内皮细胞功能紊乱的跨核被膜调控
作者：吴其夏
单位：中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所， 北京 100005
关键词：
中国病理生理杂志001019
一、细胞核被膜的结构和功能
真核细胞核被膜(NE)的外层膜与内质网连接，内层膜与核骨架连接，两层之间为核被膜间。两层膜在核孔复合体(NPC)融合。NPC为>100 MD的超大分子，由100多种不同蛋白成分组成，直径约130 nm。其中央孔道即核孔是已知的细胞胞浆和核浆之间唯一的直接交通通路，所有改变基因表达的细胞信号或核信号都必需通过核孔。静息状态其孔径约9 nm，转运时可达26 nm。<10 kD的小分子或离子可自由通过核孔转运；对>70 kD的大分子转运需要被转运分子的核定位序列或信号(NLS)和ATP水解提供能量；对10～70 kD的中等分子的转运不需要NLS和GTP，但与NE间隙的Ca2+贮存和NPC构象密切相关。转录因子向核内转位及与DNA靶序列结合还受磷酸化修饰及其相关激酶的调控。
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二、急、慢性血管疾病时内皮细胞功能紊乱
在急性和慢性血管损伤性疾病，如感染性休克、动脉粥样硬化、高血压、肺动脉高压、糖尿病血管并发症等发病过程中日益重视血管内皮细胞(VEC)的作用。相关致病因素，如内毒素、细胞因子、低密度脂蛋白、血管活性物质、高糖、高胰岛素原、低切应力等作用于VEC，导致其功能紊乱、甚至死亡、脱落。内皮细胞功能紊乱(endothelial cell dysfunction)包括：(1)氧化应激产生活性氧(ROS)引起膜脂质过氧化和DNA损伤；(2)合成和表达增强；(3)合成和分泌血管活性物质增加或减少，使血管平滑肌细胞(VSMC)过度收缩或舒张；(4)抗凝血和促纤溶活性降低，易形成血栓；(5)合成和分泌生长因子增加，促使VSMC增殖、移行和形成新内皮；(6)细胞骨架蛋白解聚和重组、细胞间缝隙形成、通透性升高。有人将细胞功能紊乱(或障碍)定义为舒张和收缩因素、抗凝和促凝因子，以及生长和抑制生长因子之间的平衡失调。内皮细胞功能紊乱出现于血管改变之前，是可逆的，因此研究和认识其发生发展规律，及其调控机制对防治血管损伤性疾病具有重要意义。
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三、内皮细胞功能紊乱各效应分子基因转录及其调控障碍
2年来我们在培养的VEC(人脐静脉内皮细胞HUVEC、细胞株ECV304)研究了内皮细胞功能紊乱的跨核被膜调控。
1.致病因素对内皮细胞功能紊乱相关活性蛋白表达及其转录的影响
(1)对粘附的影响：弱氧化修饰低密度脂蛋白(MM-LDL)，肿瘤坏死因子(TNFα)皆可使VEC与单核细胞U937粘附率增高，而血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)仅使粘附率轻度增高。ELISA检测结果，TNFα上调VEC三种粘附分子(VCAM-1，ICAM-1、P-selectin)的表达，而MM-LDL，AngⅡ无明显作用。提示MM-LDL、AngⅡ可能通过另外途径增强VEC与单核细胞粘附。另外，低切应力(2 dyn/cm2)振荡流作用于VEC 4 h. 18 h，皆使VCAM-1表达增加，而稳层流无类似作用。
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(2)对血凝的影响：用Northern Blot、RT-PCR方法观察到TNFα，AngⅡ使VEC表面组织因子(TF)活性增强，mRNA水平增高。VEC氧化应激产生活性氧，上调一氧化氮合酶(NOS)，但活性氧灭活NO，从而下调纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)，却上调VSMC合成PAI-1。
(3)对生长因子的影响：观察到TNFα上调VEC的血小板衍生生长因子B链(PDGF-B)蛋白表达量和mRNA水平。高脂血症、糖尿病、高血压等上调PDGF和内皮素(ET-1)，皆可能促使VSMC增殖、迁移。
(4)上调整合素β3亚基蛋白表达量和mRNA水平。并观察到VEC骨架排列紊乱，可能与内皮新生、凋亡、通透性有关。
2.病因素对内皮细胞转录调控的影响
本实验采用Western blot、免疫组化ABC、胶体金标记和电泳迁移率改变分析(EMSA)观察了转录因子NF-κB、AP-1、SP-1的核转位、以及与DNA靶序列结合的变化。
, 百拇医药
(1)TNFα、Ang Ⅱ使抗NF-κB抗体包被的胶体金颗粒在VEC胞浆的数目下降，在核浆内的数目上升，提示NF-κB向核内转位增加。用免疫组化ABC方法也获得同样结果，并观察到低切应力(2 dyn/cm2，4 h)无论是稳层流或是振荡流均能增加VEC的NF-κB向核内转位。
(2)采用Western blot或EMSA方法检测出TNFα、AngⅡ、MM-LDL作用于VEC，皆可促使NF-κB向核内转位增加，并与DNA靶序列结合增强。此外，还观察到Ang Ⅱ可提高AP-1、SP-1在VEC向核内转位，并提高VEC核抽提物与AP-1和SP-1相应通用型DNA序列的结合活性，但不如NF-κB明显。
3.顺式调控元件在致病因素激活目的基因转录调控中的作用
实验采用报告基因技术，以PDGF-B链基因为目的基因，重组构建了含人PDGF-B链基因不同长短上游序列的荧光素酶报告基因，与内参照质粒pSV-β-Gal共转染培养的VEC，检测致病因素作用下转染VEC荧光素酶比活性，观察5’上游序列的定向删切对致病因素诱导VEC PDGF-B链基因转录的影响。
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(1)TNFα处理重组报告基因质粒pSIS-1758/+43 Luc转染VEC、荧光素酶的表达增加，呈剂量依赖性和时间依赖性。TNF α可使pSIS-402/43 Luc、 pSIS-189/+43 Luc转染VEC荧光素酶量明显增加，而对pSIS-84/+43 luc和pSIS-52/+43 luc转染VEC荧光素酶表达量无明显影响，提示PDFG-B链基因上游序列-189/-85 bp范围内存在TNFα诱导反应的顺式调控元件。
(2)MM-LDL(100 μg/mL、 18 h)可使pSIS-189/+43 Luc转染VEC荧光素酶表达量增加，而对只带有核心序列的报告基因质粒pSIS-52/+43 Luc转染VEC荧光素酶表达量无影响，提示PDGF-B链基因上游序列-189/-53bp范围内存在MM-LDL诱导反应的顺式调控元件。已知在PDGF-B链基因5′侧调控序列位于-162/-157bp处的GAGACC是切应力反应元件(SSRE)的关键序列，它能结合反式作用因子NF-κB p50-p65二聚体。SSRE可能是参与调节VEC基因表达比较普遍的分子机制之一。
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4.致病因素影响内皮细胞基因转录调整的机制
(1)蛋白磷酸化修饰 本项目组研究TNF α、MM-LDL作用于PDGF-B链基因报告基因质粒pSIS-189/+43 Luc转染的VEC，皆可使荧光素酶活性显著增加。加入变异NIK(mut-NIK)，能显著降低荧光素酶活性。加入变异的IKKβ(mut-IKKβ)也获得同样的结果。而加入变异的IKKα(mut-IKKα)无明显作用。提示MM-LDL，TNFα作用于培养的VEC，可通过NIK和IKKβ对蛋的磷酸化作用激活NF-κB，促进PDGF-B链基因转录。其他蛋白激酶对蛋白的磷酸化修饰是否参与调控此反应，有待进一步研究。
(2)细胞Ca2+的调控作用。许多细胞外刺激使胞内Ca2+浓度升高，引起各种转录反应，细胞Ca2+途径是普遍的信号转导机制，已鉴定出三种钙反应元件，尚缺乏VEC Ca2+参与调控靶基因转录的文献资料。
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我们初步观察到TNFα(200 U/mL)作用于VEC使[Ca2+]i和[Ca2+]n升高，同时使pSIS-1758+43 Luc转染的VEC的荧光素酶比活性升高。用钙通道阻断剂Nimodipine使TNFα诱导的[Ca2+]i和[Ca2+]n升高下降到刺激前水平，同时使荧光素酶比活性也下降到对照组水平。提示细胞Ca2+可能通过PDGF-B链基因5’上游DNA序列调控TNFα诱导的PDGF-B链基因转录。关于VEC Ca2+直接或间接通过靶基因上游钙反应元件(CaRE)、cAMP反应元件(CRE)，血清反应元件(SRE)激活基因转录，有待进一步研究。
四、本研究的意义和前景
1.急、慢性血管疾病相关致病因素作用于血管内皮细胞，使其合成和分泌各种效应分子增加或减少，导致内皮细胞功能紊乱。其中转录因子与效应分子基因5’上游顺式调控元件结合，活化基因转录是重要发病环节。这与蛋白磷酸化修饰和细胞Ca2+调控有关。
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2.应强调在结构基因学的基础上研究基因转录及其跨核被膜调控在内皮细胞功能紊发病机制中的作用的重要性和迫切性。即病理生理学将“赋”序列以功能。
3.不同致病因素对VEC基因转录的影响存在异同点；应重视研究转录因子与调控元件相互作用的“专一性”(特异性)，同时重视调控元件相互之间的“协同作用”；重视转录辅因子在基因转录活化中的作用。
4.本项研究将有助于探索新的防治重要血管疾病的途径。以特异性反式作用因子为靶物，采用靶向阻断的治疗措施；以特异性顺式调控元件为靶，采用“诱饵”反基因治疗策略；也可能通过蛋白磷酸化和去磷酸化或细胞Ca2+转运调控靶基因转录，从而调整内皮细胞功能。, http://www.100md.com
单位：中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所， 北京 100005
关键词：
中国病理生理杂志001019
一、细胞核被膜的结构和功能
真核细胞核被膜(NE)的外层膜与内质网连接，内层膜与核骨架连接，两层之间为核被膜间。两层膜在核孔复合体(NPC)融合。NPC为>100 MD的超大分子，由100多种不同蛋白成分组成，直径约130 nm。其中央孔道即核孔是已知的细胞胞浆和核浆之间唯一的直接交通通路，所有改变基因表达的细胞信号或核信号都必需通过核孔。静息状态其孔径约9 nm，转运时可达26 nm。<10 kD的小分子或离子可自由通过核孔转运；对>70 kD的大分子转运需要被转运分子的核定位序列或信号(NLS)和ATP水解提供能量；对10～70 kD的中等分子的转运不需要NLS和GTP，但与NE间隙的Ca2+贮存和NPC构象密切相关。转录因子向核内转位及与DNA靶序列结合还受磷酸化修饰及其相关激酶的调控。
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二、急、慢性血管疾病时内皮细胞功能紊乱
在急性和慢性血管损伤性疾病，如感染性休克、动脉粥样硬化、高血压、肺动脉高压、糖尿病血管并发症等发病过程中日益重视血管内皮细胞(VEC)的作用。相关致病因素，如内毒素、细胞因子、低密度脂蛋白、血管活性物质、高糖、高胰岛素原、低切应力等作用于VEC，导致其功能紊乱、甚至死亡、脱落。内皮细胞功能紊乱(endothelial cell dysfunction)包括：(1)氧化应激产生活性氧(ROS)引起膜脂质过氧化和DNA损伤；(2)合成和表达增强；(3)合成和分泌血管活性物质增加或减少，使血管平滑肌细胞(VSMC)过度收缩或舒张；(4)抗凝血和促纤溶活性降低，易形成血栓；(5)合成和分泌生长因子增加，促使VSMC增殖、移行和形成新内皮；(6)细胞骨架蛋白解聚和重组、细胞间缝隙形成、通透性升高。有人将细胞功能紊乱(或障碍)定义为舒张和收缩因素、抗凝和促凝因子，以及生长和抑制生长因子之间的平衡失调。内皮细胞功能紊乱出现于血管改变之前，是可逆的，因此研究和认识其发生发展规律，及其调控机制对防治血管损伤性疾病具有重要意义。
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三、内皮细胞功能紊乱各效应分子基因转录及其调控障碍
2年来我们在培养的VEC(人脐静脉内皮细胞HUVEC、细胞株ECV304)研究了内皮细胞功能紊乱的跨核被膜调控。
1.致病因素对内皮细胞功能紊乱相关活性蛋白表达及其转录的影响
(1)对粘附的影响：弱氧化修饰低密度脂蛋白(MM-LDL)，肿瘤坏死因子(TNFα)皆可使VEC与单核细胞U937粘附率增高，而血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)仅使粘附率轻度增高。ELISA检测结果，TNFα上调VEC三种粘附分子(VCAM-1，ICAM-1、P-selectin)的表达，而MM-LDL，AngⅡ无明显作用。提示MM-LDL、AngⅡ可能通过另外途径增强VEC与单核细胞粘附。另外，低切应力(2 dyn/cm2)振荡流作用于VEC 4 h. 18 h，皆使VCAM-1表达增加，而稳层流无类似作用。
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(2)对血凝的影响：用Northern Blot、RT-PCR方法观察到TNFα，AngⅡ使VEC表面组织因子(TF)活性增强，mRNA水平增高。VEC氧化应激产生活性氧，上调一氧化氮合酶(NOS)，但活性氧灭活NO，从而下调纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)，却上调VSMC合成PAI-1。
(3)对生长因子的影响：观察到TNFα上调VEC的血小板衍生生长因子B链(PDGF-B)蛋白表达量和mRNA水平。高脂血症、糖尿病、高血压等上调PDGF和内皮素(ET-1)，皆可能促使VSMC增殖、迁移。
(4)上调整合素β3亚基蛋白表达量和mRNA水平。并观察到VEC骨架排列紊乱，可能与内皮新生、凋亡、通透性有关。
2.病因素对内皮细胞转录调控的影响
本实验采用Western blot、免疫组化ABC、胶体金标记和电泳迁移率改变分析(EMSA)观察了转录因子NF-κB、AP-1、SP-1的核转位、以及与DNA靶序列结合的变化。
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(1)TNFα、Ang Ⅱ使抗NF-κB抗体包被的胶体金颗粒在VEC胞浆的数目下降，在核浆内的数目上升，提示NF-κB向核内转位增加。用免疫组化ABC方法也获得同样结果，并观察到低切应力(2 dyn/cm2，4 h)无论是稳层流或是振荡流均能增加VEC的NF-κB向核内转位。
(2)采用Western blot或EMSA方法检测出TNFα、AngⅡ、MM-LDL作用于VEC，皆可促使NF-κB向核内转位增加，并与DNA靶序列结合增强。此外，还观察到Ang Ⅱ可提高AP-1、SP-1在VEC向核内转位，并提高VEC核抽提物与AP-1和SP-1相应通用型DNA序列的结合活性，但不如NF-κB明显。
3.顺式调控元件在致病因素激活目的基因转录调控中的作用
实验采用报告基因技术，以PDGF-B链基因为目的基因，重组构建了含人PDGF-B链基因不同长短上游序列的荧光素酶报告基因，与内参照质粒pSV-β-Gal共转染培养的VEC，检测致病因素作用下转染VEC荧光素酶比活性，观察5’上游序列的定向删切对致病因素诱导VEC PDGF-B链基因转录的影响。
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(1)TNFα处理重组报告基因质粒pSIS-1758/+43 Luc转染VEC、荧光素酶的表达增加，呈剂量依赖性和时间依赖性。TNF α可使pSIS-402/43 Luc、 pSIS-189/+43 Luc转染VEC荧光素酶量明显增加，而对pSIS-84/+43 luc和pSIS-52/+43 luc转染VEC荧光素酶表达量无明显影响，提示PDFG-B链基因上游序列-189/-85 bp范围内存在TNFα诱导反应的顺式调控元件。
(2)MM-LDL(100 μg/mL、 18 h)可使pSIS-189/+43 Luc转染VEC荧光素酶表达量增加，而对只带有核心序列的报告基因质粒pSIS-52/+43 Luc转染VEC荧光素酶表达量无影响，提示PDGF-B链基因上游序列-189/-53bp范围内存在MM-LDL诱导反应的顺式调控元件。已知在PDGF-B链基因5′侧调控序列位于-162/-157bp处的GAGACC是切应力反应元件(SSRE)的关键序列，它能结合反式作用因子NF-κB p50-p65二聚体。SSRE可能是参与调节VEC基因表达比较普遍的分子机制之一。
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4.致病因素影响内皮细胞基因转录调整的机制
(1)蛋白磷酸化修饰 本项目组研究TNF α、MM-LDL作用于PDGF-B链基因报告基因质粒pSIS-189/+43 Luc转染的VEC，皆可使荧光素酶活性显著增加。加入变异NIK(mut-NIK)，能显著降低荧光素酶活性。加入变异的IKKβ(mut-IKKβ)也获得同样的结果。而加入变异的IKKα(mut-IKKα)无明显作用。提示MM-LDL，TNFα作用于培养的VEC，可通过NIK和IKKβ对蛋的磷酸化作用激活NF-κB，促进PDGF-B链基因转录。其他蛋白激酶对蛋白的磷酸化修饰是否参与调控此反应，有待进一步研究。
(2)细胞Ca2+的调控作用。许多细胞外刺激使胞内Ca2+浓度升高，引起各种转录反应，细胞Ca2+途径是普遍的信号转导机制，已鉴定出三种钙反应元件，尚缺乏VEC Ca2+参与调控靶基因转录的文献资料。
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我们初步观察到TNFα(200 U/mL)作用于VEC使[Ca2+]i和[Ca2+]n升高，同时使pSIS-1758+43 Luc转染的VEC的荧光素酶比活性升高。用钙通道阻断剂Nimodipine使TNFα诱导的[Ca2+]i和[Ca2+]n升高下降到刺激前水平，同时使荧光素酶比活性也下降到对照组水平。提示细胞Ca2+可能通过PDGF-B链基因5’上游DNA序列调控TNFα诱导的PDGF-B链基因转录。关于VEC Ca2+直接或间接通过靶基因上游钙反应元件(CaRE)、cAMP反应元件(CRE)，血清反应元件(SRE)激活基因转录，有待进一步研究。
四、本研究的意义和前景
1.急、慢性血管疾病相关致病因素作用于血管内皮细胞，使其合成和分泌各种效应分子增加或减少，导致内皮细胞功能紊乱。其中转录因子与效应分子基因5’上游顺式调控元件结合，活化基因转录是重要发病环节。这与蛋白磷酸化修饰和细胞Ca2+调控有关。
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2.应强调在结构基因学的基础上研究基因转录及其跨核被膜调控在内皮细胞功能紊发病机制中的作用的重要性和迫切性。即病理生理学将“赋”序列以功能。
3.不同致病因素对VEC基因转录的影响存在异同点；应重视研究转录因子与调控元件相互作用的“专一性”(特异性)，同时重视调控元件相互之间的“协同作用”；重视转录辅因子在基因转录活化中的作用。
4.本项研究将有助于探索新的防治重要血管疾病的途径。以特异性反式作用因子为靶物，采用靶向阻断的治疗措施；以特异性顺式调控元件为靶，采用“诱饵”反基因治疗策略；也可能通过蛋白磷酸化和去磷酸化或细胞Ca2+转运调控靶基因转录，从而调整内皮细胞功能。, http://www.100md.com