低浓度MNNG引起vero细胞PKA途径激活及CREB磷酸化
作者：王谷亮 余应年 谢海洋
单位：浙江大学医学院病理生理学教研室，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010177
紫外线、离子辐射及烷化剂等理化因子不但能直接攻击DNA，还可能通过激活细胞内信号系统引起一系列后继的基因外事件，包括基因表达的改变。已经证明0.2 μmol/L MNNG能在vero细胞中引起DNA聚合酶β转录增加，而其启动子中能为转录因子CREB二聚体结合的CRE基序则被认为是转录激活所必需的。PKA等蛋白激酶能催化CREB丝氨酸-133的磷酸化并激活其转录活性。目的：验证我们所用的低浓度MNNG是否能在vero细胞中激活cAMP-PKA信号途径并引起转录因子CREB丝氨酸-133的磷酸化增加。方法：猴肾vero细胞用含10%(V/V)小牛血清的DMEM常规贴壁培养至处对数生长期、80%汇合时分组处理。用含0.2 μmol/L N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)的无血清DMEM培养基处理vero细胞，在所需时点裂解。用0.2%(V/V)二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂对照。分别用RIA法测量并计算每毫克总蛋白的细胞裂解液中的cAMP浓度，用ELISA法测量并计算每毫克总蛋白的PKA的活性，并分别用抗CREB和抗丝氨酸-133磷酸化CREB的抗体作免疫印迹(Western-印迹)法检测样品中CREB的磷酸化率。结果：①在vero细胞接受0.2 μmol/L MNNG处理0～330 min的各时点中，处理60 min时实验组细胞内cAMP浓度比对照组高1.406倍(P<0.05)。两组在其余各时点无显著差别。②用实验组和对照组PKA活性差值代表MNNG对PKA的激活。在处理0～150 min的时段中MNNG对PKA均有激活，高峰在60 min，实验组和对照组的PKA活性分别为1.103和0.086。③免疫印迹显示vero细胞经MNNG处理30～60 min时CREB丝氨酸-133的磷酸化率升高。高峰也在60 min，比对照组高2.08倍。④结论：本文确证了0.2 μmol/L MNNG可以在猴肾vero细胞中引起cAMP浓度上升、激活PKA及引起CREB丝氨酸-133的磷酸化水平上升。据我们所知，这是烷化剂引起细胞内cAMP、PKA激活直接数据的首次报道。而这三者变化的相同时相特点提示它们构成“cAMP-PKA-CREB通路”介入了细胞对低浓度MNNG的反应。cAMP-PKA信号激活的源信号来自何处，尚有待进一步研究。
国家教育部博士点基金(No.1999033557)； 国家自然科学基金(No. 39870684)资助, http://www.100md.com
单位：浙江大学医学院病理生理学教研室，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010177
紫外线、离子辐射及烷化剂等理化因子不但能直接攻击DNA，还可能通过激活细胞内信号系统引起一系列后继的基因外事件，包括基因表达的改变。已经证明0.2 μmol/L MNNG能在vero细胞中引起DNA聚合酶β转录增加，而其启动子中能为转录因子CREB二聚体结合的CRE基序则被认为是转录激活所必需的。PKA等蛋白激酶能催化CREB丝氨酸-133的磷酸化并激活其转录活性。目的：验证我们所用的低浓度MNNG是否能在vero细胞中激活cAMP-PKA信号途径并引起转录因子CREB丝氨酸-133的磷酸化增加。方法：猴肾vero细胞用含10%(V/V)小牛血清的DMEM常规贴壁培养至处对数生长期、80%汇合时分组处理。用含0.2 μmol/L N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)的无血清DMEM培养基处理vero细胞，在所需时点裂解。用0.2%(V/V)二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂对照。分别用RIA法测量并计算每毫克总蛋白的细胞裂解液中的cAMP浓度，用ELISA法测量并计算每毫克总蛋白的PKA的活性，并分别用抗CREB和抗丝氨酸-133磷酸化CREB的抗体作免疫印迹(Western-印迹)法检测样品中CREB的磷酸化率。结果：①在vero细胞接受0.2 μmol/L MNNG处理0～330 min的各时点中，处理60 min时实验组细胞内cAMP浓度比对照组高1.406倍(P<0.05)。两组在其余各时点无显著差别。②用实验组和对照组PKA活性差值代表MNNG对PKA的激活。在处理0～150 min的时段中MNNG对PKA均有激活，高峰在60 min，实验组和对照组的PKA活性分别为1.103和0.086。③免疫印迹显示vero细胞经MNNG处理30～60 min时CREB丝氨酸-133的磷酸化率升高。高峰也在60 min，比对照组高2.08倍。④结论：本文确证了0.2 μmol/L MNNG可以在猴肾vero细胞中引起cAMP浓度上升、激活PKA及引起CREB丝氨酸-133的磷酸化水平上升。据我们所知，这是烷化剂引起细胞内cAMP、PKA激活直接数据的首次报道。而这三者变化的相同时相特点提示它们构成“cAMP-PKA-CREB通路”介入了细胞对低浓度MNNG的反应。cAMP-PKA信号激活的源信号来自何处，尚有待进一步研究。
国家教育部博士点基金(No.1999033557)； 国家自然科学基金(No. 39870684)资助, http://www.100md.com