; △?P<0.05 vs AH.表3 急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体ATP生成率的影响
, 百拇医药
Tab 3 Effects of acute and chronic hypoxia on rat brain mitochondrial ATP production rate from different substrates (±s)
n
ATP production rate (g/min*g protein)
Malate/glutamate
Succinate
Pyruvate
Control
7
, 百拇医药
0.638±0.259☆☆
0.795±0.320☆☆
1.956±0.367
AH
7
0.397±0.108*☆☆
0.463±0.202*☆☆
1.537±0.222*
CH
6
0.489±0.210☆☆
, 百拇医药
0.526±0.191☆☆
1.685±0.535
*P<0.05 vs control； ☆☆ P<0.01 vs pyruvate.
四、线粒体F0F1-ATP酶活性的变化
急、慢性缺氧均可使大鼠脑线粒体F0F1-ATP酶活性显著低于对照组(P<0.01)，其中慢性组显著高于急性组(P<0.01)(表4)。
讨 论
脑组织中高能化合物ATP为维持脑功能和细胞内外离子的恒定所必需，其含量变化是反映线粒体能量生成及利用的重要指标。我们观察了缺氧大鼠脑线粒体内ATP含量，发现急、慢性缺氧均可以显著降低大鼠脑线粒体ATP含量，且慢性缺氧时ATP含量明显高于急性缺氧时，提示缺氧时ATP合成下降和/或ATP消耗利用增加。
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表4 急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体
F0F1-ATP酶活性的影响
Tab 4 Effects of acute and chronic hypoxia on rat brain
mitochondrial F0F1-ATPase activity (±s. n=3)
F0F1-ATPase activity
(μmol Pi.g-1.min-1)
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Control
22.413±2.964
AH
13.237±1.968**
CH
16.133±2.329**△△
**P<0.01 vs control； △△ P<0.01 vs AH.
急性缺氧动物线粒体ATP含量下降可能通过以下途径：(1)呼吸链电子传递速度下降。急性缺氧3 d大鼠脑线粒体以苹果酸钠/谷氨酸钠为底物的IV态呼吸(ST4)显著升高，同时RCR明显降低。RCR下降说明ADP对呼吸链电子传递速率的控制程度降低，反映氧化磷酸化过程在一定程度上的脱偶联。而ST4升高，可能和线粒体内外钙循环加速、ATP/ADP转运载体受抑制，而导致Ⅳ态耗氧显著升高有关[9]。(2)氧化磷酸化解偶联。急性缺氧3 d时，大鼠脑线粒体各种反应底物的ATP生成率均显著下降，提示急性缺氧动物脑线粒体ATP生成率显著降低除缺氧对线粒体结构完整性的损害外，还与功能上线粒体氧化过程或/和磷酸化过程以及二者解偶联程度有关。而不同氧化底物ATP生成率不同，可能与不同底物进入线粒体时的穿梭系统有关，与线粒体呼吸链电子传递途径无关。(3)F0F1-ATP酶活性降低。急性缺氧可以显著降低脑线粒体F0F1-ATP酶活性，提示缺氧可直接损伤F0F1-ATP酶，说明缺氧动物脑线粒体能量合成能力降低，除与呼吸链传递电子速度减慢，导致线粒体跨膜质子梯度形成障碍外，还与ATP合成酶本身的活性降低有关。F0F1-ATP酶的F0亚单位对寡酶素敏感，其敏感性的下降，可能反映ATP酶活性的降低。由于F0功能下降，F1与膜片段紧密度下降，导致酶活性降低[10]。
, 百拇医药
而在慢性缺氧时，线粒体氧化磷酸化能力可以部分恢复：(1)呼吸链电子传递。慢性缺氧40 d组动物脑线粒体ST3显著低于平原对照组，但与急性缺氧组无显著性差异，提示缺氧时ADP对线粒体电子传递和呼吸的刺激作用减弱；而ST4较急性组显著降低，RCR显著升高，两者均可恢复至平原水平，提示机体长期缺氧暴露可以通过降低线粒体Ⅳ态呼吸(ST4)来达到对缺氧环境的适应。本实验中慢性缺氧脑线粒体呼吸功能的部分恢复，提示慢性缺氧适应至少部分可以通过降低细胞基础氧耗量来达到。(2)F0F1-ATP酶活性。慢性缺氧40 d大鼠F0F1-ATP酶活性部分恢复，提示缺氧对F0F1-ATP酶活性的损伤是部分可逆的。
致谢——感谢本校大坪医院罗刚、本室陈建、曹利飞、李英和、邓中才、核医学教研究室张广运及中心仪器室等同志在实验过程中的大力支持和帮助，使本文得以完成。]
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金(No.39600171);全军“九五”青年基金资助项目
△Tel: 023-68752290； E-mail: gaowx@mail.tmmu.com.cn
[参 考 文 献]
[1] 宋玲，孙秉庸， 彭鹰，等. 缺氧条件下失血性休克大鼠肝线粒体功能的改变[J]. 中华医学杂志, 1991,7(3)：164-165.
[2] Luo Gang, Xie Zengzhu, Liu Fuyu, et al. Effects of vitamin C on myocardial mitochondrial function and ATP content in hypoxia rats[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 1998, 19(4): 351-355.
, 百拇医药
[3] Rehncrona S, Mela L, Siesjo BK. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia[J]. Stroke, 1979, 10(4): 437-466.
[4] Clark JB， Nicklas WJ. The metabolism of rat brain mitochondria[J]. J Biol Chem, 1970, 245(18): 4724-4731.
[5] Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Polin phenol reagent[J]. J Biol Chem, 1951, 193: 265-275.
, 百拇医药
[6] Kwast KE， Hand. Regulatory features of protein synthesis in isolated mitochondria from Artemia embryos[J]. Am J Physiol, 1993， 265(6pt2): R1238-R1246.
[7] 邓峰，刘昭荣，吴小红，等. 高效液相色谱检测低氧时大鼠脑组织中腺苷酸含量[J]. 解放军预防医学杂志, 1996,14(3)：185-188.
[8] Tatuch Y， Robinson BH. The mitochondrial DNA mutation at 8993 associated with NARP slows the rate of ATP synthesis in isolated lymphoblast mitochondria[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1993， 192(1): 124-128.
, 百拇医药
[9] Malis CD, et al. Mechanism of calcumpotentiation of oxygen free radical injury to renal mitochondrial[J]. J Biol Chem, 1986， 261: 14201-14208.
[10] Montgomery RI, et al. Ethanol-elicited alteration in the oligomycin sensitivity and structural stability of the mitochondrial FoF1-ATPase[J]. J Biol Chem, 1987, 262: 13285-13289.
[收稿日期] 1999-06-17
[修回日期] 2000-12-09, 百拇医药
单位：高文祥 柳君泽 蔡明春(第三军医大学病理生理教研室 高原医学研究室， 重庆 400038)；吴利平(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032)
关键词：低氧；线粒体；氧化磷酸化；能量代谢；脑
中国病理生理杂志001002
[摘 要] 目的：探讨缺氧大鼠脑线粒体能量代谢的特点。方法：雄性Wistar大鼠随机分为急性缺氧组(AH)、慢性缺氧组(CH)和对照组。急、慢性缺氧组动物分别连续暴露于模拟4 000 m高原3 d(AH)和40 d(CH)。分离脑线粒体，分别测定线粒体呼吸功能、线粒体内腺苷酸池含量、ATP生成能力和F0F1-ATP酶活性。结果：急性缺氧大鼠IV态呼吸(ST4)显著升高，伴呼吸控制率(RCR)降低，同时线粒体内ATP含量、ATP生成率和F0F1-ATP酶活性均显著降低；慢性缺氧大鼠ST4、RCR、线粒体ATP含量和F0F1-ATP酶活性部分恢复。结论：急性缺氧脑线粒体代谢是以功能受损为特点，而慢性缺氧时则表现为功能的部分代偿。
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[中图分类号] R364.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)10-0879-04
Characteristics of energy metabolism in brain mitochondria
of rats exposed to hypoxia
GAO Wen-xiang
(Department of Pathophysiology & Institute of High Altitude, the Third Military Medical University,Chongqing 400038，China)
LIU Jun-ze
, 百拇医药
(Department of Pathophysiology & Institute of High Altitude, the Third Military Medical University,Chongqing 400038，China)
WU Li-ping
(Xijing Hospital, the 4th Military Medical University, Xian 710032, China) CAI Ming-chun
(Department of Pathophysiology & Institute of High Altitude, the Third Military Medical University,Chongqing 400038，China)
[Abstract] AIM:To explore the characteristics of energy metabolism in brain mitochondria of rats exposed to acute and chronic hypoxia. METHODS: Animal grouping: Wistar rats were randomized into acute hypoxic group (AH), chronic hypoxic group (CH) and the control. Respiratory function, F0F1-ATPase activity, mitochondrial ATP, ADP and AMP contents and ATP production rate were measured respectively. RESULTS: In AH, brain mitochondrial respiratory state IV (ST4) was increased, while respiratory control rate (RCR), mitochondrial ATP content, ATP production rate and F0F1-ATPase activity were decreased respectively. In CH, ST4, RCR, mitochondrial ATP content and F0F1-ATPase activity were reversed partially. CONCLUSION: Acute hypoxia may impair brain mitochondria energy metabolism by way of depressing mitochondrial oxidative phosphorylation and ATP production and these parameters gain partial reablement during chronic hypoxia.
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[MeSH] Anoxia; Mitochondria; Oxidative phosphorylation; Energy metabolism; Brain
线粒体(mitochondria)含有氧化磷酸化的重要装置，是细胞呼吸的主要场所，在维持细胞正常的物质代谢、离子转运等方面具有重要作用。而脑组织以有氧代谢为主，几乎没有无氧代谢能力，对氧的需求量高。同时，脑组织氧和ATP的储备很少，因而对缺氧的耐受性差，是机体对缺氧最敏感的组织。已有研究表明，在缺氧的肝脏[1]和心脏[2]以及缺血大脑[3]，线粒体功能都受到显著抑制。但目前对于急、慢性缺氧脑线粒体能量合成的特点尚乏研究。我们测定了急、慢性缺氧大鼠脑线粒体呼吸功能，F0F1-ATP酶活性，线粒体内腺苷酸池含量及ATP生成率，以期了解缺氧大鼠脑线粒体能量合成的特点。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、动物分组与处理
雄性Wistar大鼠(本校动物所提供，实验进行时为11-13周龄，体重160-280 g)随机分为3组：①平原对照组(control)；②急性缺氧连续减压3 d组(acute hypoxia, AH)；③慢性缺氧连续减压40 d组(chronic hypoxia, CH)。急、慢性缺氧组减压条件为：模拟海拔4 000 m，大气压61 kPa，24 h/d(每天放回平原30 min打扫清洁及喂食)。对照组动物于舱外同时饲养。平原对照组与急、慢性缺氧组动物分别在平原和模拟海拔4 000 m高原低压舱内采集标本。
二、线粒体分离
参照Clark等[4]的方法。动物断头处死，迅速分离脑组织，置于0-4℃生理盐水中洗涤数次，立即埋入带冰碴的分离介质中，用以分离线粒体。以上操作在30 s内完成。线粒体蛋白含量测定按Lowry法[5]，以牛血清白蛋白为浓度标准。
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三、线粒体呼吸功能测定参照Clark等[4]的方法。
四、脑线粒体中腺苷酸含量的测定按Kwast等[6]和邓峰等[7]方法稍加改动。于0.1 mL线粒体悬液中加入0.2 mL冰冷的1.6 mol/L HClO4，静置5 min破膜。离心20 000 g×10 min，上清用2.5 mol/L K2CO3中和，调pH 6.5(6.0-7.0)。离心20 000 g×10 min。以上操作过程均在0-4℃完成。取上清20 μL在 Water-484高效液相色谱仪上测定ATP、ADP、AMP含量。色谱柱为4.6×250 mm，hypersil-BDS C18 10 μm；流动相为20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。进行样品分析时使用恒速洗脱，全程8 min，流速1 mL/min，结果用Baseline-810数据站收集处理。
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五、脑线粒体ATP生成率的测定按Tatuch等[8]的方法。
六、F0F1-ATP酶活性测定参照Tatuch等[8]的方法。
七、统计处理
实验所获数据用
±s表示,在计算机上用Microsoft Excel进行单因素方差分析。结 果
一、线粒体呼吸功能的变化
急性缺氧大鼠脑线粒体IV态呼吸(respiratory state 4, ST4)高于对照组1倍以上(P<0.01)，呼吸控制率(respiratory control rate, RCR)则显著低于对照组水平(P<0.01)。
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慢性缺氧大鼠脑线粒体Ⅲ态呼吸(respiratory state 3, ST3)显著低于对照组(p<0.05)，而ST4显著低于急性组(P<0.01)，RCR则显著高于急性缺氧组(P<0.01)，后两者与平原组相比均无显著差异(表1)。
二、线粒体腺苷酸池含量的变化
急性缺氧可使大鼠脑线粒体内ATP含量显著低于对照组(P<0.01)。慢性缺氧组线粒体ATP、ADP含量均显著高于急性缺氧组，分别低于和高于平原水平(P<0.05)(表 2)。
表1 急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体呼吸功能的影响
Tab 1 Effects of acute and chronic hypoxia on rat brain
mitochondrial respiratory activity (
±s. n=10), 百拇医药
ST3(nanoatoms O/mg.min)
ST4(nanoatomsO/mg.min)
RCR
Control
51.279±13.484
15.399±1.642
4.853±0.436
AH
46.432±8.8283
0.116±4.821* *
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2.548±0.435* *
CH
40.535±6.325*
14.968±1.707△△
5.058±0.617△△
*P<0.05，* *P<0.01 vs Control； △△ P<0.01 vs A.H.
ST3, ST4 and RCR stand for respiratory state 3, state 4 and respiratory control rate respectively；AH and CH are abbreviations of acute hypoxia and chronic hypoxia.
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三、线粒体ATP生成率的变化
各组线粒体ATP生成率在以丙酮酸钠为底物时最高，是苹果酸钠/谷氨酸钠和以琥珀酸钠为底物时的2-3倍(P<0.01)，后两者之间没有显著差异。
急性缺氧组各种底物的ATP生成率显著低于对照组(P<0.05)(表 3)。
表2 急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体ATP、ADP及AMP含量的影响
Tab 2 Effects of acute and chronic hypoxia on rat brain mitochondrial ATP, ADP and AMP contents (
±s)n
, 百拇医药
ATP
(μg/g pro)
ADP
(μg/g pro)
AMP
(μg/g pro)
Control
7
141.510±31.944
156.048±89.940
185.232±119.952
AH
, 百拇医药
7
49.422±23.688**
166.632±81.738
229.422±94.692
CH
6
94.008±38.724*△
269.322±59.994*△
271.248±77.340
* P<0.05，** P<0.01 vs control; △?P<0.05 vs AH.表3 急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体ATP生成率的影响
, 百拇医药
Tab 3 Effects of acute and chronic hypoxia on rat brain mitochondrial ATP production rate from different substrates (
±s)n
ATP production rate (g/min*g protein)
Malate/glutamate
Succinate
Pyruvate
Control
7
, 百拇医药
0.638±0.259☆☆
0.795±0.320☆☆
1.956±0.367
AH
7
0.397±0.108*☆☆
0.463±0.202*☆☆
1.537±0.222*
CH
6
0.489±0.210☆☆
, 百拇医药
0.526±0.191☆☆
1.685±0.535
*P<0.05 vs control； ☆☆ P<0.01 vs pyruvate.
四、线粒体F0F1-ATP酶活性的变化
急、慢性缺氧均可使大鼠脑线粒体F0F1-ATP酶活性显著低于对照组(P<0.01)，其中慢性组显著高于急性组(P<0.01)(表4)。
讨 论
脑组织中高能化合物ATP为维持脑功能和细胞内外离子的恒定所必需，其含量变化是反映线粒体能量生成及利用的重要指标。我们观察了缺氧大鼠脑线粒体内ATP含量，发现急、慢性缺氧均可以显著降低大鼠脑线粒体ATP含量，且慢性缺氧时ATP含量明显高于急性缺氧时，提示缺氧时ATP合成下降和/或ATP消耗利用增加。
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表4 急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体
F0F1-ATP酶活性的影响
Tab 4 Effects of acute and chronic hypoxia on rat brain
mitochondrial F0F1-ATPase activity (
±s. n=3)F0F1-ATPase activity
(μmol Pi.g-1.min-1)
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Control
22.413±2.964
AH
13.237±1.968**
CH
16.133±2.329**△△
**P<0.01 vs control； △△ P<0.01 vs AH.
急性缺氧动物线粒体ATP含量下降可能通过以下途径：(1)呼吸链电子传递速度下降。急性缺氧3 d大鼠脑线粒体以苹果酸钠/谷氨酸钠为底物的IV态呼吸(ST4)显著升高，同时RCR明显降低。RCR下降说明ADP对呼吸链电子传递速率的控制程度降低，反映氧化磷酸化过程在一定程度上的脱偶联。而ST4升高，可能和线粒体内外钙循环加速、ATP/ADP转运载体受抑制，而导致Ⅳ态耗氧显著升高有关[9]。(2)氧化磷酸化解偶联。急性缺氧3 d时，大鼠脑线粒体各种反应底物的ATP生成率均显著下降，提示急性缺氧动物脑线粒体ATP生成率显著降低除缺氧对线粒体结构完整性的损害外，还与功能上线粒体氧化过程或/和磷酸化过程以及二者解偶联程度有关。而不同氧化底物ATP生成率不同，可能与不同底物进入线粒体时的穿梭系统有关，与线粒体呼吸链电子传递途径无关。(3)F0F1-ATP酶活性降低。急性缺氧可以显著降低脑线粒体F0F1-ATP酶活性，提示缺氧可直接损伤F0F1-ATP酶，说明缺氧动物脑线粒体能量合成能力降低，除与呼吸链传递电子速度减慢，导致线粒体跨膜质子梯度形成障碍外，还与ATP合成酶本身的活性降低有关。F0F1-ATP酶的F0亚单位对寡酶素敏感，其敏感性的下降，可能反映ATP酶活性的降低。由于F0功能下降，F1与膜片段紧密度下降，导致酶活性降低[10]。
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而在慢性缺氧时，线粒体氧化磷酸化能力可以部分恢复：(1)呼吸链电子传递。慢性缺氧40 d组动物脑线粒体ST3显著低于平原对照组，但与急性缺氧组无显著性差异，提示缺氧时ADP对线粒体电子传递和呼吸的刺激作用减弱；而ST4较急性组显著降低，RCR显著升高，两者均可恢复至平原水平，提示机体长期缺氧暴露可以通过降低线粒体Ⅳ态呼吸(ST4)来达到对缺氧环境的适应。本实验中慢性缺氧脑线粒体呼吸功能的部分恢复，提示慢性缺氧适应至少部分可以通过降低细胞基础氧耗量来达到。(2)F0F1-ATP酶活性。慢性缺氧40 d大鼠F0F1-ATP酶活性部分恢复，提示缺氧对F0F1-ATP酶活性的损伤是部分可逆的。
致谢——感谢本校大坪医院罗刚、本室陈建、曹利飞、李英和、邓中才、核医学教研究室张广运及中心仪器室等同志在实验过程中的大力支持和帮助，使本文得以完成。]
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[基金项目] 国家自然科学基金(No.39600171);全军“九五”青年基金资助项目
△Tel: 023-68752290； E-mail: gaowx@mail.tmmu.com.cn
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 1999-06-17
[修回日期] 2000-12-09, 百拇医药