硒缺乏和训练对雄性大鼠血清睾酮的影响
作者：方子龙 冯炜权△ 杨则宜 伊木清 郭建军 谢敏豪
单位：方子龙 杨则宜 伊木清 郭建军 谢敏豪 (国家体育总局运动医学研究所(北京100029))；冯炜权 (北京体育大学)
关键词：硒；训练；睾酮；皮质酮；促性腺激素；LH/hCG受体
中国运动医学杂志990109 提要 通过建立硒缺乏运动模型，结合游泳训练，观察硒缺乏和运动训练对雄性大鼠血清睾酮的影响。结果显示：①用低硒饲料喂养7周的大鼠的血清硒含量明显低于用补硒饲料喂养的大鼠。②缺硒安静大鼠的睾丸硒含量低于补硒安静大鼠，但降低的幅度比血清硒降低的幅度小，训练使缺硒大鼠的睾丸硒含量明显升高。③硒缺乏和训练均使大鼠的血清睾酮和游离睾酮水平降低，这种降低与血清的促性腺激素(rLH和rFSH)水平无关，与睾丸Leydig细胞膜上的LH/hCG受体的亲和性及结合容量无关。④硒缺乏和训练均不影响血清的皮质酮水平，睾酮/皮质酮比值和游离睾酮/皮质酮比值的降低，主要是因为睾酮和游离睾酮的降低而引起的。
, 百拇医药
Effects of Selenium Deficient Diet and Training on
Concentration of Serum Testosterone in Male Rats
Fang Zilong,Feng Weiquan,Yang Zeyi,et al
National Research Institute of Sports Medicine
The propose of the present study was to research the effects of selenium deficient diet and training on the concentration of serum testosterone in male rats.The results showed: 1. The serum selenium content in selenium deficient diet rats was significantly lower than that in selenium sufficient diet rats. 2.In sedentary rats,the testis selenium content in seleniumm deficient diet group was significantly lower than that in selenium sufficient diet group.The decrease of the selenium content in testis was not so sharp as in serum.Training could increase the testis selenium content in selenium deficient diet rat.3.The concentrations of testosterone and free testosterone in serum were significantly decreased because of the selenium deficient diet and training.The decreases of androgens were not related to the concentrations of gonadotropins(rLH and rFSH) in serum and the LH/hCG receptor in Leydig cells.4.Selenium deficient diet and training did not change the concentration of corticosterone in serum.The decreases of the ratios of testosterone to corticosterone and free testosterone to corticosterone were mainly related to the decrease of the concentrations of testosterone and free testosterone in serum.
, 百拇医药
Key words: Selenium,Training,Testosterone,Corticosterone,Gonadotropin,LH/hCG receptor
睾酮是对运动起重要作用的一种激素，睾酮水平的降低会对运动产生一定的负面影响。长时间、大强度训练造成的睾酮水平降低，到一定程度就会出现一系列体能下降的疲劳反应，有人称之为“内分泌性疲劳”。硒作为人和动物体内的一种必需微量元素，具有重要的生理和生化功能。有研究表明，硒在睾丸中不仅与抗氧化和精子生成有关，还可能对甾体激素的合成分泌发挥重要作用[1]。本研究目的是建立硒缺乏动物模型，观察硒缺乏和运动训练对睾酮水平的影响。
1材料与方法
1.1 饲料配制
低硒饲料(硒含量0.010mg/kg饲料)的原料来自黑龙江省尚志市和齐齐哈尔市的克山病区，参考中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所的配方配制：小麦粉20%、玉米粉38%、黄豆粉25%、大米粉15%、混合盐1%、花生油1%、鱼肝油50mg/kg、维生素E 150mg/kg[2]。在低硒饲料中添加硒酸钠制成补硒饲料(硒含量0.186mg/kg饲料，在正常需要量范围内)。
, 百拇医药
1.2 动物分组
雄性成年Wistar大鼠40只，按体重随机分为4个组：①缺硒训练组(Se-Tr+)10只②缺硒安静组(Se-Tr-)10只③补硒训练组(Se+Tr+)10只④补硒安静组(Se+Tr-)10只。自由进水(自来水中硒未检出)，喂饲不同硒含量的饲料。训练组进行游泳训练，室温为25±2℃，每日光照时间为14小时。
1.3 训练方式
在大鼠流动水游泳池中进行游泳训练。水深为45～55cm，水温为30±1℃，水流量为4m3/小时。共训练7周，每周5天，训练时间从每天30分钟逐渐增加至60分钟。
1.4 样品收集
, 百拇医药
在最后一次训练结束60小时后，处死大鼠。取血，分离血清；取睾丸，用液氮冷冻。血清及睾丸样品置-70℃冰箱中保存待测。
1.5 测试指标
1.5.1 硒含量 用荧光法测定血清硒和睾丸硒含量[3]。
1.5.2 血清激素 用放射免疫分析法测定睾酮(T)、游离睾酮(FT)、皮质酮(rC)、黄体生成素(rLH)和卵泡刺激素(rFSH)。
1.5.3 LH/hCG受体分析[4]
1.5.3.1 睾丸组织细胞膜制备 取睾丸，去除被膜，按1∶5(W∶V)加入缓冲液进行匀浆，匀浆液1000×g离心10分钟，取上清液，17000×g离心30分钟，沉淀按1∶20(W∶V)加入缓冲液，用超声波混匀，制成膜受体制剂。整个操作过程在4℃中进行。
, 百拇医药
1.5.3.2 放射受体分析 用饱和法，以125I-hCG(放射比活度为62.5μCi/μg)为配基。每管加入膜受体制剂100μl,125I_hCG(2-30×104cpm)100μl，非特异结合管中另加入hCG粗品100μl(200IU)，用缓冲液将各管体积补足至400μl。振荡混匀，置30℃水浴90分钟。加入分离剂，混匀后静置15分钟，2500×g离心15分钟，测定各管总放射性及沉淀放射性。用Woolf模型计算受体的解离常数(Kd)和最大结合量(Bmax)。
1.5.4 蛋白含量 用双缩脲法测定睾丸匀浆液的蛋白含量。
1.6 统计分析
数据用均值±标准差表示，进行双因素方差分析(ANOVA)，主要因素为硒和训练，当方差分析显示有显著性差异时，用Duncan's多范围比较法进行各组均值的比较，显著性差异水平α=0.05。
, 百拇医药
2 结果
2.1 硒缺乏和训练对血清硒和睾丸硒含量的影响
无论是安静组或训练组，缺硒大鼠的血清硒含量明显低于相应的补硒大鼠。无论是缺硒组或补硒组，训练大鼠的血清硒含量与相应的安静大鼠相比，无明显差异(表1)。缺硒安静组的睾丸硒含量明显低于补硒安静组和缺硒训练组；而补硒安静组的睾丸硒含量与补硒训练组相比，无明显差异(表1)。
表1 硒缺乏和训练对血清硒和睾丸硒含量的影响
Table 1 Effects of selenium deficient diet and training on selenium content in serum and testis 组别
Groups
, 百拇医药 血清硒
Serum selenium
(μg/ml)
睾丸硒
Testis selenium
(μg/g.wet weight)
缺硒训练组
Se-Tr+
0.17±0.06(7)*
0.83±0.17(9)#
缺硒安静组
, http://www.100md.com
Se-Tr-
0.10±0.03(10)*
0.69±0.07(9)*
补硒训练组
Se+Tr+
0.57±0.11(10)
0.84±0.11(9)
补硒安静组
Se+Tr-
0.64±0.21(9)
, 百拇医药
0.86±0.09(9)
*:与相应的补硒组相比，有显著差异，p<0.05
Compared with selenium sufficient group,p<0.05
#:与相应的安静组相比，有显著差异，p<0.05
Compared with sedentary group,p<0.05
(括号中的数字为每组样品数)
(Number in bracket shows the samples for the group)
2.2 硒缺乏和训练对血清激素水平的影响
, http://www.100md.com
硒缺乏和训练对rLH、rFSH和rC的水平均无明显影响。缺硒安静组的T水平明显低于补硒安静组。训练使T水平降低，在补硒组有显著性差异。FT与T有相似的变化(表2)。缺硒安静组的T/rC比值明显低于补硒安静组。训练使T/rC比值降低，在补硒组有显著性差异。FT/rC与T/rC有相似的变化(表3)。
表2 硒缺乏和训练对血清激素水平的影响
Table 2 Effects of selenium deficient diet and training on hormone concentrations in serum 组别
Groups
黄体生成素
rLH(ng/ml)
卵泡刺激素
, 百拇医药
rFSH(ng/ml)
睾 酮
T(ng/dl)
游离睾酮
FT(pg/ml)
皮质酮
rC(ng/ml)
缺硒训练组
Se-Tr+
1.70±0.48(9)
9.59±6.66(7)
, http://www.100md.com 46.74±40.89(7)
1.96±2.00(8)
326.56±130.51(10)
缺硒安静组
Se-Tr-
1.95±0.52(10)
12.81±7.73(8)
71.79±61.41(10)*
2.67±2.76(9)*
338.26±150.10(10)
, 百拇医药 补硒训练组
Se+Tr+
1.64±0.57(9)
8.63±4.05(9)
41.85±25.29(8)#
1.50±1.42(8)#
269.95±119.08(10)
补硒安静组
Se+Tr-
1.58±0.40(9)
, 百拇医药 12.36±5.73(6)
212.29±170.14(9)
10.99±10.12(9)
313.71±163.20(10)
*:与相应的补硒组相比，有显著差异，p<0.05 Compared with selenium sufficient group,p<0.05
#:与相应的安静组相比，有显著差异，p<0.05 Compared with sedentary group,p<0.05
(括号中的数字为每组样品数) (Number in bracket shows the samples for the group)表3 硒缺乏和训练对血清激素比值的影响
, 百拇医药
Table 3 Effects of selenium deficient diet and training on T/rC and FT/rC in serum 组别
Groups
睾酮/皮质酮
T/rC(×10-3)
游离睾酮/皮质酮
FT/rC(×10-6)
缺硒训练组
Se-Tr+
1.06±0.60(7)
, 百拇医药
4.35±3.14(7)
缺硒安静组
Se-Tr-
2.28±1.60(10)*
9.60±8.38(9)*
补硒训练组
Se+Tr+
2.40±2.44(8)#
4.77±4.06(9)#
补硒安静组
, 百拇医药
Se+Tr-
6.80±7.09(8)
21.08±17.65(7)
*:与相应的补硒组相比，有显著差异，p<0.05
Compared with selenium sufficient group,p<0.05
#:与相应的安静组相比，有显著差异，p<0.05
Compared with sedentary group,p<0.05
(括号中的数字为每组样品数)
(Number in bracket shows the samples for the group)
, http://www.100md.com
2.3 硒缺乏和训练对睾丸LH/hCG受体的影响
硒缺乏和训练对LH/hCG受体的解离常数(Kd)和最大结合量(Bmax)均无明显影响(表4)。
表4 硒缺乏和训练对睾丸LH/hCG受体的影响
Table 4 Effects of selenium deficient diet and training on LH/hCG receptor in testis 组别
Groups
解离常数
Kd(pmol/l)
最大结合量
, 百拇医药
Bmax(fmol/mg pro)
缺硒训练组
Se-Tr+
52.99±35.27(8)
2.91±1.66(8)
缺硒安静组
Se-Tr-
57.76±31.46(8)
1.61±0.54(8)
补硒训练组
, 百拇医药
Se+Tr+
63.16±18.50(8)
2.15±0.73(8)
补硒安静组
Se+Tr-
48.74±24.99(8)
2.66±1.40(8)
(括号中的数字为每组样品数)
(Number in bracket shows the samples for the group)
, 百拇医药 3 讨论
硒营养是影响血清硒含量的重要因素。血清硒含量反映机体近期的硒营养状况，受硒摄入量的影响。用低硒饲料喂养的大鼠的血清硒含量明显低于用补硒饲料喂养的大鼠，表明硒缺乏动物模型的建立是成功的。
缺硒安静组的睾丸硒含量明显低于补硒安静组。Behne发现，缺硒大鼠睾丸中硒含量与对照组相比，无明显差异；而相应的血浆硒含量，缺硒组降低了79%[5]。我们结果与其相似，缺硒安静组的睾丸硒含量仅比补硒安静组降低20%，而血清硒含量却降低84%。我们还发现缺硒训练组的睾丸硒含量明量高于硒安静组，与补硒组水平相当，表明训练可使缺硒大鼠的睾丸硒需要量增加。这些结果支持Behne的观点，即体内存在硒优先供给睾丸等组织的调节机制，需要时会把硒从其它部位转移到睾丸中，以维持其正常的生理功能。
缺硒安静组的血清睾酮和游离睾酮水平明显低于补硒安静组，而且缺硒安静组的睾丸硒含量也明显低于补硒安静组，两组的促性腺激素(rLH和rFSH)水平均无明显差异。结果提示：睾丸硒含量的降低与睾酮水平的降低有一定的关系。Behne认为，除了在精子形成中起重要作用外，硒似乎与睾丸的其它功能也有关。用低硒饲料喂养5个月后，大鼠的血清睾酮水平低于用正常硒含量的饲料喂养的对照组，表明硒与睾丸Leydig细胞的甾体生成功能有关。而且这种关系并不表现在下丘脑-垂体环节，而是在睾丸本身，因为用LHRH刺激垂体释放LH和FSH，未发现缺硒组和对照组的LH水平的差异，但睾酮的分泌存在差异。给予LHRH 2小时后，用低硒饲料喂养170天的大鼠的血清睾酮水平的升幅低于用正常硒含量的饲料喂养的对照组。为了确定对睾酮生成影响的作用部位，直接用LH(以hCG形式)刺激睾丸，得到相似的结果，低硒组和对照组血清睾酮的升高有统计学上显著差异。结果表明，硒缺乏对睾丸Leydig细胞有影响，并提示硒在甾体生成上的生物学作用[1]。LH对睾丸Leydig细胞膜上的LH/hCG受体结合，通过第二信使cAMP，刺激睾酮合成。受体对激素的亲和性和受体的数目对LH发挥其作用均有影响。我们的结果并未发现缺硒大鼠睾丸的LH/hCG受体的解离常数(Kd)和最大结合量(Bmax)与补硒组有明显差异，表明硒缺乏造成的睾酮分泌减少的作用部位可能在受体后的环节，其作用机制尚不清楚。
, http://www.100md.com
有研究表明，长期大强度训练能使血清睾酮水平降低。关于运动性低睾酮的机制，存在不同的解释，多数学者认为是睾丸本身的功能障碍所致。Adlercreutz对运动大鼠的研究发现，当血清的睾酮水平极度降低时，睾丸中的睾酮、雄烯二酮和孕酮水平也显著降低，而血清的LH水平无明显变化，表明血清睾酮水平降低是由于睾丸中产生睾酮量减少所致，睾丸中贮存的睾酮的排空和睾酮-LH反馈机制对此无明显作用[6]。Harkonen报道，对大鼠进行8周的跑台训练，未发现血清睾酮、皮质酮和LH水平的变化，睾丸LH/hCG受体的含量也未见变化[7]。我们的结果表明，经过7周的游泳训练，缺硒组和补硒组的血清睾酮和游离睾酮水平有不同程度的降低，rLH和rFSH水平却无明显变化，提示训练造成低睾酮的作用部位可能不在垂体而在睾丸，即由于睾丸本身的功能障碍所致。与Harkonen的结果相比，本实验采用的训练方式造成了大鼠的睾酮水平降低，但对LH/hCG受体的解离常数(Kd)和最大结合量(Bmax)仍无影响，提示其作用部位可能是在受体后的环节，这一点与硒缺乏造成的睾酮水平降低相似。
, 百拇医药
关于运动性低睾酮与糖皮质激素的关系，研究结果不尽相同。Roberts观察到，过度训练可使血清的睾酮降低，皮质酮升高，二者的变化呈高度负相关(R=-0.92)[8]。Vervoorn报道，6名高水平划船运动员经过9个月的大运动量训练后，血清游离睾酮/皮质酮比值下降了5%～50%[9]。Flynn报道，游泳训练的负荷增加，导致血清睾酮和游离睾酮水平降低，而皮质酮、睾酮/皮质酮和游离睾酮/皮质酮比值则变化不明显[10]。Steinacker发现，高负荷训练使划船运动员的血清游离睾酮降低，但皮质酮基本不变[11]。我们的结果发现，训练并未对血清皮质酮有明显影响，睾酮/皮质酮和游离睾酮/皮质酮比值的降低主要是因为睾酮和游离睾酮的降低而引起的。与此相类似，硒缺乏也不影响血清皮质酮水平，睾酮/皮质酮和游离睾酮/皮质酮比值的降低主要是因为睾酮和游离睾酮的降低而引起的。
4 小结
, http://www.100md.com 本研究通过对雄性大鼠进行7周不同硒营养的喂养，结合游泳训练，观察硒缺乏和训练对大鼠睾酮水平的影响，小结如下。
4.1 用低硒饲料喂养的大鼠血清硒含量明显低于用补硒饲料喂养的大鼠，表明硒缺乏动物模型的建立是成功的。
4.2 缺硒安静大鼠的睾丸硒含量低于补硒安静大鼠，但降低的幅度比血清硒降低的幅度小，训练使缺硒大鼠睾丸硒含量明显升高，表明体内存在硒优先供给睾丸等组织的调节机制，需要时会把硒从其它部位转移到睾丸中，以维持其正常的生理功能。
4.3 硒缺乏和游泳训练均可使血清睾酮和游离睾酮水平降低，这种降低与垂体促性腺激素(rLH和rFSH)水平无关，与睾丸Ldydig细胞膜上的LH/hCG受体的亲和性及结合容量无关。
4.4 硒缺乏和游泳训练均不影响血清皮质酮水平，睾酮/皮质酮和游离睾酮/皮质酮比值的降低，主要是因为睾酮和游离睾酮的降低而引起的。
, 百拇医药
* 本文为北京体育大学硕士学位论文，参加了第5届全国体育科学大会交流。
5 参考文献
[1]Behne D,et al.Selenium and hormones in the male reproductive system.Selenium in biology and medicine.Part B(Combs Jr.GF,et al.eds) 1987,pp 733,AVI New York.
[2]伊木清等.硒碘营养状态对大鼠甲状腺和大脑谷胱苷肽过氧化物酶活力的影响.营养学报.1996，18(1)：65.
[3]李茂忠等.微量荧光法测定血清、头发及奶粉中痕量硒.中国公共卫生学报.1991，10(5)：306.
[4]曹泽毅主编.激素受体及其临床应用(第1版).北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1993，pp131.
, 百拇医药
[5]Behne D,et al.Selenium in the testis of the rat:Studies on its regulation and its importance for the organism.J Nutr.1982,112:1682.
[6]Adlercreutz H,et al.Effect of training on plasma anabolic and catabolic steroid hormones and their response during physical exercise.Int J Sports Med.1986,7:27 Supplement.
[7]Harkonen H,et al.Pituitary and gonadal function during physical exercise in the male rat.J Steroid Biochem.1990,35(1):127.
, http://www.100md.com
[8]Roberts AC,et al.Overstraining affects male reproductive status.Fertility and Sterility.1993,60:686.
[9]Vervoon C,et al.The behavior of the plasma free testosterone/cortisol ratio during a season of elite rowing training.Int J Sports Med 1991,12:257.
[10]Flynn MG,et al.Indices of training stress during competitive running and swimming seasons.Int J Sports Med 1994,15:261.
[11]Steinacker JM,et al.Metabolic and hormonal reaction during training in junior oarsman.Int J Sports Med 1993,14:s24.
[感谢美国国家糖尿病、消化系统和肾脏病研究所(NIDDK)惠赠大鼠rLH和rFSH检测试剂]
(第一作者：方子龙，男，34岁，助理研究员)
(1997.12.12收稿), 百拇医药
单位：方子龙 杨则宜 伊木清 郭建军 谢敏豪 (国家体育总局运动医学研究所(北京100029))；冯炜权 (北京体育大学)
关键词：硒；训练；睾酮；皮质酮；促性腺激素；LH/hCG受体
中国运动医学杂志990109 提要 通过建立硒缺乏运动模型，结合游泳训练，观察硒缺乏和运动训练对雄性大鼠血清睾酮的影响。结果显示：①用低硒饲料喂养7周的大鼠的血清硒含量明显低于用补硒饲料喂养的大鼠。②缺硒安静大鼠的睾丸硒含量低于补硒安静大鼠，但降低的幅度比血清硒降低的幅度小，训练使缺硒大鼠的睾丸硒含量明显升高。③硒缺乏和训练均使大鼠的血清睾酮和游离睾酮水平降低，这种降低与血清的促性腺激素(rLH和rFSH)水平无关，与睾丸Leydig细胞膜上的LH/hCG受体的亲和性及结合容量无关。④硒缺乏和训练均不影响血清的皮质酮水平，睾酮/皮质酮比值和游离睾酮/皮质酮比值的降低，主要是因为睾酮和游离睾酮的降低而引起的。
, 百拇医药
Effects of Selenium Deficient Diet and Training on
Concentration of Serum Testosterone in Male Rats
Fang Zilong,Feng Weiquan,Yang Zeyi,et al
National Research Institute of Sports Medicine
The propose of the present study was to research the effects of selenium deficient diet and training on the concentration of serum testosterone in male rats.The results showed: 1. The serum selenium content in selenium deficient diet rats was significantly lower than that in selenium sufficient diet rats. 2.In sedentary rats,the testis selenium content in seleniumm deficient diet group was significantly lower than that in selenium sufficient diet group.The decrease of the selenium content in testis was not so sharp as in serum.Training could increase the testis selenium content in selenium deficient diet rat.3.The concentrations of testosterone and free testosterone in serum were significantly decreased because of the selenium deficient diet and training.The decreases of androgens were not related to the concentrations of gonadotropins(rLH and rFSH) in serum and the LH/hCG receptor in Leydig cells.4.Selenium deficient diet and training did not change the concentration of corticosterone in serum.The decreases of the ratios of testosterone to corticosterone and free testosterone to corticosterone were mainly related to the decrease of the concentrations of testosterone and free testosterone in serum.
, 百拇医药
Key words: Selenium,Training,Testosterone,Corticosterone,Gonadotropin,LH/hCG receptor
睾酮是对运动起重要作用的一种激素，睾酮水平的降低会对运动产生一定的负面影响。长时间、大强度训练造成的睾酮水平降低，到一定程度就会出现一系列体能下降的疲劳反应，有人称之为“内分泌性疲劳”。硒作为人和动物体内的一种必需微量元素，具有重要的生理和生化功能。有研究表明，硒在睾丸中不仅与抗氧化和精子生成有关，还可能对甾体激素的合成分泌发挥重要作用[1]。本研究目的是建立硒缺乏动物模型，观察硒缺乏和运动训练对睾酮水平的影响。
1材料与方法
1.1 饲料配制
低硒饲料(硒含量0.010mg/kg饲料)的原料来自黑龙江省尚志市和齐齐哈尔市的克山病区，参考中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所的配方配制：小麦粉20%、玉米粉38%、黄豆粉25%、大米粉15%、混合盐1%、花生油1%、鱼肝油50mg/kg、维生素E 150mg/kg[2]。在低硒饲料中添加硒酸钠制成补硒饲料(硒含量0.186mg/kg饲料，在正常需要量范围内)。
, 百拇医药
1.2 动物分组
雄性成年Wistar大鼠40只，按体重随机分为4个组：①缺硒训练组(Se-Tr+)10只②缺硒安静组(Se-Tr-)10只③补硒训练组(Se+Tr+)10只④补硒安静组(Se+Tr-)10只。自由进水(自来水中硒未检出)，喂饲不同硒含量的饲料。训练组进行游泳训练，室温为25±2℃，每日光照时间为14小时。
1.3 训练方式
在大鼠流动水游泳池中进行游泳训练。水深为45～55cm，水温为30±1℃，水流量为4m3/小时。共训练7周，每周5天，训练时间从每天30分钟逐渐增加至60分钟。
1.4 样品收集
, 百拇医药
在最后一次训练结束60小时后，处死大鼠。取血，分离血清；取睾丸，用液氮冷冻。血清及睾丸样品置-70℃冰箱中保存待测。
1.5 测试指标
1.5.1 硒含量 用荧光法测定血清硒和睾丸硒含量[3]。
1.5.2 血清激素 用放射免疫分析法测定睾酮(T)、游离睾酮(FT)、皮质酮(rC)、黄体生成素(rLH)和卵泡刺激素(rFSH)。
1.5.3 LH/hCG受体分析[4]
1.5.3.1 睾丸组织细胞膜制备 取睾丸，去除被膜，按1∶5(W∶V)加入缓冲液进行匀浆，匀浆液1000×g离心10分钟，取上清液，17000×g离心30分钟，沉淀按1∶20(W∶V)加入缓冲液，用超声波混匀，制成膜受体制剂。整个操作过程在4℃中进行。
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1.5.3.2 放射受体分析 用饱和法，以125I-hCG(放射比活度为62.5μCi/μg)为配基。每管加入膜受体制剂100μl,125I_hCG(2-30×104cpm)100μl，非特异结合管中另加入hCG粗品100μl(200IU)，用缓冲液将各管体积补足至400μl。振荡混匀，置30℃水浴90分钟。加入分离剂，混匀后静置15分钟，2500×g离心15分钟，测定各管总放射性及沉淀放射性。用Woolf模型计算受体的解离常数(Kd)和最大结合量(Bmax)。
1.5.4 蛋白含量 用双缩脲法测定睾丸匀浆液的蛋白含量。
1.6 统计分析
数据用均值±标准差表示，进行双因素方差分析(ANOVA)，主要因素为硒和训练，当方差分析显示有显著性差异时，用Duncan's多范围比较法进行各组均值的比较，显著性差异水平α=0.05。
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2 结果
2.1 硒缺乏和训练对血清硒和睾丸硒含量的影响
无论是安静组或训练组，缺硒大鼠的血清硒含量明显低于相应的补硒大鼠。无论是缺硒组或补硒组，训练大鼠的血清硒含量与相应的安静大鼠相比，无明显差异(表1)。缺硒安静组的睾丸硒含量明显低于补硒安静组和缺硒训练组；而补硒安静组的睾丸硒含量与补硒训练组相比，无明显差异(表1)。
表1 硒缺乏和训练对血清硒和睾丸硒含量的影响
Table 1 Effects of selenium deficient diet and training on selenium content in serum and testis 组别
Groups
, 百拇医药 血清硒
Serum selenium
(μg/ml)
睾丸硒
Testis selenium
(μg/g.wet weight)
缺硒训练组
Se-Tr+
0.17±0.06(7)*
0.83±0.17(9)#
缺硒安静组
, http://www.100md.com
Se-Tr-
0.10±0.03(10)*
0.69±0.07(9)*
补硒训练组
Se+Tr+
0.57±0.11(10)
0.84±0.11(9)
补硒安静组
Se+Tr-
0.64±0.21(9)
, 百拇医药
0.86±0.09(9)
*:与相应的补硒组相比，有显著差异，p<0.05
Compared with selenium sufficient group,p<0.05
#:与相应的安静组相比，有显著差异，p<0.05
Compared with sedentary group,p<0.05
(括号中的数字为每组样品数)
(Number in bracket shows the samples for the group)
2.2 硒缺乏和训练对血清激素水平的影响
, http://www.100md.com
硒缺乏和训练对rLH、rFSH和rC的水平均无明显影响。缺硒安静组的T水平明显低于补硒安静组。训练使T水平降低，在补硒组有显著性差异。FT与T有相似的变化(表2)。缺硒安静组的T/rC比值明显低于补硒安静组。训练使T/rC比值降低，在补硒组有显著性差异。FT/rC与T/rC有相似的变化(表3)。
表2 硒缺乏和训练对血清激素水平的影响
Table 2 Effects of selenium deficient diet and training on hormone concentrations in serum 组别
Groups
黄体生成素
rLH(ng/ml)
卵泡刺激素
, 百拇医药
rFSH(ng/ml)
睾 酮
T(ng/dl)
游离睾酮
FT(pg/ml)
皮质酮
rC(ng/ml)
缺硒训练组
Se-Tr+
1.70±0.48(9)
9.59±6.66(7)
, http://www.100md.com 46.74±40.89(7)
1.96±2.00(8)
326.56±130.51(10)
缺硒安静组
Se-Tr-
1.95±0.52(10)
12.81±7.73(8)
71.79±61.41(10)*
2.67±2.76(9)*
338.26±150.10(10)
, 百拇医药 补硒训练组
Se+Tr+
1.64±0.57(9)
8.63±4.05(9)
41.85±25.29(8)#
1.50±1.42(8)#
269.95±119.08(10)
补硒安静组
Se+Tr-
1.58±0.40(9)
, 百拇医药 12.36±5.73(6)
212.29±170.14(9)
10.99±10.12(9)
313.71±163.20(10)
*:与相应的补硒组相比，有显著差异，p<0.05 Compared with selenium sufficient group,p<0.05
#:与相应的安静组相比，有显著差异，p<0.05 Compared with sedentary group,p<0.05
(括号中的数字为每组样品数) (Number in bracket shows the samples for the group)表3 硒缺乏和训练对血清激素比值的影响
, 百拇医药
Table 3 Effects of selenium deficient diet and training on T/rC and FT/rC in serum 组别
Groups
睾酮/皮质酮
T/rC(×10-3)
游离睾酮/皮质酮
FT/rC(×10-6)
缺硒训练组
Se-Tr+
1.06±0.60(7)
, 百拇医药
4.35±3.14(7)
缺硒安静组
Se-Tr-
2.28±1.60(10)*
9.60±8.38(9)*
补硒训练组
Se+Tr+
2.40±2.44(8)#
4.77±4.06(9)#
补硒安静组
, 百拇医药
Se+Tr-
6.80±7.09(8)
21.08±17.65(7)
*:与相应的补硒组相比，有显著差异，p<0.05
Compared with selenium sufficient group,p<0.05
#:与相应的安静组相比，有显著差异，p<0.05
Compared with sedentary group,p<0.05
(括号中的数字为每组样品数)
(Number in bracket shows the samples for the group)
, http://www.100md.com
2.3 硒缺乏和训练对睾丸LH/hCG受体的影响
硒缺乏和训练对LH/hCG受体的解离常数(Kd)和最大结合量(Bmax)均无明显影响(表4)。
表4 硒缺乏和训练对睾丸LH/hCG受体的影响
Table 4 Effects of selenium deficient diet and training on LH/hCG receptor in testis 组别
Groups
解离常数
Kd(pmol/l)
最大结合量
, 百拇医药
Bmax(fmol/mg pro)
缺硒训练组
Se-Tr+
52.99±35.27(8)
2.91±1.66(8)
缺硒安静组
Se-Tr-
57.76±31.46(8)
1.61±0.54(8)
补硒训练组
, 百拇医药
Se+Tr+
63.16±18.50(8)
2.15±0.73(8)
补硒安静组
Se+Tr-
48.74±24.99(8)
2.66±1.40(8)
(括号中的数字为每组样品数)
(Number in bracket shows the samples for the group)
, 百拇医药 3 讨论
硒营养是影响血清硒含量的重要因素。血清硒含量反映机体近期的硒营养状况，受硒摄入量的影响。用低硒饲料喂养的大鼠的血清硒含量明显低于用补硒饲料喂养的大鼠，表明硒缺乏动物模型的建立是成功的。
缺硒安静组的睾丸硒含量明显低于补硒安静组。Behne发现，缺硒大鼠睾丸中硒含量与对照组相比，无明显差异；而相应的血浆硒含量，缺硒组降低了79%[5]。我们结果与其相似，缺硒安静组的睾丸硒含量仅比补硒安静组降低20%，而血清硒含量却降低84%。我们还发现缺硒训练组的睾丸硒含量明量高于硒安静组，与补硒组水平相当，表明训练可使缺硒大鼠的睾丸硒需要量增加。这些结果支持Behne的观点，即体内存在硒优先供给睾丸等组织的调节机制，需要时会把硒从其它部位转移到睾丸中，以维持其正常的生理功能。
缺硒安静组的血清睾酮和游离睾酮水平明显低于补硒安静组，而且缺硒安静组的睾丸硒含量也明显低于补硒安静组，两组的促性腺激素(rLH和rFSH)水平均无明显差异。结果提示：睾丸硒含量的降低与睾酮水平的降低有一定的关系。Behne认为，除了在精子形成中起重要作用外，硒似乎与睾丸的其它功能也有关。用低硒饲料喂养5个月后，大鼠的血清睾酮水平低于用正常硒含量的饲料喂养的对照组，表明硒与睾丸Leydig细胞的甾体生成功能有关。而且这种关系并不表现在下丘脑-垂体环节，而是在睾丸本身，因为用LHRH刺激垂体释放LH和FSH，未发现缺硒组和对照组的LH水平的差异，但睾酮的分泌存在差异。给予LHRH 2小时后，用低硒饲料喂养170天的大鼠的血清睾酮水平的升幅低于用正常硒含量的饲料喂养的对照组。为了确定对睾酮生成影响的作用部位，直接用LH(以hCG形式)刺激睾丸，得到相似的结果，低硒组和对照组血清睾酮的升高有统计学上显著差异。结果表明，硒缺乏对睾丸Leydig细胞有影响，并提示硒在甾体生成上的生物学作用[1]。LH对睾丸Leydig细胞膜上的LH/hCG受体结合，通过第二信使cAMP，刺激睾酮合成。受体对激素的亲和性和受体的数目对LH发挥其作用均有影响。我们的结果并未发现缺硒大鼠睾丸的LH/hCG受体的解离常数(Kd)和最大结合量(Bmax)与补硒组有明显差异，表明硒缺乏造成的睾酮分泌减少的作用部位可能在受体后的环节，其作用机制尚不清楚。
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有研究表明，长期大强度训练能使血清睾酮水平降低。关于运动性低睾酮的机制，存在不同的解释，多数学者认为是睾丸本身的功能障碍所致。Adlercreutz对运动大鼠的研究发现，当血清的睾酮水平极度降低时，睾丸中的睾酮、雄烯二酮和孕酮水平也显著降低，而血清的LH水平无明显变化，表明血清睾酮水平降低是由于睾丸中产生睾酮量减少所致，睾丸中贮存的睾酮的排空和睾酮-LH反馈机制对此无明显作用[6]。Harkonen报道，对大鼠进行8周的跑台训练，未发现血清睾酮、皮质酮和LH水平的变化，睾丸LH/hCG受体的含量也未见变化[7]。我们的结果表明，经过7周的游泳训练，缺硒组和补硒组的血清睾酮和游离睾酮水平有不同程度的降低，rLH和rFSH水平却无明显变化，提示训练造成低睾酮的作用部位可能不在垂体而在睾丸，即由于睾丸本身的功能障碍所致。与Harkonen的结果相比，本实验采用的训练方式造成了大鼠的睾酮水平降低，但对LH/hCG受体的解离常数(Kd)和最大结合量(Bmax)仍无影响，提示其作用部位可能是在受体后的环节，这一点与硒缺乏造成的睾酮水平降低相似。
, 百拇医药
关于运动性低睾酮与糖皮质激素的关系，研究结果不尽相同。Roberts观察到，过度训练可使血清的睾酮降低，皮质酮升高，二者的变化呈高度负相关(R=-0.92)[8]。Vervoorn报道，6名高水平划船运动员经过9个月的大运动量训练后，血清游离睾酮/皮质酮比值下降了5%～50%[9]。Flynn报道，游泳训练的负荷增加，导致血清睾酮和游离睾酮水平降低，而皮质酮、睾酮/皮质酮和游离睾酮/皮质酮比值则变化不明显[10]。Steinacker发现，高负荷训练使划船运动员的血清游离睾酮降低，但皮质酮基本不变[11]。我们的结果发现，训练并未对血清皮质酮有明显影响，睾酮/皮质酮和游离睾酮/皮质酮比值的降低主要是因为睾酮和游离睾酮的降低而引起的。与此相类似，硒缺乏也不影响血清皮质酮水平，睾酮/皮质酮和游离睾酮/皮质酮比值的降低主要是因为睾酮和游离睾酮的降低而引起的。
4 小结
, http://www.100md.com 本研究通过对雄性大鼠进行7周不同硒营养的喂养，结合游泳训练，观察硒缺乏和训练对大鼠睾酮水平的影响，小结如下。
4.1 用低硒饲料喂养的大鼠血清硒含量明显低于用补硒饲料喂养的大鼠，表明硒缺乏动物模型的建立是成功的。
4.2 缺硒安静大鼠的睾丸硒含量低于补硒安静大鼠，但降低的幅度比血清硒降低的幅度小，训练使缺硒大鼠睾丸硒含量明显升高，表明体内存在硒优先供给睾丸等组织的调节机制，需要时会把硒从其它部位转移到睾丸中，以维持其正常的生理功能。
4.3 硒缺乏和游泳训练均可使血清睾酮和游离睾酮水平降低，这种降低与垂体促性腺激素(rLH和rFSH)水平无关，与睾丸Ldydig细胞膜上的LH/hCG受体的亲和性及结合容量无关。
4.4 硒缺乏和游泳训练均不影响血清皮质酮水平，睾酮/皮质酮和游离睾酮/皮质酮比值的降低，主要是因为睾酮和游离睾酮的降低而引起的。
, 百拇医药
* 本文为北京体育大学硕士学位论文，参加了第5届全国体育科学大会交流。
5 参考文献
[1]Behne D,et al.Selenium and hormones in the male reproductive system.Selenium in biology and medicine.Part B(Combs Jr.GF,et al.eds) 1987,pp 733,AVI New York.
[2]伊木清等.硒碘营养状态对大鼠甲状腺和大脑谷胱苷肽过氧化物酶活力的影响.营养学报.1996，18(1)：65.
[3]李茂忠等.微量荧光法测定血清、头发及奶粉中痕量硒.中国公共卫生学报.1991，10(5)：306.
[4]曹泽毅主编.激素受体及其临床应用(第1版).北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1993，pp131.
, 百拇医药
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[6]Adlercreutz H,et al.Effect of training on plasma anabolic and catabolic steroid hormones and their response during physical exercise.Int J Sports Med.1986,7:27 Supplement.
[7]Harkonen H,et al.Pituitary and gonadal function during physical exercise in the male rat.J Steroid Biochem.1990,35(1):127.
, http://www.100md.com
[8]Roberts AC,et al.Overstraining affects male reproductive status.Fertility and Sterility.1993,60:686.
[9]Vervoon C,et al.The behavior of the plasma free testosterone/cortisol ratio during a season of elite rowing training.Int J Sports Med 1991,12:257.
[10]Flynn MG,et al.Indices of training stress during competitive running and swimming seasons.Int J Sports Med 1994,15:261.
[11]Steinacker JM,et al.Metabolic and hormonal reaction during training in junior oarsman.Int J Sports Med 1993,14:s24.
[感谢美国国家糖尿病、消化系统和肾脏病研究所(NIDDK)惠赠大鼠rLH和rFSH检测试剂]
(第一作者：方子龙，男，34岁，助理研究员)
(1997.12.12收稿), 百拇医药