一种新的人细胞色素P450 2A6 cDNA克隆
作者：诸葛坚 钱羽力 谢海洋 余应年
单位：浙江大学医学院病理生理学教研室及医学分子生物学实验室，浙江 杭州 310031
关键词：细胞色素类；DNA；克隆；分子
中国病理生理杂志001001
[摘 要] 目的：克隆人细胞色素P450 2A6 cDNA。方法:用逆转录-PCR和DNA 重组技术, 从人肝组织中扩增人细胞色素P450 2A6基因的cDNA， 并将其连接到pBluescript载体上，对CYP2A6 cDNA进行全序列测定。结果:所克隆的cDNA与Yamano等发表的CYP2A6 cDNA序列相比，在编码区有两个变异，即codon 8 CTG→TTG,编码的氨基酸不变, 为亮氨酸。codon479 GGC(甘氨酸)→GTC(缬氨酸)，其余均相同。而在其3′端非编码区变异很多。与Fernandez-Salguero等报道的CYP2A7序列相比，其5′端虽与所克隆的CYP2A6有较多差异，但其codon479也是GTC(缬氨酸)， 在3′端非编码区仅略有差异。而所克隆的CYP2A6 cDNA与Yamano等报道的CYP2A7序列相比，3′端非编码区至所设PCR引物止，所克隆的基因序列完全相同，而在编码区却差异较多。 结论:本实验室克隆的CYP2A6 cDNA 是一种新的CYP2A6 cDNA序列, 有可能来自于新的CYP2A6等位基因的转录。
, http://www.100md.com
[中图分类号] Q785 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)10-0875-04
Cloning of a new human cytochrome P450 2A6 cDNA
ZHU Ge-jian QIAN Yu-li XIE Hai-yang YU Ying-nian
(Department of Pathophysiology and Laboratory of Medical Molecular Biology,Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310031,China)
[Abstract] AIM：To clon human cytochrome P450 2A6 cDNA. METHODS:Using reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and DNA recombinant technique, a full-length cDNA encoding cytochrome P450 2A6(CYP2A6) from human liver was cloned into pBluescript vector. The cDNA segment was identified by DNA sequencing.RESULTS: Comparing with the CYP2A6 sequence, the cloned CYP2A6 cDNA had two different bases, codon 8 CTG(Leu)→TTG(Leu), codon 479 GGC(Gly)→GTC(Val) and was quite different in their 3′end noncoding region. Comparing with CYP2A7 seqence reported by Fernandez-Salguero，the cloned CYP2A6 cDNA had some different in 5′ end coding sequence and several differencey in the 3′ end coding and noncoding sequence, but both codon 479 were GTC(Val).Comparing with the CYP2A7 seqence reported by Yamano，the cloned CYP2A6 cDNA had some difference in the coding sequence but the 3′ end no-coding area was the same. CONCLUSION: The cloned cDNA was a new cDNA of CYP2A6 which may be transcripted from a new allele of CYP2A6.
, http://www.100md.com
[MeSH] Cytochromes； DNA；Cloning, molecular
细胞色素P450(cytochrome P450, CYP)是一种含血红素酶，广泛存在于细菌和动植物中。参与氧化还原代谢内源和外源化合物。哺乳动物肝微粒体中的CYP能代谢外源化合物如药物、杀虫剂、环境污染物、致突变剂和致癌剂。因为许多毒物、致突变剂和致癌剂需要经过代谢活化，才能与细胞内的大分子作用，产生毒理学作用。因此，建立能稳定表达CYP的转基因细胞可用于化合物毒理学的快速检测。CYP2A6可代谢活化黄曲霉素B1、苯并芘、N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺和烟草特异的亚硝胺类等[1]。本实验室在构建CYP2A6转基因细胞过程中，发现了一种新的人CYP2A6 cDNA序列。
材 料 和 方 法
一、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)引物, 测序引物除T3购于华美生物公司外均由上海生工生物工程有限公司合成，TRIzol Reagent, M-MLV逆转录酶购自Gibco公司，T4 DNA连接酶，dNTP,Tag 聚合酶,核酸内切酶购自Promega公司。DNA测序试剂盒购于Perkin-Elmer
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公司。菌株和质粒由教研室保存。其它化学试剂均为分析纯试剂。
二、 引物设计
根据Yamano 等[2]发表的CYP2A6 cDNA序列，选择其5′端和3′端分别为两侧引物的起始端，扩增cDNA片段长度为1628 bp,上下引物分别为23mer和25mer, 5′端引物从cDNA起始碱基开始，设有Kpn I酶切位点，5′-GGTACCACCATGCTGGCCTCAGG-3′。 3′端引物从1628位碱基开始到1604位碱基为止，设有Xho I酶切位点, 5′ -TCCCTCGAGCCACCACGCCCCTTCC-3′。
三、人肝组织总RNA提取
取手术切除的人肝癌旁肝组织，以TRIzol Reagent, 按操作说明提取总RNA，用紫外分光光度计测定和甲醛变性凝胶电泳确定RNA的浓度，纯度和完整性[3]。
, 百拇医药
四、RT-PCR扩增CYP2A6 cDNA 5 μg总RNA加Oligo(dT)12C约200 ng及去离子水，65℃变性15 min,在冰浴中依次加5×逆转录酶缓冲液4 μL， 2.5 mmol.L-1dNTP 4 μL, M-MLV逆转录酶1 μL(200 U)，终体积为20 μL。37℃ 2 h。90℃ 3 min 灭活M-MLV酶。取10 μL,加10×PCR缓冲液8 μL，2.5 mmol.L-1dNTP 1 μL, 上下游引物各10 pmol,Tag聚合酶5 U，加去离子水至终体积100 μL。循环参数，94℃ 3 min后，94℃1 min,62℃1 min,72℃ 2 min, 循环35次，最后，72℃ 10 min。取10 μL 反应液在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。
五、 pBluescript-CYP2A6重组质粒的构建
, http://www.100md.com CYP2A6 PCR产物用乙醇沉淀,用Xho I和Kpn I酶切，载体pBluescript也用这两种酶切后，T4 DNA连接酶连接。将连接产物转化于感受态细菌JM109。在含X-gal和IPTG的氨苄青霉素LB平板上筛选白色克隆。转化菌经扩增后提取重组质粒pBluescript-CYP2A6[3]。
六、克隆片段的全序列分析
用T7，T3和重新设计的两条中间引物，5′-AAGTGCTGGGGATTGAAGTC-3′，5′-ATCGAGGAGCGCATCCAGGA-3′。根据Perkin-Elmer公司操作说明书，用BigDye标记的双脱氧链终止法反应试剂盒反应后，在本实验室 ABI Prism 310全自动毛细管电泳测序仪上对重组质粒pBluescript-CYP2A6 中的CYP2A6片段测序。
结 果
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所克隆的CYP2A6 cDNA位于pBluescript载体的多克隆位点之间, 两端为T7和T3启动子。见图1。
Fig 1 The recombinant plasmid of pBluescript-2A6
图1 重组质粒pBluescript-2A6
DNA测序结果显示所克隆的cDNA序列与Yamano等[2]发表的CYP2A6 cDNA序列(GenBank/EMBL accession number:M33318;M33316)相比，在编码区仅有两个变异，即codon 8 CTG→TTG, 编码的氨基酸不变, 为亮氨酸。codon 479 GGC(甘氨酸)→GTC(缬氨酸)，其余均相同。但在其3′端非编码区变异很多。但我们发现Fernandez-Salguero[4]等报道的CYP2A7序列(GenBank/EMBL accession number:U22029)，其5′端虽与我们克隆的有较多差异，但其codon479也是GTC(缬氨酸)，在3′端非编码区仅略有差异。而我们克隆的cDNA与Yamano[2]等报道的CYP2A7序列(GenBank/EMBL accession number:M33317)相比，3′端非编码区至所设PCR引物止，所克隆的基因序列完全相同，而在编码区却差异较多，见图2。
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Fig2 The comparison of the sequence of cloned CYP2A6 cNDA(II)with those of the reported CYP2A6(I[2])and CYP2A7 cDNA (III[2]，IV[4]).
图2 克隆的CYP2A6 cDNA序列(II)与已报道的CYP2A6(I[2])和CYP2A7cDNA序列(III[2]，IV[4])的比较。
讨 论
CYP2A基因家族位于19q13.1-13.3[5]。人类有三个基因CYP2A6，CYP2A7，CYP2A13和两个假基因CYP2A7PT及CYP2A7PC。仅CYP2A6具有香豆素-7-羟化酶活性，CYP2A7，CYP2A13皆无香豆素-7-羟化酶活性。CYP2A6 基因具有多态性，根据Daly对具有多态性的人CYP2D6等位基因的命名， 建议将CYP2A6野生型，CYP2A6V1和CYP2A6V2分别命名为CYP2A6.1，CYP2A6.2，CYP2A6.3[6]，CYP2A6.2由于一个碱基改变，Codon160 CTC(亮氨酸)变成CAC(组氨酸)，失去了香豆素-7-羟化酶活性。CYP2A6.3则由于野生型的CYP2A6基因外显子3，6，8与CYP2A7之间发生了基因交换[4]。CYP2A6.4则由于CYP2A6基因的缺失所引起，CYP2A6.4C因为CYP2A6基因的外显子1，8和9的缺失导致血小板活化因子拮抗药 (+)-顺-3,5-二甲基-2-(3-吡啶)噻唑烷-4-单-盐酸(SM-12502)的低代谢[7]。根据所克隆cDNA序列，除了codon479 GGC(甘氨酸)→GTC(缬氨酸)外，编码的氨基酸序列与CYP2A6的完全相同，并且具有CYP2A6的香豆素-7-羟化酶活性[8]。另外与Fernandez-Salguero等[4]报道的CYP2A7序列相比，codon479 皆为GTC(缬氨酸)，在3′端非编码区略有差异。与Yamano等[2]报道的CYP2A7序列相比3′端非编码区至所设PCR引物止，所克隆的基因序列完全相符，在编码区却差异较多。因此克隆的cDNA可能是一个新的CYP2A6 cDNA序列，有可能产生于CYP2A6-CYP2A7的交换。我们所克隆的cDNA 可能来自于新的CYP2A6等位基因的转录。
, 百拇医药
致谢:感谢严乐勤同志对本实验的大力协助。
[基金项目] 国家自然科学基金资助 (No.39670801)； 浙江省自然科学基金资助 (No.396467)
Tel：0571-7217149； E-mail：ynyu@mail.hz.zj.cn
[参 考 文 献]
[1] Sawada M， Kamataki T. Genetically engineered cells stably expressing cytochrome P450 and their application to mutagen assays[J].Mutation Res, 1998,411:19-43.
[2] Yamano S, Tatsuno J, Gonzalez FJ. The CYP2A3 gene product catalyzes coumarin 7-hydroxylation in human livermicrosomes[J]. Biochemistry, 1990,29(5):1322-1329.
, http://www.100md.com
[3] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T. Molecular Cloning, a Laboratory Manual[M]. 2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989. 1: 63-86.
[4] Fernandez-Salguero P, Hoffman SM, Cholerton S,et al. A genetic polymorphism in coumarin 7-hydroxylation: sequence of the human CYP2A genes and identification of variant CYP2A6 alleles[J]. Am J Hum Genet, 1995,57(3):651-660.
[5] Phillips IR, Shephard EA, Povey S,et al. A cytochrome P450 gene family mapped to human chromosome 19[J]. Ann Hum Genet, 1985,49(pt4):267-274.
, 百拇医药
[6] Daly AK, Brockmoller J, Broly F, et al. Nomenclature for human CYP2D6 alleles[J]. Pharmacogenetics, 1996,6(3):193-201.
[7] Nunoya KI, Yokoi T, Kimura K, et al. A new CYP2A6 gene deletion responsible for the in vivo polymorphic metabolism of (+)-cis-3,5-dimethyl-2-(3-pyridyl)thiazolidin-4-one hydrochloride in humans[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1999, 289(1): 437-442.
[8] 严乐勤，余应年，诸葛坚，等. 人细胞色素P450 2A6 cDNA克隆及其在哺乳类细胞中的表达[J]. 中国药理学与毒理学杂志， 2000， 14(1)：31-35.
[收稿日期]1999-07-11
[修回日期]1999-10-07
, 百拇医药
单位：浙江大学医学院病理生理学教研室及医学分子生物学实验室，浙江 杭州 310031
关键词：细胞色素类；DNA；克隆；分子
中国病理生理杂志001001
[摘 要] 目的：克隆人细胞色素P450 2A6 cDNA。方法:用逆转录-PCR和DNA 重组技术, 从人肝组织中扩增人细胞色素P450 2A6基因的cDNA， 并将其连接到pBluescript载体上，对CYP2A6 cDNA进行全序列测定。结果:所克隆的cDNA与Yamano等发表的CYP2A6 cDNA序列相比，在编码区有两个变异，即codon 8 CTG→TTG,编码的氨基酸不变, 为亮氨酸。codon479 GGC(甘氨酸)→GTC(缬氨酸)，其余均相同。而在其3′端非编码区变异很多。与Fernandez-Salguero等报道的CYP2A7序列相比，其5′端虽与所克隆的CYP2A6有较多差异，但其codon479也是GTC(缬氨酸)， 在3′端非编码区仅略有差异。而所克隆的CYP2A6 cDNA与Yamano等报道的CYP2A7序列相比，3′端非编码区至所设PCR引物止，所克隆的基因序列完全相同，而在编码区却差异较多。 结论:本实验室克隆的CYP2A6 cDNA 是一种新的CYP2A6 cDNA序列, 有可能来自于新的CYP2A6等位基因的转录。
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[中图分类号] Q785 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)10-0875-04
Cloning of a new human cytochrome P450 2A6 cDNA
ZHU Ge-jian QIAN Yu-li XIE Hai-yang YU Ying-nian
(Department of Pathophysiology and Laboratory of Medical Molecular Biology,Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310031,China)
[Abstract] AIM：To clon human cytochrome P450 2A6 cDNA. METHODS:Using reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and DNA recombinant technique, a full-length cDNA encoding cytochrome P450 2A6(CYP2A6) from human liver was cloned into pBluescript vector. The cDNA segment was identified by DNA sequencing.RESULTS: Comparing with the CYP2A6 sequence, the cloned CYP2A6 cDNA had two different bases, codon 8 CTG(Leu)→TTG(Leu), codon 479 GGC(Gly)→GTC(Val) and was quite different in their 3′end noncoding region. Comparing with CYP2A7 seqence reported by Fernandez-Salguero，the cloned CYP2A6 cDNA had some different in 5′ end coding sequence and several differencey in the 3′ end coding and noncoding sequence, but both codon 479 were GTC(Val).Comparing with the CYP2A7 seqence reported by Yamano，the cloned CYP2A6 cDNA had some difference in the coding sequence but the 3′ end no-coding area was the same. CONCLUSION: The cloned cDNA was a new cDNA of CYP2A6 which may be transcripted from a new allele of CYP2A6.
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[MeSH] Cytochromes； DNA；Cloning, molecular
细胞色素P450(cytochrome P450, CYP)是一种含血红素酶，广泛存在于细菌和动植物中。参与氧化还原代谢内源和外源化合物。哺乳动物肝微粒体中的CYP能代谢外源化合物如药物、杀虫剂、环境污染物、致突变剂和致癌剂。因为许多毒物、致突变剂和致癌剂需要经过代谢活化，才能与细胞内的大分子作用，产生毒理学作用。因此，建立能稳定表达CYP的转基因细胞可用于化合物毒理学的快速检测。CYP2A6可代谢活化黄曲霉素B1、苯并芘、N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺和烟草特异的亚硝胺类等[1]。本实验室在构建CYP2A6转基因细胞过程中，发现了一种新的人CYP2A6 cDNA序列。
材 料 和 方 法
一、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)引物, 测序引物除T3购于华美生物公司外均由上海生工生物工程有限公司合成，TRIzol Reagent, M-MLV逆转录酶购自Gibco公司，T4 DNA连接酶，dNTP,Tag 聚合酶,核酸内切酶购自Promega公司。DNA测序试剂盒购于Perkin-Elmer
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公司。菌株和质粒由教研室保存。其它化学试剂均为分析纯试剂。
二、 引物设计
根据Yamano 等[2]发表的CYP2A6 cDNA序列，选择其5′端和3′端分别为两侧引物的起始端，扩增cDNA片段长度为1628 bp,上下引物分别为23mer和25mer, 5′端引物从cDNA起始碱基开始，设有Kpn I酶切位点，5′-GGTACCACCATGCTGGCCTCAGG-3′。 3′端引物从1628位碱基开始到1604位碱基为止，设有Xho I酶切位点, 5′ -TCCCTCGAGCCACCACGCCCCTTCC-3′。
三、人肝组织总RNA提取
取手术切除的人肝癌旁肝组织，以TRIzol Reagent, 按操作说明提取总RNA，用紫外分光光度计测定和甲醛变性凝胶电泳确定RNA的浓度，纯度和完整性[3]。
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四、RT-PCR扩增CYP2A6 cDNA 5 μg总RNA加Oligo(dT)12C约200 ng及去离子水，65℃变性15 min,在冰浴中依次加5×逆转录酶缓冲液4 μL， 2.5 mmol.L-1dNTP 4 μL, M-MLV逆转录酶1 μL(200 U)，终体积为20 μL。37℃ 2 h。90℃ 3 min 灭活M-MLV酶。取10 μL,加10×PCR缓冲液8 μL，2.5 mmol.L-1dNTP 1 μL, 上下游引物各10 pmol,Tag聚合酶5 U，加去离子水至终体积100 μL。循环参数，94℃ 3 min后，94℃1 min,62℃1 min,72℃ 2 min, 循环35次，最后，72℃ 10 min。取10 μL 反应液在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。
五、 pBluescript-CYP2A6重组质粒的构建
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六、克隆片段的全序列分析
用T7，T3和重新设计的两条中间引物，5′-AAGTGCTGGGGATTGAAGTC-3′，5′-ATCGAGGAGCGCATCCAGGA-3′。根据Perkin-Elmer公司操作说明书，用BigDye标记的双脱氧链终止法反应试剂盒反应后，在本实验室 ABI Prism 310全自动毛细管电泳测序仪上对重组质粒pBluescript-CYP2A6 中的CYP2A6片段测序。
结 果
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所克隆的CYP2A6 cDNA位于pBluescript载体的多克隆位点之间, 两端为T7和T3启动子。见图1。
Fig 1 The recombinant plasmid of pBluescript-2A6
图1 重组质粒pBluescript-2A6
DNA测序结果显示所克隆的cDNA序列与Yamano等[2]发表的CYP2A6 cDNA序列(GenBank/EMBL accession number:M33318;M33316)相比，在编码区仅有两个变异，即codon 8 CTG→TTG, 编码的氨基酸不变, 为亮氨酸。codon 479 GGC(甘氨酸)→GTC(缬氨酸)，其余均相同。但在其3′端非编码区变异很多。但我们发现Fernandez-Salguero[4]等报道的CYP2A7序列(GenBank/EMBL accession number:U22029)，其5′端虽与我们克隆的有较多差异，但其codon479也是GTC(缬氨酸)，在3′端非编码区仅略有差异。而我们克隆的cDNA与Yamano[2]等报道的CYP2A7序列(GenBank/EMBL accession number:M33317)相比，3′端非编码区至所设PCR引物止，所克隆的基因序列完全相同，而在编码区却差异较多，见图2。
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Fig2 The comparison of the sequence of cloned CYP2A6 cNDA(II)with those of the reported CYP2A6(I[2])and CYP2A7 cDNA (III[2]，IV[4]).
图2 克隆的CYP2A6 cDNA序列(II)与已报道的CYP2A6(I[2])和CYP2A7cDNA序列(III[2]，IV[4])的比较。
讨 论
CYP2A基因家族位于19q13.1-13.3[5]。人类有三个基因CYP2A6，CYP2A7，CYP2A13和两个假基因CYP2A7PT及CYP2A7PC。仅CYP2A6具有香豆素-7-羟化酶活性，CYP2A7，CYP2A13皆无香豆素-7-羟化酶活性。CYP2A6 基因具有多态性，根据Daly对具有多态性的人CYP2D6等位基因的命名， 建议将CYP2A6野生型，CYP2A6V1和CYP2A6V2分别命名为CYP2A6.1，CYP2A6.2，CYP2A6.3[6]，CYP2A6.2由于一个碱基改变，Codon160 CTC(亮氨酸)变成CAC(组氨酸)，失去了香豆素-7-羟化酶活性。CYP2A6.3则由于野生型的CYP2A6基因外显子3，6，8与CYP2A7之间发生了基因交换[4]。CYP2A6.4则由于CYP2A6基因的缺失所引起，CYP2A6.4C因为CYP2A6基因的外显子1，8和9的缺失导致血小板活化因子拮抗药 (+)-顺-3,5-二甲基-2-(3-吡啶)噻唑烷-4-单-盐酸(SM-12502)的低代谢[7]。根据所克隆cDNA序列，除了codon479 GGC(甘氨酸)→GTC(缬氨酸)外，编码的氨基酸序列与CYP2A6的完全相同，并且具有CYP2A6的香豆素-7-羟化酶活性[8]。另外与Fernandez-Salguero等[4]报道的CYP2A7序列相比，codon479 皆为GTC(缬氨酸)，在3′端非编码区略有差异。与Yamano等[2]报道的CYP2A7序列相比3′端非编码区至所设PCR引物止，所克隆的基因序列完全相符，在编码区却差异较多。因此克隆的cDNA可能是一个新的CYP2A6 cDNA序列，有可能产生于CYP2A6-CYP2A7的交换。我们所克隆的cDNA 可能来自于新的CYP2A6等位基因的转录。
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致谢:感谢严乐勤同志对本实验的大力协助。
[基金项目] 国家自然科学基金资助 (No.39670801)； 浙江省自然科学基金资助 (No.396467)
Tel：0571-7217149； E-mail：ynyu@mail.hz.zj.cn
[参 考 文 献]
[1] Sawada M， Kamataki T. Genetically engineered cells stably expressing cytochrome P450 and their application to mutagen assays[J].Mutation Res, 1998,411:19-43.
[2] Yamano S, Tatsuno J, Gonzalez FJ. The CYP2A3 gene product catalyzes coumarin 7-hydroxylation in human livermicrosomes[J]. Biochemistry, 1990,29(5):1322-1329.
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[3] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T. Molecular Cloning, a Laboratory Manual[M]. 2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989. 1: 63-86.
[4] Fernandez-Salguero P, Hoffman SM, Cholerton S,et al. A genetic polymorphism in coumarin 7-hydroxylation: sequence of the human CYP2A genes and identification of variant CYP2A6 alleles[J]. Am J Hum Genet, 1995,57(3):651-660.
[5] Phillips IR, Shephard EA, Povey S,et al. A cytochrome P450 gene family mapped to human chromosome 19[J]. Ann Hum Genet, 1985,49(pt4):267-274.
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[6] Daly AK, Brockmoller J, Broly F, et al. Nomenclature for human CYP2D6 alleles[J]. Pharmacogenetics, 1996,6(3):193-201.
[7] Nunoya KI, Yokoi T, Kimura K, et al. A new CYP2A6 gene deletion responsible for the in vivo polymorphic metabolism of (+)-cis-3,5-dimethyl-2-(3-pyridyl)thiazolidin-4-one hydrochloride in humans[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1999, 289(1): 437-442.
[8] 严乐勤，余应年，诸葛坚，等. 人细胞色素P450 2A6 cDNA克隆及其在哺乳类细胞中的表达[J]. 中国药理学与毒理学杂志， 2000， 14(1)：31-35.
[收稿日期]1999-07-11
[修回日期]1999-10-07
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