糖基化终产物促进培养的人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白-1
作者：郝锋 刘乃丰
单位：东南大学医学院第一附属医院心内科，江苏 南京 210009
关键词：
中国病理生理杂志001096
目的：糖尿病血管并发症如动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)等是糖尿病主要的致死致残原因。高血糖状态下非酶糖基化可使蛋白质最终形成不可逆的糖基化终产物(advanced glycosylation end products, AGEs)。糖尿病患者体内AGEs水平较正常人明显增高。动脉粥样斑块和泡沫细胞中均存在大量的AGEs，AGEs可与内皮细胞等多种细胞上受体结合，发挥生物学效应，加速粥样斑块的形成。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)由76个氨基酸组成，为趋化因子家族中的β超家族(即C-C亚家族)成员，能强力趋化单核细胞粘附于血管内皮并透入内皮下参与AS的形成。多种因素如血小板源性生长因子、肿瘤坏死因子等可使内皮细胞对MCP-1的表达增高。但AGEs对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical venous endothelial cell, HUVEC)中MCP-1表达的影响尚未见文献报道。方法：采用体外培养的HUVEC作为研究对象，并用Ⅷ因子免疫荧光测定作了鉴定。用不同浓度的葡萄糖和牛血清白蛋白体外孵育制备AGEs。分别用不同浓度的葡萄糖(0、20、50、80 mmol.L-1)制备的AGEs 200 mg.L-1对HUVEC干预24 h；用AGE-BSA(50 mmol.L-1， 200 mg.L-1)对HUVEC干预0、12、24、36 h；用AGEBSA(50 mmol.L-1， 200 mg.L-1)与Verapamil(10 μmol.L-1)共同干预HUVEC 24 h；以RT-PCR来检测细胞中MCP-1的mRNA水平；以Western blotting来检测其胞内蛋白质表达水平；以趋化实验检测其分泌的MCP-1活性。结果：1.AGEs的形成随葡萄糖浓度和孵育时间的增加而增加。2. HUVEC中MCP-1的mRNA、蛋白表达及由其趋化单核细胞迁移的距离所表示的活性均随制备AGEs的葡萄糖的浓度的增加而增加，以50 mmol.L-1时最明显(P<0.01)，80 mmol.L-1稍减弱(P<0.05)(迁移距离CTRL 28.80±4.23 μm,AGE50 45.00±3.84 μm,n=15)。PCR扩增产物测序，证实确实为MCP-1。3.上述指标亦随AGEs的干预时间延长而增高(P<0.01)(迁移距离CTRL 24.93±2.92 μm, AGE50/24 h45.00±3.84 μm, n=15)。4. 加用Verapamil后，能明显减弱AGE-BSA对MCP-1的表达的效应(P<0.05)(迁移距离AGE50+Ver 32.40±3.23 μm， AGE50 45.00±3.84 μm, n=15)。5.本实验中对MCP-1 mRNA表达检测部分亦发现氨基胍预处理能减弱AGEs的作用(P<0.05)。结论：AGEs作用明显增加内皮细胞MCP-1的表达，从而促进单核细胞聚集于内皮下，这可能是其致AS机制的一个重要方面，而且MCP-1的生成可能与细胞内钙离子浓度有关。, http://www.100md.com
单位：东南大学医学院第一附属医院心内科，江苏 南京 210009
关键词：
中国病理生理杂志001096
目的：糖尿病血管并发症如动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)等是糖尿病主要的致死致残原因。高血糖状态下非酶糖基化可使蛋白质最终形成不可逆的糖基化终产物(advanced glycosylation end products, AGEs)。糖尿病患者体内AGEs水平较正常人明显增高。动脉粥样斑块和泡沫细胞中均存在大量的AGEs，AGEs可与内皮细胞等多种细胞上受体结合，发挥生物学效应，加速粥样斑块的形成。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)由76个氨基酸组成，为趋化因子家族中的β超家族(即C-C亚家族)成员，能强力趋化单核细胞粘附于血管内皮并透入内皮下参与AS的形成。多种因素如血小板源性生长因子、肿瘤坏死因子等可使内皮细胞对MCP-1的表达增高。但AGEs对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical venous endothelial cell, HUVEC)中MCP-1表达的影响尚未见文献报道。方法：采用体外培养的HUVEC作为研究对象，并用Ⅷ因子免疫荧光测定作了鉴定。用不同浓度的葡萄糖和牛血清白蛋白体外孵育制备AGEs。分别用不同浓度的葡萄糖(0、20、50、80 mmol.L-1)制备的AGEs 200 mg.L-1对HUVEC干预24 h；用AGE-BSA(50 mmol.L-1， 200 mg.L-1)对HUVEC干预0、12、24、36 h；用AGEBSA(50 mmol.L-1， 200 mg.L-1)与Verapamil(10 μmol.L-1)共同干预HUVEC 24 h；以RT-PCR来检测细胞中MCP-1的mRNA水平；以Western blotting来检测其胞内蛋白质表达水平；以趋化实验检测其分泌的MCP-1活性。结果：1.AGEs的形成随葡萄糖浓度和孵育时间的增加而增加。2. HUVEC中MCP-1的mRNA、蛋白表达及由其趋化单核细胞迁移的距离所表示的活性均随制备AGEs的葡萄糖的浓度的增加而增加，以50 mmol.L-1时最明显(P<0.01)，80 mmol.L-1稍减弱(P<0.05)(迁移距离CTRL 28.80±4.23 μm,AGE50 45.00±3.84 μm,n=15)。PCR扩增产物测序，证实确实为MCP-1。3.上述指标亦随AGEs的干预时间延长而增高(P<0.01)(迁移距离CTRL 24.93±2.92 μm, AGE50/24 h45.00±3.84 μm, n=15)。4. 加用Verapamil后，能明显减弱AGE-BSA对MCP-1的表达的效应(P<0.05)(迁移距离AGE50+Ver 32.40±3.23 μm， AGE50 45.00±3.84 μm, n=15)。5.本实验中对MCP-1 mRNA表达检测部分亦发现氨基胍预处理能减弱AGEs的作用(P<0.05)。结论：AGEs作用明显增加内皮细胞MCP-1的表达，从而促进单核细胞聚集于内皮下，这可能是其致AS机制的一个重要方面，而且MCP-1的生成可能与细胞内钙离子浓度有关。, http://www.100md.com